Manipulation génétique

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un remplacement génique efficace et fiable à l'aide de souches de type un et de type deux delta deux 80 de Toxoplasmic ndii. Cette approche est mise en œuvre en construisant d'abord une molécule d'ADN ciblée qui fusionne le marqueur sélectionnable HX GPRT en orientation directe entre des séquences flanquantes distinctes en 5' et en 3' provenant de l'ADN ciblé. La deuxième étape de la procédure consiste à transfecter la molécule d'ADN ciblée dans une souche de toxoplasme DYI de type un ou de type deux.

La troisième étape consiste à sélectionner patiemment les événements de recombinaison homologue à double crossing-over et à isoler des clones individuels. L'étape finale est de valider la présence de l'événement de ciblage génique dans les clones mutés isolés. En fin de compte, les résultats de cette procédure peuvent révéler la fonction des gènes parasitaires par l'analyse de knockouts ciblés, de remplacements géniques et de gènes marqueurs, grâce à diverses applications en aval.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes utilisant des souches de type sauvage de ce parasite est que les fonds génétiques de type un et de type deux du parasite delta deux 80 permettent désormais une sélection extrêmement fiable d'événements de recombinaison homologue à double brassage ciblé afin de produire des souches génétiquement définies de manière précise. Cette technique accélérera considérablement la découverte de nouvelles cibles pour les traitements médicamenteux par plasmas antitoxines et le développement de souches vaccinales atténuées sûres et efficaces, particulièrement lorsqu'elle est associée aux ressources génomiques bien conçues disponibles en ligne @toxodb.org. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés à concevoir des molécules d'ADN ciblées ou à effectuer des manipulations génétiques avec Toxoplasma gondii.

Cependant, la pratique clinique et la conception de molécules de ciblage fiables garantiront le succès. Commencez le protocole par l'amplification par PCR des extrémités cibles génomiques en cinq prime et en trois prime pour le gène d'intérêt à partir de l'ADN génomique. Ensuite, amplifiez par PCR le marqueur sélectionnable HX GPRT avec ses extrémités DHFR en cinq prime et en trois prime à partir du minicassette génique HX GPRT CD NA.

Utilisez la recombinaison chez la levure ou une méthode similaire pour fusionner les molécules d'ADN 3D dans leur orientation correcte de cinq prime à trois prime avec le plasmide PRS quatre 16, générant ainsi le plasmide p delta GOI qui ciblera la délétion du gène d'intérêt. Ensuite, préparez un échantillon de 100 microlitres contenant de 15 à 30 microgrammes de plasmide cible linéarisé pour la transfection dans T gia 68 à 72 heures après l'ensemencement d'un flacon de 25 centimètres carrés contenant des cellules HFF confluentes. Vérifiez la présence de parasites fraîchement lysés en confirmant visuellement que 90 à 95 % des cellules HFF ont été lysées ; des parasites viables sont essentiels pour le ciblage génique.

Agiter les parasites viables en solution en secouant vigoureusement le flacon fermé sans éclabousser de liquide sur l'intérieur du couvercle ou du col du flacon. Récolter les parasites du flacon et les préparer pour la transfection comme décrit dans le protocole écrit. Électroporer le plasmide ciblé dans la souche de toxoplasme delta CO 80.

Transférez le mélange électroporé dans un flacon de 150 centimètres contenant des cellules HFF confluentes et 30 millilitres de milieu d'infection. Incubez la culture infectée toute la nuit à 37 degrés Celsius, environ 20 heures après la transfection. Remplacez le milieu par le milieu de sélection MPA plus X.

Maintenant, laisser les parasites s'incuber à 37 degrés Celsius pendant environ huit jours, sans perturbation. Une fois les plaques visibles, agiter le flacon pour détacher les parasites extracellulaires de la monocouche, obtenant ainsi une solution de parasites. Transférer environ un demi-millilitre de la solution de parasites dans un nouveau flacon de 25 centimètres carrés contenant une couche confluente de cellules HFF et cinq millilitres de milieu de sélection MPA plus X.

Désignez cette culture comme PAs un A environ trois jours plus tard. Répétez le transfert de la moitié d’un millilitre de la solution de parasites du flacon d’origine vers un autre flacon de cellules HFF contenant le même milieu de sélection. Désignez cette culture comme PAs un B au cours des cinq jours suivants.

Surveiller les passages A et B pour les pfu. Sélectionner soit le passage A soit le passage B pour le sous-clonage en fonction d'un nombre adéquat de zones d'infection supérieur à 25. Chaque fois que les parasites lysent les cellules HFF, transférer la culture vers un nouveau flacon de 25 cm² contenant des cellules HFF confluentes, en milieu de sélection, trois semaines après la transfection. Sous-cloner les parasites fraîchement obtenus en diluant les parasites à la concentration appropriée dans le milieu MPA plus X, puis en répartissant uniformément la solution parasitaire dans une plaque de 96 puits contenant des cellules HFF confluentes.

Préparez une plaque à une concentration d'un parasite par puits et préparez une deuxième plaque à une concentration de deux parasites par puits. Incubez les deux plaques à 37 degrés Celsius après la date initiale de transfection. Ne sous-clonez pas les parasites avant le jour 20 pour les parasites de type un ou le jour 25 pour les parasites de type deux.

Continuer de repiquer le flacon de 25 centimètres selon un calendrier hebdomadaire, comme décrit dans le texte en ligne, jusqu'à ce que la souche d'invalidation génétique ait été validée. Après environ une semaine, examiner les plaques de 96 puits sous un grossissement de 40 à 60 x. Choisir uniquement les puits contenant une PFU unique, identifiée comme une zone unique d'infection, à l'aide d'une pipette réglée à 50 microlitres.

Mélangez le contenu de ces puits en dirigeant le flux de liquide au-dessus du PFU afin de disperser les parasites dans tout le puits. Quatre à cinq jours après le mélange des puits sélectionnés, choisissez une douzaine de clones présentant des cellules lysées. Transférez 12 clones depuis la plaque de 96 puits vers 12 puits d'une plaque de 24 puits. Pour ce faire, grattez avec la pointe d'une pipette le fond du puits et aspirez six microlitres.

Transférez la solution dans un puits d'une plaque 24 puits contenant des cellules HFF confluentes dans un millilitre de milieu MPA additionné de la sélection X. Incubez la plaque 24 puits à 37 degrés Celsius et surveillez la lyse des cellules HFF. Repiquez les parasites à partir d'un puits lysé de la plaque 24 puits selon un calendrier hebdomadaire.

Utilisez la technique de grattage et de prélèvement pour transférer deux microlitres de la solution de parasites vers une nouvelle plaque contenant du MPA et une sélection X. Après le passage, récoltez les parasites à partir du plateau d'origine en 24 puits et transférez-les dans de petits tubes pour la collecte d'ADN.

Enfin, utilisez la PCR pour vérifier la délétion du gène d'intérêt afin de contrôler l'intégration des régions cibles en amont (cinq prime) et en aval (trois prime). Et pour vérifier la présence du marqueur sélectionnable HX GPRT. Ce protocole concerne l'élimination du marqueur HX GPRT de la souche delta Q 80 modifiée et est décrit dans le texte en ligne.

P delta GOYC cible l'élimination de HX GPRT du parasite par sélection négative à l'aide de six milieux TX. Ensuite, la PCR est utilisée pour confirmer la perte de HX GPRT, indiquée par une bande de 1,2 paire de kilobases lorsque HX GPRT n'a pas été éliminé du locus. Il y a une bande de 3,4 paires de kilobases.

La dernière partie de ce protocole, le marquage en C-terminal des protéines, est également décrite en détail dans le texte en ligne. Après avoir suivi le protocole décrit pour réaliser une délétion ciblée d'un gène, une PCR a été utilisée afin de valider la délétion d'un gène inactivé de type un R 18, un gène généralement difficile à cibler. La PCR 1 montre l'absence du produit amplifié correspondant au gène R 18.

La PCR deux montre la présence de la séquence cible génomique en trois primes R 18. Les PCR trois et quatre montrent la présence du marqueur sélectionnable correctement intégré entre les séquences cibles génomiques en cinq primes et en trois primes, ce qui définit la délétion R 18. Afin de réutiliser le marqueur sélectionnable pour effectuer des délétions ultérieures dans une souche, il faut d'abord retirer le marqueur HX GPRT d'origine du locus. Après avoir suivi le protocole décrit.

L’HX GPRT a été supprimée du locus GRA deux supprimé dans la souche delta deux 80 delta GRA deux HX.G-P-R-T-P-C-R a été utilisé pour confirmer la perte de l’HX GPRT, indiquée par une bande de 1,2 kilobase. Lorsque l’H-X-G-P-R-T n’était pas supprimée, une bande de 3,4 kilobases était observée après l’étape initiale de ciblage génique. D'autres méthodes de ciblage génique peuvent être appliquées pour construire des délétions multiples dans une même souche de type un ou de type deux, ou pour marquer ou complémenter une souche mutante afin de répondre à d'autres questions, comme par exemple, où cette protéine se localise-t-elle dans la cellule ?

Ou quelle est la fonction ou l'activité clé de cette protéine ou voie qui explique sa fonction biologique ? Cette technique ouvre la voie aux chercheurs du domaine pour intensifier l'exploration de la fonction des gènes parasitaires dans le complexe modèle AP et dans le parasite Toxoplasma. Gandhi eye.

N'oubliez pas que le travail avec la toxoplasmose peut être dangereux et que des précautions, telles que le respect de toutes les directives de niveau de sécurité biologique 2, doivent être maintenues tout au long de la procédure.