Name: Manipulation génétique Δku80 Les souches pour lanalyse génomique fonctionnelle de Toxoplasma gondii (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Découvrez une méthode de remplacement génique ciblé dans Toxoplasma gondii utilisant les souches Δku80. Cette technique permet des manipulations génétiques précises pour l'analyse fonctionnelle des gènes parasites.

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<li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).</li>
<li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3%2C+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li>
<li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li>
<li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li>
<li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Pathog%22%5BJournal%5D)">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007(2011).</li>
<li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li>
<li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+tagging%2C+cloning%2C+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii%3A+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li>
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<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li>
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<li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ici nous fournissons un protocole de gène ciblage efficace dans Δ Ku80 souches de parasites afin de permettre la récupération efficace de la descendance génétiquement manipulés qui possèdent des suppressions ciblées de gènes, les remplacements de gènes et / ou de gènes marqués. L&#39;exécution séquentielle de ces méthodes permet une approche fiable pour l&#39;isolement de mutants de parasites qui contiennent des manipulations génétiques ciblées simples ou multiples 3.1. Alors que la génération d&#39;une délétion ciblée dépend de multiples facteurs, l&#39;utilisation de la souche Δ Ku80 avec la stratégie présentée et le protocole augmente considérablement l&#39;efficacité et la facilité de faire des souches mutantes définies précisément de T. gondii pour les études de génomique fonctionnelle. Le génome de T. gondii durant les stades asexués est haploïde. Ainsi, une étude à faire lors de la planification de supprimer un gène est que le gène ne doit pas être indispensable in vitro. Néanmoins, l&#39;efficacité de la targeTing KO gènes dans Ku80 souches Δ est extrêmement élevé, ce qui permet l&#39;isolement de souches mutantes avec des taux de réplication avec facultés affaiblies de manière significative. Si un gène ciblé est essentiel, parasites cessent souvent à reproduire lors de la sélection. Un autre facteur essentiel dans la manipulation génétique ciblée est que l&#39;homologie parfaite avec au moins 620 pb du flanc ciblage génomique est nécessaire pour obtenir des intégrations ciblées détectables 2. Régions plus d&#39;homologie produisent des rendements plus élevés du ciblage et de l&#39;aide ciblant les flancs d&#39;ADN d&#39;environ 1000 paires de bases est une méthode fiable et efficace 1-4. Pour cette raison, il est important que les flancs ciblant génomiques sont générées à partir de la même souche de T. gondii (RH, Pru) que la souche qui est génétiquement manipulée. Le manque d&#39;homologie suffisante peut souvent se traduire par l&#39;intégration ciblée d&#39;un flanc de ciblage génomique, mais pas l&#39;autre. Intégration incomplète ou défaut d&#39;obtenir une maîtrise de finaley soyez aussi en raison de la persistance épisomal. Immédiatement après transfection, toutes les molécules de ciblage sont non intégrés qu&#39;épisomes, et parfois molécules ciblant peut persister tant qu&#39;épisomes pour de nombreuses générations. Utilisation de flancs d&#39;ADN cible d&#39;environ 1 kpb et de continuer à faire passer les parasites sous sélection avant ré-sous-clonage a souvent des problèmes liés à la persistance épisomique. Une fois un coup de grâce est validée et le marqueur HXGPRT est enlevé, la stratégie de ciblage de gène peut être répété sur une deuxième GOI pour générer de multiples suppressions de gènes dans une souche de parasite unique 1-3. La génération des suppressions, des remplacements ou des gènes marqués peut également être réalisé en utilisant différents marqueurs sélectionnables (bléomycine, CAT, pyriméthamine résistant DHFR, etc.) Bien que le CAT marqueur de sélection est actuellement présent dans le type II Δ Ku80 Pru génome 1, ce marqueur peut être enlevé en utilisant le HXGPRT </em&gt; protocole de sélection décrites ici. Dans nos mains, la sélection HXGPRT est le plus sûr et le marqueur le plus efficace avec l&#39;efficacité du ciblage le plus élevé où une seule copie insertion ciblée est suffisante pour la sélection robuste MPA + X moyenne. HXGPRT fournit également la seule approche actuellement utile pour la suppression ciblée d&#39;un marqueur de sélection (figure 3) à l&#39;aide de 6 thioxanthine (6TX) 2,3 sélection. Ainsi, ce protocole constitue la seule approche actuelle pour le développement de souches mutantes définis avec plusieurs manipulations génétiques ciblées. Ce protocole fournit une méthode utile et efficace pour la manipulation génétique ciblée dans Δ Ku80 souches de Toxoplasma gondii et est applicable à l&#39;analyse d&#39;un seul gène, une famille de gènes, ou des études de génomique fonctionnelle du génome entier. Avant la disponibilité de Δ Ku80 souches 1,2, ces approches ne sont pas largement faisable en raison de l&#39;INEFficiency de ces méthodes. Par conséquent, ce protocole est largement applicable pour la manipulation génétique ciblée de Toxoplasma gondii et est accessible à tous les chercheurs intéressés à relever un certain nombre de questions sur la biologie du parasite, la réponse de l&#39;hôte, et la génomique fonctionnelle.

Toxoplasma gondii est un parasite obligatoire de protozoaire intracellulaire commun que fréquemment et infecte chroniquement un large éventail d&#39;animaux et les humains 5. On estime que plus de 1 milliard d&#39;êtres humains sont actuellement et chroniquement infectés par ce pathogène. En plus de l&#39;importance de la maladie causée par T. gondii infection, la disponibilité croissante des outils expérimentaux, les ressources génomiques puissantes 6, la facilité de croissance in vitro et d&#39;excellents modèles de souris ont fait T. gondii un système modèle de premier plan pour l&#39;étude plus large de pathogènes eucaryotes intracellulaires et d&#39;autres parasites apicomplexes importants qui causent des maladies dévastatrices comme le paludisme (Plasmodium sp.) et la cryptosporidiose (Cryptosporidium) 5,7. Une limitation importante de Toxoplasma gondii comme un organisme modèle a été la récupération inefficace des descendants qui transportent ciblé manipulations génétiques. Ce problem en ciblage génique est due à une faible fréquence de recombinaison homologue par rapport à la très haute fréquence de recombinaison non homologue dans les souches de type sauvage de T. gondii, même quand une homologie de l&#39;ADN est prévu dans des molécules cibles d&#39;ADN utilisées dans les études génétiques 2. Nous avons récemment génétiquement bloqué la principale voie de recombinaison non homologue de type I et souches de Toxoplasma gondii de type II par la suppression du gène codant pour la protéine de 1,2 Ku80. Le type résultant I et Ku80 souches Δ type II présentent des taux de croissance normale, la taille et le comportement à la fois in vitro et in vivo au cours de tachyzoite et étapes bradyzoïte in vitro et in vivo, cependant, ces souches présentent essentiellement une fréquence de 100% de la recombinaison homologue et cette phénotype augmente la probabilité d&#39;isoler rapidement la progéniture désirée de manipulations génétiques ciblées par plusieurs centaines à plusieurs thoUSand fois 1,2,4. À l&#39;échelle communautaire utilisation récente de type I et de type II souches Δ Ku80 a considérablement intensifié le rythme, la variété, ainsi que le taux de réussite des approches génétiques ciblées dans T. gondii 1-4,8-13. Nous décrivons ici un protocole complet pour la suppression ciblée des gènes, le remplacement d&#39;un gène, et le marquage des gènes dans Δ Ku80 souches de T. gondii. Nous démontrons comment concevoir et cibler de manière fiable les manipulations génétiques à des gènes spécifiques ou loci génétiques dans Δ Ku80 souches de Toxoplasma gondii.

<table><tbody><tr><td>Amorces de chevauchement</td> Technologies <td></td><td>d’ADN intégrées</td><td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td></tr><tr><td>Validation Amorces</td><td>intégrées Technologies</td><td></td> d’ADN intégrées <td>100 nmole DNA Oligo</td></tr><tr><td>Yeast Strain #90845</td><td>ATCC</td><td></td><td>Designation FY834</td></tr><tr><td>Shuttle Vector pRS416</td><td>ATCC</td><td>87521</td><td></td></tr><tr><td>DH10B E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>12033-015</td><td>Bouillon SOC en kit avec E. coli</td></tr><tr><td>Resuspension</td><td>Buffer Qiagen</td><td></td><td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep</td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-BG05</td><td>0,5 mm Lavage à l’acide</td></tr><tr><td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur BTX600</td> à 2 mm d’écart <td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>25 cm2 Flacon à bouchon incliné</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Flacon à bouchon à col incliné</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>Cellules de fibroblastes du prépuce humain (HFF) Porte-filtre</td><td>ATCC</td><td>SCRC1041</td><td></td></tr><tr><td>Swin-lok</td><td>Whatman</td><td>420200</td> Membrane de <td>25 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Membrane</td><td>nucléopore gravée sur piste 110612Membrane gravée sur traces de 3 mm, diamètre de 25 mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide mycophénolique (MPA)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xanthine (X)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plateau de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plateau de culture tissulaire à 24 puits</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle Media</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>12-611F</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycotique (anti-anti)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Colonne</td> de <td>centrage Labs</td><td>PAE-100</td><td>Easy Clean Kit de centrifugation d’extraction d’ADN</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-thioxanthine</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue DNA Minikit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td></tr><tr><td>Milieu de congélation/récupération de culture cellulaire</td><td>Gibco</td><td>126-48-010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30028,02</td><td>moins calcium, moins magensium</td></tr></tbody></table>

manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; toxoplasma gondii</em

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Manipulation génétique ciblée utilisant la recombinaison homologue est la méthode de choix pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle pour obtenir une vue détaillée de la fonction des gènes et le phénotype (s). Le développement de souches mutantes présentant des délétions ciblées de gènes, les mutations ciblées, la fonction des gènes complété et / ou des gènes marqués fournit de puissantes stratégies pour aborder la fonction des gènes, en particulier si ces manipulations génétiques peuvent être ciblées efficacement pour le locus du gène d&#39;intérêt en utilisant la médiation d&#39;intégration en double traverser la recombinaison homologue. En raison des taux très élevés de recombinaison non homologue, l&#39;analyse génomique fonctionnelle de Toxoplasma gondii a été précédemment limitée par l&#39;absence de méthodes efficaces pour cibler la délétion de gènes et les remplacements de gènes de loci génétiques spécifiques. Récemment, nous avons aboli la principale voie de recombinaison non homologue de type I et souches de T. type II gondii en supprimant le gène encoding le 1,2 de protéine Ku80. Les souches Δku80 se comportent normalement pendant tachyzoite (aiguë) et bradyzoïte (chronique) Cycle in vitro et in vivo et présentent essentiellement une fréquence de 100% de la recombinaison homologue. Les souches Ku80 Δ font des études génomiques fonctionnelles faisable sur le gène unique ainsi que sur l&#39;échelle du génome 1-4. Ici, nous rapportons méthodes d&#39;utilisation de type I et de type II souches Δku80Δhxgprt d&#39;avancer méthodes de ciblage de gènes dans T. gondii. Nous présentons des méthodes efficaces pour engendrer des délétions de gènes, les remplacements de gènes, et les gènes marqués par insertion ciblée ou la suppression de la phosphoribosyltransferase (HXGPRT) marqueur de sélection hypoxanthine-xanthine-guanine. Le gène décrit le ciblage protocole peut être utilisé dans une variété de façons Δku80 souches pour faire avancer l&#39;analyse fonctionnelle du génome du parasite et de développer des souches uniques qui portentmultiple ciblé manipulations génétiques. L&#39;application de cette méthode génétique et tests phénotypiques suivantes révélera des aspects fondamentaux et unique de la biologie de T. gondii et des agents pathogènes humains importants liés qui causent le paludisme (Plasmodium sp.) et la cryptosporidiose (Cryptosporidium).

Un modèle détaillé est prévu pour la construction d&#39;un plasmide de criblage pour supprimer un gène, comprenant la mise en place des sites d&#39;enzymes de restriction et de la génération des amorces qui facilitent le ciblage génétique et la validation de ciblage de gène, ainsi que la construction plasmidique de la suppression subséquente de HXGPRT dans un processus en une seule étape (Figures 1A-C, Figure 2A, figure 3A). Un schéma général est présenté pour faire une délétion du gène ciblé (figure 2A), les paires d&#39;amorces utilisées pour valider la suppression d&#39;un coup de grâce, par exemple, de type I rop18 (figure 2B), et des résultats représentatifs de la validation PCR sont représentées (figure 2C). Ce résultat représentatif est présenté pour illustrer l&#39;éventail des résultats qui peuvent être obtenus à des loci génétiques qui sont relativement difficiles à cibler. Une délétion de gène ciblé avec succès se traduira par l&#39;absence du gène de l&#39;enintérêt produit PCR (PCR 1), la présence de l&#39;extrémité 3 &#39;flanc ciblage génomique (PCR2), et la présence du marqueur sélectionnable HXGPRT correctement intégrée entre l&#39;extrémité 5&#39; et les flancs de ciblage génomique 3 &#39;qui définissent la suppression (PCR3 et PCR4) . Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9, et 11 sont validés délétion de gènes ciblés (KO) où HXGPRT a remplacé le GOI (figure 2C). Un clone qui ne contient pas une délétion du gène peut être représentée par une série de profils de bandes. Typiquement, un clone sans délétion du gène reflétera la souche parentale (modèle parental) avec des bandes observées pour PCR1 et PCR2, mais pas pour PCR3 ou PCR4 comme on le voit pour les clones 1 et 2 (figure 2C). Ce &quot;modèle parental&quot; se pose de quelques mécanismes potentiels. De temps en temps, MPA parasites résistants sélectionnés portent qu&#39;épisomes persistant non intégrés de la pΔGOI ciblant plasmide, et nous notons que la sélection continue oblige souvent ces qu&#39;épisomesà intégrer. On observe également un certain arrière-plan rare dans le type I Δ Ku80 déformation en raison de l&#39;intégration involontaire du pΔGOI ciblage plasmide, qui contient un ADNc HXGPRT exprimée par DHFR 5 &#39;et 3&#39; des éléments promoteurs, soit dans le locus DHFR ou dans l&#39;HXGPRT partiellement délété locus 14. Bien que cet événement rare est une intégration ciblée, ce n&#39;était pas l&#39;intégration prévue et sert de point clé à retenir dans la conception de toute stratégie de remplacement de gènes. ADN homologie supérieure à 120 pb effectuées sur votre pΔGOI ciblage plasmide peut fournir un site alternatif pour la recombinaison dans Ku80 souches Δ 2 qui pourrait redonner un fond indésirable. En Pru souche de type II Δ Ku80 ce contexte est réduit ou inexistant par rapport au type I parce que le marqueur de sélection HXGPRT est basée sur le type I séquences qui ont polymorphismes d&#39;un nucléotide par rapport à l&#39;ADN de type II quidiminue fortement ce fond rare dans les expériences utilisant le type II Pru Δ Ku80 souche 1. Si un locus du gène est essentiel (ne peut pas être supprimé), ou a un gène extrêmement faible ciblage fréquence au niveau du locus, ou s&#39;il persiste [non intégrés] qu&#39;épisomes ne sont pas facilement éliminés par la croissance et de la sélection, ce modèle parental va dominer la tendance observée dans le MPA clones résistants. Sinon, la molécule d&#39;ADN de ciblage est parfois observée à intégrer à seulement 5 &#39;ou 3&#39; flanc ciblage génomique et une bande est observée pour les deux PCR3 ou PCR4 (mais pas les deux) avec PCR1 et PCR2 comme on le voit pour le clone 10 (5 &#39;intégration) et clone 7 (3&#39; intégration) (figure 2C). Ces modèles suggèrent l&#39;apparition fréquente d&#39;une seule croix sur l&#39;intégration de la cible plasmide au niveau du locus qui intègre HXGPRT mais cette intégration ciblée ne supprime pas le gène d&#39;intérêt. Ce modèle (lignes 7 et 10 de la figure 2C) emphasizes la nécessité de communiquer des données de PCR pour vérifier que l&#39;intégration ciblée s&#39;est produite au lieu d&#39;un seul croisement homologue dessus et une seconde intégration non homologue de la molécule de ciblage. Rarement, on observe un mélange génétique représentée par le clone 12 (figure 2C) qui représente à la fois un modèle parental et un motif de suppression ciblée. Cette tendance résulte probablement à l&#39;occasion de deux génotypes parasitaires qui sont présents au même endroit dans un clonage bien. Un schéma général pour la suppression des HXGPRT de Δ ku80Δgoi :: HXGPRT supprimer HXGPRT de la souche est affichée (figure 3A). La paire d&#39;amorces utilisé pour valider la suppression de HXGPRT de Δ Δ Ku80 GRA2 :: HXGPRT (figure 3B) amplifie une bande de Kbp unique de ~ 1,2 à PCR5 comme on le voit dans les clones 4, 7, 9, 11 et 12 (figure 3C). Si HXGPRT n&#39;est pas retiré de l&#39;locus, a ~ 3.4 bandes Kbp est observée (clones 1, 2, 3, 6, 8, 10, et le contrôle parental). Plusieurs mécanismes agissent pour rendre le retrait de HXGPRT (6TX sélection) plus difficile et moins efficace que l&#39;intégration des HXGPRT (MPA + X sélection). Sélection MPA est tout simplement plus efficace que 6TX sélection 14,16. En outre, la hausse des niveaux d&#39;expression HXGPRT sont nécessaires pour la sélection 6TX que pour les AMP sélections 16,24. En conséquence, les mutations qui peuvent réduire l&#39;activité enzymatique HXGPRT ou mutations ou les changements épigénétiques qui réduisent le niveau d&#39;expression de HXGPRT au locus d&#39;un gène peuvent potentiellement abolir l&#39;efficacité de la sélection 6TX. Même avec ces problèmes de sélection 6TX, le taux de réussite de la sélection des souches 6TX Ku80 Δ est supérieur à 90% à la première tentative 1-3. Un schéma général pour le marquage C-terminal direct de gènes codant pour des protéines est affichée (Figure 4). Cettesystème utilise une intégration directe via un double croix sur la recombinaison homologue de HXGPRT 3 &#39;du gène marqués et emploie également des stratégies de validation similaires à celles décrites ci-dessus. Quand un gène est soupçonné d&#39;être un gène essentiel ceci peut être vérifié à l&#39;aide d&#39;une deuxième transfection avec un ciblage de l&#39;ADN isolé indépendamment plasmide. D&#39;autres méthodes, comme les systèmes d&#39;expression de gène régulé, sont disponibles pour vérifier davantage si un gène est essentiel 25. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la conception d&#39;un ciblage de l&#39;ADN plasmidique. Une. Schématique de la conception chevauchent amorces utilisées pour amplifier par PCR la région 5 &#39;et 3&#39; des flancs de cibles avec 33 pb pour chevauche le vecteur pRS416 de navette et HXGPRT cassette minigène. Amorces décrites dans le schéma ont étéutilisé pour générer en 5 &#39;et 3&#39; des flancs de cibles de pΔROP18 10. B. stratégie globale pour la conception d&#39;une molécule d&#39;ADN de ciblage. L&#39;épine dorsale de pΔGOI est le vecteur pRS416 navette contenant de l&#39;uracile (URA) et l&#39;ampicilline (AMP) marqueurs sélectionnables. Placée dans pRS416 est une ~ 1 kpb 5 &#39;ADN flanc cible amplifié à partir d&#39;ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT et pRS416 utilisant les amorces F1 et R1, a ~ 1 kpb 3&#39; ADN flanc cible est amplifiée à partir d&#39;ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT pRS416 et en utilisant les amorces F2 et R2 et la cassette d&#39;minigène HXGPRT. Les sites de digestion par des enzymes de restriction uniques suivants sont ajoutés aux amorces: RE.X (l&#39;enzyme de restriction site de coupure X) dans l&#39;amorce F1 à couper le plasmide à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;extrémité 5&#39; ADN flanc cible, dans le R2 RE.Y amorce à couper le plasmide à «la fin de la 3 &#39;du 3 ADN flanc cible et RE.Z dans les amorces R1 et F2 pour exciser le HXGPRT minLes séquences des amorces de cassettes de igene. C. utilisées pour générer la construction de ciblage pour la suppression de rop18. Les régions gras correspondent à T. la séquence génomique de Toxoplasma, et les régions non gras correspondent aux sites d&#39;enzymes de restriction et des séquences qui se chevauchent avec pRS416 et la cassette de minigène HXGPRT. La paire d&#39;amorces HX_F et HX_R amplifie le HXGPRT cassettes mini-gène 14. Primaires lus de 5 &#39;à 3&#39;. Tableau adapté de Fentress et al 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figure 2. Présentation du protocole pour la suppression d&#39;un gène à l&#39;aide HXGPRT. Une. Disruption d&#39;un GOI dans la souche Δ ku80Δhxgprt par un double croisement homologue d&#39;événement de recombinaison avec une ~ 1 kpb 5 &#39;ADN flanc de la cible et une ~ 1 kpb 3&#39; ADN cible sur le flanc pΔGOI plasmide. Une stratégie PCR en utilisant PCR1, PCR2, PCR3 et PCR4 (pas à l&#39;échelle) est démontré que permet la vérification du génotype de valider clones avec l&#39;intégration ciblée de HXGPRT et la suppression du locus GOI. B. paires d&#39;amorces de représentation destiné à valider la suppression de rop18 . ROP18_DF et ROP18_DR amplifient PCR1, ROP18_ExF et ROP18_CxR amplifient PCR2, ROP18_CxF et DHFR_CxR amplifient PCR3 et DHFR_CxF et ROP18_CxR amplifier PCR4 (voir figure 2A). Primaires lus de 5 &#39;à 3&#39;. Tableau adapté de Fentress et al 10. C. Les résultats représentatifs de la validation d&#39;une délétion du gène ciblé (rop18) en utilisant HXGPRT. Après la transfection d&#39;un plasmide pΔROP18 dans Δ ku80Δhxgprt et la sélection dans MPA +X, MPA + X clones résistants ont été testés pour la suppression de rop18. Le contrôle de la souche parentale est positif pour PCR 1 (~ 400 pb) et PCR 2 (~ 650 pb) produit et négatifs pour PCR 3 (~ 1200 pb) et PCR 4 (~ 1300 pb) produit. Un knock-out GOI ciblée est positif pour les produits PCR2, pCR3 et PCR4 et est négatif pour le 1er produit de PCR (voir figure 2A). Indiqués sont des panneaux représentatifs des résultats de PCR1 et PCR2 (panneau supérieur), pCR3 (panneau du milieu), et PCR4 (panneau du bas). Les clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 et 11 présentent le profil de bandes correcte de PCR 1, PCR2, et PCR3 PCR4 qui définit un événement de suppression d&#39;un gène ciblé dans le clone. Les clones 1, 2, 7, 10 et 12 ne sont pas la délétion de gènes, et correspondent à d&#39;autres résultats représentatifs potentiels. (C = souche de contrôle parental Δ ku80Δhxgprt, M = marqueurs de taille). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figure 3. Présentation du protocole de re-ciblage du gène d&#39;intérêt à supprimer HXGPRT. A. La stratégie pour l&#39;élimination du marqueur sélectionnable HXGPRT par un double croisement homologue d&#39;événements de recombinaison dans la souche Δ ku80Δgoi :: HXGPRT utilisant une ~ 1 kpb 5 &#39;ADN flanc de la cible et une ~ 1 kpb 3&#39; ADN flanc cible sur pΔGOIc plasmide. La stratégie PCR pour la vérification du génotype est représenté en utilisant une paire d&#39;amorces pour doser un produit de PCR (PCR5) qui s&#39;étend sur la suppression (et non à l&#39;échelle). B. Une paire d&#39;amorces représentant conçu pour valider l&#39;élimination du marqueur sélectionnable HXGPRT du GRA2 lieu dans la souche Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primaires GRA2 _CLF et GRA2_CxR amplifient PCR5. Primaires<html> lire à partir de 5 &#39;à 3&#39; panneau C. représentatif. des clones 6TX résistants qui peuvent être obtenus suite à la transfection de plasmide dans pΔGOIc Δ ku80Δgoi :: HXGPRT et la sélection dans 6TX. Les clones 4, 7, 9, 11 et 12 présentent le profil de bandes de PCR5 correcte qui correspond à la délétion ciblée du marqueur HXGPRT (~ 1,2 kpb produit qui s&#39;étend sur «flanc avec léger recouvrement avec l&#39;extrémité 5 &#39;du flanc 3 et l&#39;extérieur de l&#39;extrémité 3&#39; flanc). Les clones 1, 2, 3, 6, 8 et 10 (cette bande est la lumière) représentent le motif de bandes attendue de l&#39;ordre de ~ 3,4 kbp qui correspond au génotype de clone parental, même si ces clones présentaient un degré de résistance au 6TX qui ont permis leur choix (ce phénotype peut parfois survenir spontanément par l&#39;arrêt de l&#39;expression HXGPRT (voir la note dans le protocole 2.1 (étape 8) et l&#39;article Résultats de représentant). (c = contrainte de contrôle parental Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = marqueurs de taille).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figure 4. Conception d&#39;une molécule d&#39;ADN de ciblage pour marquer l&#39;extrémité C-terminale d&#39;une protéine. Cette stratégie repose sur la capacité du marqueur HXGPRT à fonctionner aussi comme région de régulation en aval 3 &#39;. L&#39;épine dorsale de pΔGOItag est le vecteur pRS416 navette contenant l&#39;uracile (URA) et l&#39;ampicilline (AMP) marqueurs sélectionnables. Placée dans pRS416 est une ~ 1 kpb 5 &#39;ADN flanc cible amplifié à partir d&#39;ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT et pRS416 utilisant le FGOI et rtag amorces, une ~ 1 kpb 3&#39; ADN flanc cible est amplifiée à partir d&#39;ADN génomique avec chevauchement pour la cassette mini-gène HXGPRT et pRS416 utilisant le F2 et R2amorces et la cassette mini-gène HXGPRT. L&#39;ADN 5 &#39;flanc cible remplace le codon de terminaison de l&#39;étiquette (HA, Myc, His, etc), suivi par un codon de terminaison de remplacement. AMP + X sélection intègre le tag C-terminal et un HXGPRT aval, et déplace la 3 &#39;UTR d&#39;une position à la suite du marqueur HXGPRT. Les sites de digestion par des enzymes de restriction uniques suivants sont ajoutés aux amorces: RE.X (l&#39;enzyme de restriction site de coupure X) dans la couche de fond FGOI pour couper le plasmide à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;extrémité 5&#39; ADN flanc cible, et dans le RE.Y R2 apprêt à couper le plasmide à «la fin de la 3 &#39;du 3 ADN flanc cible, et RE.Z dans le rtag et amorces F2 pour exciser la cassette mini-gène HXGPRT pour une utilisation pour la construction du plasmide de re-cibler le locus du gène marqués à supprimer le marqueur HXGPRT qui rétablira le placement de la 3 &#39;UTR.

Nous rapportons ici une méthode d&#39;utilisation de type I et de type II<em&gt; Δku80</em&gt; Souches de<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Pour générer efficacement des suppressions de gènes ciblés et les remplacements de gènes pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle.

Manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; Les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser un remplacement génique efficace et fiable à l'aide de souches de type un et de type deux delta deux 80 de Toxoplasmic ndii. Cette approche est mise en œuvre en construisant d'abord une molécule d'ADN ciblée qui fusionne le marqueur sélectionnable HX GPRT en orientation directe entre des séquences flanquantes distinctes en 5' et en 3' provenant de l'ADN ciblé. La deuxième étape de la procédure consiste à transfecter la molécule d'ADN ciblée dans une souche de toxoplasme DYI de type un ou de type deux.La troisième étape consiste à sélectionner patiemment les événements de recombinaison homologue à double crossing-over et à isoler des clones individuels. L'étape finale est de valider la présence de l'événement de ciblage génique dans les clones mutés isolés. En fin de compte, les résultats de cette procédure peuvent révéler la fonction des gènes parasitaires par l'analyse de knockouts ciblés, de remplacements géniques et de gènes marqueurs, grâce à diverses applications en aval.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes utilisant des souches de type sauvage de ce parasite est que les fonds génétiques de type un et de type deux du parasite delta deux 80 permettent désormais une sélection extrêmement fiable d'événements de recombinaison homologue à double brassage ciblé afin de produire des souches génétiquement définies de manière précise. Cette technique accélérera considérablement la découverte de nouvelles cibles pour les traitements médicamenteux par plasmas antitoxines et le développement de souches vaccinales atténuées sûres et efficaces, particulièrement lorsqu'elle est associée aux ressources génomiques bien conçues disponibles en ligne @toxodb.org. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés à concevoir des molécules d'ADN ciblées ou à effectuer des manipulations génétiques avec Toxoplasma gondii.Cependant, la pratique clinique et la conception de molécules de ciblage fiables garantiront le succès. Commencez le protocole par l'amplification par PCR des extrémités cibles génomiques en cinq prime et en trois prime pour le gène d'intérêt à partir de l'ADN génomique. Ensuite, amplifiez par PCR le marqueur sélectionnable HX GPRT avec ses extrémités DHFR en cinq prime et en trois prime à partir du minicassette génique HX GPRT CD NA.Utilisez la recombinaison chez la levure ou une méthode similaire pour fusionner les molécules d'ADN 3D dans leur orientation correcte de cinq prime à trois prime avec le plasmide PRS quatre 16, générant ainsi le plasmide p delta GOI qui ciblera la délétion du gène d'intérêt. Ensuite, préparez un échantillon de 100 microlitres contenant de 15 à 30 microgrammes de plasmide cible linéarisé pour la transfection dans T gia 68 à 72 heures après l'ensemencement d'un flacon de 25 centimètres carrés contenant des cellules HFF confluentes. Vérifiez la présence de parasites fraîchement lysés en confirmant visuellement que 90 à 95 % des cellules HFF ont été lysées ; des parasites viables sont essentiels pour le ciblage génique.Agiter les parasites viables en solution en secouant vigoureusement le flacon fermé sans éclabousser de liquide sur l'intérieur du couvercle ou du col du flacon. Récolter les parasites du flacon et les préparer pour la transfection comme décrit dans le protocole écrit. Électroporer le plasmide ciblé dans la souche de toxoplasme delta CO 80.Transférez le mélange électroporé dans un flacon de 150 centimètres contenant des cellules HFF confluentes et 30 millilitres de milieu d'infection. Incubez la culture infectée toute la nuit à 37 degrés Celsius, environ 20 heures après la transfection. Remplacez le milieu par le milieu de sélection MPA plus X.Maintenant, laisser les parasites s'incuber à 37 degrés Celsius pendant environ huit jours, sans perturbation. Une fois les plaques visibles, agiter le flacon pour détacher les parasites extracellulaires de la monocouche, obtenant ainsi une solution de parasites. Transférer environ un demi-millilitre de la solution de parasites dans un nouveau flacon de 25 centimètres carrés contenant une couche confluente de cellules HFF et cinq millilitres de milieu de sélection MPA plus X.Désignez cette culture comme PAs un A environ trois jours plus tard. Répétez le transfert de la moitié d’un millilitre de la solution de parasites du flacon d’origine vers un autre flacon de cellules HFF contenant le même milieu de sélection. Désignez cette culture comme PAs un B au cours des cinq jours suivants.Surveiller les passages A et B pour les pfu. Sélectionner soit le passage A soit le passage B pour le sous-clonage en fonction d'un nombre adéquat de zones d'infection supérieur à 25. Chaque fois que les parasites lysent les cellules HFF, transférer la culture vers un nouveau flacon de 25 cm² contenant des cellules HFF confluentes, en milieu de sélection, trois semaines après la transfection. Sous-cloner les parasites fraîchement obtenus en diluant les parasites à la concentration appropriée dans le milieu MPA plus X, puis en répartissant uniformément la solution parasitaire dans une plaque de 96 puits contenant des cellules HFF confluentes.Préparez une plaque à une concentration d'un parasite par puits et préparez une deuxième plaque à une concentration de deux parasites par puits. Incubez les deux plaques à 37 degrés Celsius après la date initiale de transfection. Ne sous-clonez pas les parasites avant le jour 20 pour les parasites de type un ou le jour 25 pour les parasites de type deux.Continuer de repiquer le flacon de 25 centimètres selon un calendrier hebdomadaire, comme décrit dans le texte en ligne, jusqu'à ce que la souche d'invalidation génétique ait été validée. Après environ une semaine, examiner les plaques de 96 puits sous un grossissement de 40 à 60 x. Choisir uniquement les puits contenant une PFU unique, identifiée comme une zone unique d'infection, à l'aide d'une pipette réglée à 50 microlitres.Mélangez le contenu de ces puits en dirigeant le flux de liquide au-dessus du PFU afin de disperser les parasites dans tout le puits. Quatre à cinq jours après le mélange des puits sélectionnés, choisissez une douzaine de clones présentant des cellules lysées. Transférez 12 clones depuis la plaque de 96 puits vers 12 puits d'une plaque de 24 puits. Pour ce faire, grattez avec la pointe d'une pipette le fond du puits et aspirez six microlitres.Transférez la solution dans un puits d'une plaque 24 puits contenant des cellules HFF confluentes dans un millilitre de milieu MPA additionné de la sélection X. Incubez la plaque 24 puits à 37 degrés Celsius et surveillez la lyse des cellules HFF. Repiquez les parasites à partir d'un puits lysé de la plaque 24 puits selon un calendrier hebdomadaire.Utilisez la technique de grattage et de prélèvement pour transférer deux microlitres de la solution de parasites vers une nouvelle plaque contenant du MPA et une sélection X. Après le passage, récoltez les parasites à partir du plateau d'origine en 24 puits et transférez-les dans de petits tubes pour la collecte d'ADN.Enfin, utilisez la PCR pour vérifier la délétion du gène d'intérêt afin de contrôler l'intégration des régions cibles en amont (cinq prime) et en aval (trois prime). Et pour vérifier la présence du marqueur sélectionnable HX GPRT. Ce protocole concerne l'élimination du marqueur HX GPRT de la souche delta Q 80 modifiée et est décrit dans le texte en ligne.P delta GOYC cible l'élimination de HX GPRT du parasite par sélection négative à l'aide de six milieux TX. Ensuite, la PCR est utilisée pour confirmer la perte de HX GPRT, indiquée par une bande de 1,2 paire de kilobases lorsque HX GPRT n'a pas été éliminé du locus. Il y a une bande de 3,4 paires de kilobases.La dernière partie de ce protocole, le marquage en C-terminal des protéines, est également décrite en détail dans le texte en ligne. Après avoir suivi le protocole décrit pour réaliser une délétion ciblée d'un gène, une PCR a été utilisée afin de valider la délétion d'un gène inactivé de type un R 18, un gène généralement difficile à cibler. La PCR 1 montre l'absence du produit amplifié correspondant au gène R 18.La PCR deux montre la présence de la séquence cible génomique en trois primes R 18. Les PCR trois et quatre montrent la présence du marqueur sélectionnable correctement intégré entre les séquences cibles génomiques en cinq primes et en trois primes, ce qui définit la délétion R 18. Afin de réutiliser le marqueur sélectionnable pour effectuer des délétions ultérieures dans une souche, il faut d'abord retirer le marqueur HX GPRT d'origine du locus. Après avoir suivi le protocole décrit.L’HX GPRT a été supprimée du locus GRA deux supprimé dans la souche delta deux 80 delta GRA deux HX.G-P-R-T-P-C-R a été utilisé pour confirmer la perte de l’HX GPRT, indiquée par une bande de 1,2 kilobase. Lorsque l’H-X-G-P-R-T n’était pas supprimée, une bande de 3,4 kilobases était observée après l’étape initiale de ciblage génique. D'autres méthodes de ciblage génique peuvent être appliquées pour construire des délétions multiples dans une même souche de type un ou de type deux, ou pour marquer ou complémenter une souche mutante afin de répondre à d'autres questions, comme par exemple, où cette protéine se localise-t-elle dans la cellule ?Ou quelle est la fonction ou l'activité clé de cette protéine ou voie qui explique sa fonction biologique ? Cette technique ouvre la voie aux chercheurs du domaine pour intensifier l'exploration de la fonction des gènes parasitaires dans le complexe modèle AP et dans le parasite Toxoplasma. Gandhi eye.N'oubliez pas que le travail avec la toxoplasmose peut être dangereux et que des précautions, telles que le respect de toutes les directives de niveau de sécurité biologique 2, doivent être maintenues tout au long de la procédure.

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Présenté ici est un protocole pour évaluer l’efficacité d’inhibition des composés chimiques contre la croissance intracellulaire in vitro de Toxoplasma gondii en utilisant un essai de croissance à base de luciferase. La technique est utilisée pour confirmer la spécificité de l’inhibition par la suppression génétique du gène cible correspondant. L’inhibition de LHVS contre la protéase TgCPL est évaluée en exemple.

Détermination de l’efficacité de l’inhibiteur chimique contre la croissance intracellulaire de Toxoplasma Gondii utilisant un essai de croissance basé sur luciferase

Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.

Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

Ici, nous présentons un protocole pour identifier et génotyper rapidement les souches de Toxoplasma gondii en utilisant le séquençage nanopore portable de marqueurs génétiques sélectionnés, permettant une identification évolutive et ciblée des souches dans des isolats maintenus en laboratoire, avec une application potentielle future dans des contextes de surveillance.

Séquençage multi-locus pour le typage de contrainte de Toxoplasma gondii

Découvrez une méthode de remplacement génique ciblé dans Toxoplasma gondii utilisant les souches Δku80. Cette technique permet des manipulations génétiques précises pour l'analyse fonctionnelle des gènes parasites.

Manipulation génétique

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