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Le terme “transformation” fait référence à l'ingestion cellulaire d'ADN étranger. Dans la nature, une transformation peut avoir lieu dans certain types de bactéries. En biologie moléculaire, cependant, la transformation est artificiellement induite à travers la création de pores dans les murs de la cellule bactérienne. Les cellules bactériennes qui sont capables de prendre l'ADN depuis l'environnement sont appelées cellules compétentes. Les cellules électrocompétentes peuvent être produites en laboratoire et la transformation de ces cellules peut être réalisée via l'application d'un champ électrique qui crée des pores dans le mur de la cellule à travers lesquels l'ADN peut passer.
La vidéo explique l'équipement utilisé en électroporation tel qu'un électroporateur et une cuvette d'électroporation. La vidéo passe aussi en revue une procédure pas à pas à propos de comment créer des cellules électrocompétentes et des cellules électroporées d'intérêt. La prédiction du succès d'une transformation, par l'observation du temps constant, ainsi que l'importance de retrait du sel de la solution lors de l'électroporation, sont aussi mentionnés.
La transformation bactérienne est un processus apparaissant naturellement, dans lequel les bactéries ingèrent un ADN étranger et ensuite l'amplifient ou le clonent. Au labo, ce processus peut être artificiellement induit, en utilisant des impulsions de champ électrique haute tension pour créer des pores dans la membrane de la cellule bactérienne, à travers lesquelles l'ADN plasmidique peut passer. Le terme électroporation fait référence à cette méthode et cette vidéo montre ses principes, une procédure pas à pas et ses utilisations.
Avant de parler de l'électroporation d'une bactérie, il est important de comprendre le type d'ADN utilisé dans ces expérimentations: le plasmide. Un plasmide est un petit, circulaire, extrachromosomique morceau d'ADN qui agit comme vecteur, un porteur de votre séquence d'ADN spécifique.
Que la séquence soit un gène pour une protéine de fluorescence chez les méduses ou une enzyme de plante, elle est insérée dans le plasmide grâce à une zone appelée site de clonage multiple ou MCS. Cette zone contient des séquences spécifiques qui sont accrochées par des endonucléases de restriction ou enzymes de restriction. Les mêmes enzymes de restriction peuvent être utilisés pour couper votre séquence d'intérêt de manière à ce que les extrémités soient complémentaires aux extrémités nouvellement coupées du plasmide.
Les plasmides contiennent aussi une origine de réplication, abrégée ORI, qui indique le point où il doit être répliqué. Lorsqu'il s'agit de la transformation le gène de résistance aux antibiotiques est d'une importance vitale. Comme son nom l'implique, ce gène permet à la bactérie de produire un enzyme qui neutralise les antibiotiques, permettant aux bactéries de survivre dans un milieu contenant des antibiotiques.
L'électroporation utilise un appareil spécialisé appelé électroporateur. Les cellules sont typiquement placées dans une cuvette d'électroporation, qui a des électrodes de chaque côté qui font le contact électrique avec l'appareil une fois (que la cuvette est) insérée.
Les cellules bactériennes mélangées avec l'ADN sont chargées dans la cuvette d'électroporation et un champ électrique de l'ordre de 1000 à 10 000 volts par centimètre est appliqué pendant quelques millisecondes. Ceci fait augmenter la tension à travers la membrane jusqu'à 0,5-1 volts, ce qui est connu pour amener à un réarrangement de la bicouche phospholipidique qui compose la membrane cellulaire, de manière à ce que des pores se forment. Dans cet état l'ADN plasmidique passera à travers la membrane et lorsque les impulsions seront stoppées la bicouche se réparera elle-même.
Ayant pris le plasmide, les bactéries peuvent alors croître sur des plaques de gélose contenant des antibiotiques.
Maintenant que nous avons étudié les plasmides et le mécanisme d'électroporation, regardons comment la procédure est menée.
Les cellules qui peuvent rapidement prendre l'ADN sont référencées comme cellules compétentes. Dans la recherche en biologie moléculaire, le type de bactéries compétentes le plus commun qui est transformé est E. coli, qui est la bactérie procaryote qui vit dans votre intestin grêle. Les E. coli qui sont préparées pour l'électroporation sont référencées comme des cellules électrocompétentes.
A tout moment où vous manipulez des bactéries, faites en sorte que la zone de travail soit aussi propre que possible.
Manipuler des bactéries exige aussi la pratique d'une technique aseptisée. Typiquement cela inclu l'utilisation d'un bec Bunsen pour stériliser les instruments et pour créer un courant de convection – qui garde les contaminants en suspension dans l'air éloignés de l'espace de travail.
Juste avant l'électroporation, préchauffez le milieu à température ambiante, amenez les plateaux de gélose contenant les antibiotiques jusqu'à 37 °C, et refroidissez les cuvettes d'électroporation dans la glace.
Ensuite, dégelez dans la glace les cellules électrocompétentes lavées.
Ajoutez 1 à 5 μL de plasmide froid à 1ng/μL sans sel aux cellules bactériennes, mélangez gentiment, et ajoutez le mélange à la cuvette froide. Vérifiez qu'il n'y ait pas de bulles.
Réglez la tension et l'intensité du champ de l'électroporateur aux paramètres corrects pour vos cellules. Ici vous voyez un électroporateur être réglé à 1700 volts avec une intensité de champ de 17 kV/cm.
Essuyez l'extérieur de la cuvette et placez la dans l'électroporateur. Pulsez les cellules jusqu'à ce que vous entendiez un bip.
Une pulsation non réussie provoque une décharge électrique, qui est observable via une étincelle visible et un bruit audible. Cette décharge, dénommée arc, peut être le résultat de la présence de trop de sel dans vos cellules compétentes ou ADN.
Le succès de votre transformation peut être prédit en relevant le temps constant, qui est le temps que la tension prend pour s'affaiblir après l'application du pulse. Lorsque du sel est présent et que la solution d'électroporation est très conductrice, l'affaiblissement apparait rapidement, provoquant la décharge, et ainsi la mort de beaucoup de vos cellules. Pour les bactéries, un bon temps constant va de 5 à 10 millisecondes.
Immédiatement après l'application des pulses, retirez la cuvette et ajoutez 1 ml de milieu directement aux cellules. Ces cellules qui contiennent du milieu sont placées dans un tube et incubées à 37 °C pour 1 heure, avec agitation, en vue pour les cellules de récupérer.
Ensuite, en utilisant une technique aseptisée ajoutez 20 à 200 μL des cellules à un plateau de gélose contenant des antibiotiques. Renversez les plateaux de façon à ce que la gélose soit au dessus et donc que la condensation ne tombe pas dans vos cellules et incubez pendant la nuit à 37 °C.
Les bactéries transformées avec le plasmide devraient former des colonies. Comptez les colonies et calculez l'efficacité de la transformation, qui est le nombre de bactéries transformées avec succès divisé par le nombre total d'ADN sur la plaque.
La gélose et le milieu, qui fournissent la nourriture pour vos bactéries, devraient être pré-préparés et stérilisés par autoclave. Laissez les milieux liquides se refroidir à température ambiante avant de les utiliser et laissez la gélose se reposer à 50-55 °C – température à laquelle un antibiotique peut être ajouté et les plateaux déversés. Ensuite, laissez les plateaux refroidir à température ambiante pour solidifier.
Puisque les bactéries utilisées dans la transformation sont stockées dans le congélateur, elles doivent d'abord être dégelées dans la glace, répandues sur un plateau de gélose sans antibiotiques et ensuite croître pendant la nuit à 37 °C.
En utilisant une technique aseptisée sélectionnez une colonie bactérienne depuis le plateau de gélose et faites la croitre dans une culture plus grande de 500 mL pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur à agitation.
Pendant que les cellules se multiplient, préparez environ un litre d'eau désionisée et faites une solution à 10% en volume de glycérol dans l'eau. Mettez les solutions à l'autoclave et laissez les reposer à 4 °C.
Des mesures d'absorbance sont utilisées pour déterminer si oui ou non les bactéries sont à leur phase de croissance mi-log, ce qui signifie qu'elles vont facilement prendre l'ADN. Une fois que les cellules ont atteint cette phase, placez les dans la glace et gardez les là tout au long de la procédure.
Ensuite, lavez les cellules en les séparant dans deux tubes centrifuges et centrifugez les à 4°C, retirez le supernageant et remettez le reste en suspension dans 100 ml d'eau désionisée stérile froide. Répétez cette étape au moins une autre fois. Le but de cette étape particulière est de retirer le sel, qui va énormément affecter l'électroporation.
Réalisez deux lavages additionnels dans 50 ml de glycérol à 10% dans l'eau et remettez finalement en suspension les bactéries dans cette même solution.
Ajoutez 50 μL de cellules dans plusieurs tubes Eppendorf. Ces cellules sont maintenant prêtes pour leur utilisation en électroporation et devraient être conservées à 4 °C. Ou elles peuvent être surgelées et conservées à -80 °C.
Comme vous allez le voir, l'électroporation a de nombreuses utilisations.
Une alternative à l'électroporation est la transformation au choc thermique, qui repose sur l'exposition de la bactérie au chlorure de calcium et à la chaleur en vue d'introduire l'ADN dans vos cellules.
En général, le choc thermique est plus doux sur vos bactéries que l'électroporation et ne requiert pas une faible teneur en sel. Les réactions de ligation, celles qui impliquent l'insertion de votre gène cible dans le plasmide, peuvent être utilisées directement en transformation par choc thermique. La transformation par choc thermique est moins cher que l'électroporation et ne repose pas sur un équipement ou des cuvettes couteux. D'un autre côté, le choc thermique représente des efficacités de transformation plus faibles que l'électroporation et prend plus de temps. Aussi, la transformation par choc thermique est limitée aux bactéries, à la levure et aux protoplastes végétaux alors que l'électroporation peut être appliquée aux cellules mammifères.
Ici vous voyez des fibroblastes d'embryon de souris chargés dans une cuvette d'électroporation. Une fois l'électroporation finie, l'efficacité de la transformation peut être déterminée par l'observation de la mesure selon laquelle les cellules produisent une protéine fluorescente verte codée par le plasmide. La transfection est le terme donné à la transformation de cellules mammifères, qui requiert typiquement des intensités de courant inférieures à celles pour des cellules bactériennes et des temps constants supérieurs.
L'électroporation peut aussi être réalisée dans tous les animaux, comme l'embryon de poulet en développement que vous voyez ici. L'ADN plasmidique est injecté dans le cerveau du poussin et ensuite un test d'électroporation est utilisé pour appliquer un champ électrique sur les tissus du cerveau. Après un jour ou deux, des protéines fluorescentes vertes et rouges – encodées dans le plasmide – sont produites par les neurones, et les scientifiques peuvent observer des changements structurels dans le cerveau du poussin en développement.
Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la transformation bactérienne par électroporation. Cette vidéo introduit le plasmide comme le type d'ADN le plus communément transformé, discute le mécanisme biophysique à la base de l'électroporation, montre une procédure généralisée pour réaliser une électroporation, et décrit comment l'électroporation peut être utilisée dans un système mammifère. Merci de nous avoir regardé!
La transformation bactérienne est un processus naturel, dans lequel les bactéries ingèrent de l’ADN étranger, puis l’amplifient ou le clonent. En laboratoire, ce processus peut être induit artificiellement, en utilisant des impulsions de champ électrique à haute tension pour créer des pores dans la membrane cellulaire bactérienne, à travers lesquels l’ADN plasmidique peut passer. L’électroporation fait référence à cette méthode et la vidéo suivante démontrera ses principes, sa procédure étape par étape et ses applications.
Avant de parler de l’électroporation des bactéries, il est important de comprendre le type d’ADN utilisé dans ces expériences : le plasmide. Un plasmide est un petit morceau d’ADN extrachromosomique circulaire qui agit comme un vecteur, un porteur de votre séquence d’ADN spécifique.
Que cette séquence soit un gène d’une protéine de fluorescence chez les méduses ou une enzyme végétale, elle est insérée dans le plasmide via une région appelée site de clonage multiple ou MCS. Cette région contient des séquences spécifiques qui sont clivées par des endonucléases de restriction ou des enzymes de restriction. Les mêmes enzymes de restriction peuvent être utilisées pour découper la séquence qui vous intéresse afin que les extrémités soient complémentaires aux extrémités nouvellement coupées du plasmide.
Les plasmides contiennent également une origine de réplication, abrégée ORI, qui indique le point auquel il sera répliqué. Lorsqu’il s’agit de transformation, le gène de résistance aux antibiotiques est d’une importance vitale. Comme son nom l’indique, ce gène permet aux bactéries de produire une enzyme qui neutralise les antibiotiques, leur permettant de survivre dans des milieux contenant des antibiotiques.
L’électroporation utilise un appareil spécialisé appelé électroporateur. Généralement, les cellules sont placées dans une cuvette d’électroporation, qui a des électrodes de chaque côté qui établissent un contact électrique avec la machine une fois insérée.
Des cellules bactériennes mélangées à de l’ADN sont chargées dans la cuvette d’électroporation et un champ électrique de l’ordre de 1000 à 10 000 volts par centimètre est appliqué pendant quelques millisecondes. Cela fait que la tension à travers la membrane atteint 0,5-1 volts, ce qui conduirait à un réarrangement de la bicouche phospolipidique qui comprend la membrane cellulaire de sorte que des pores se formeront. Dans cet état, l’ADN plasmidique passera à travers la membrane et, lorsque l’impulsion sera terminée, la bicouche se réparera.
Après avoir absorbé le plasmide, les bactéries peuvent ensuite se développer sur des plaques de gélose contenant des antibiotiques.
Maintenant que nous avons appris sur les plasmides et le mécanisme d’électroporation. Voyons comment se déroule la procédure.
Les cellules qui peuvent facilement absorber l’ADN sont appelées cellules compétentes. Le type le plus courant de bactéries compétentes qui est transformé dans la recherche en biologie moléculaire est E. coli, qui sont les bactéries procaryotes qui ont élu domicile dans votre intestin inférieur. Les E. coli qui sont préparés pour l’électroporation sont appelés cellules électrocompétentes.
Chaque fois que vous manipulez des bactéries, assurez-vous que la zone de travail est aussi propre que possible.
La manipulation des bactéries nécessite également de pratiquer une technique aseptique. Généralement, cela implique l’utilisation d’un bec Bunsen pour stériliser les instruments et pour créer un courant de convection ? ce qui éloigne les contaminants en suspension dans l’air de l’espace de travail.
Immédiatement avant l’électroporation, préchauffez le milieu à température ambiante, amenez les plaques de gélose contenant l’antibiotique à 37 ? C, et des cuvettes d’électroporation froides sur de la glace.
Ensuite, décongelez les cellules électrocompétentes lavées sur de la glace.
Ajouter 1-5 uL de 1ng/ ? L plasmide froid sans sel pour les cellules bactériennes, mélangez doucement et ajoutez le mélange dans la cuvette froide. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles.
Réglez la tension et l’intensité de champ de l’électroporateur sur les paramètres corrects pour vos cellules. Ici, vous voyez un électroporateur réglé sur 1700 volts et produisant une intensité de champ de 17kV/cm.
Essuyez l’extérieur de la cuvette et placez-le dans l’électroporateur. Pulsez les cellules jusqu’à ce que vous entendiez un bip.
Une impulsion infructueuse provoque une décharge électrique, qui est observable sous la forme d’une étincelle visible et d’un pop audible. Cette décharge, appelée arc électrique, peut être le résultat d’une trop grande quantité de sel dans vos cellules compétentes ou votre ADN.
Le succès de votre transformation peut être prédit en notant la constante de temps, c’est-à-dire la durée nécessaire pour que la tension décroît après l’application de l’impulsion. Lorsque du sel est présent et que la solution d’électroporation est très conductrice, la décomposition se produit rapidement, provoquant la décharge et tuant ainsi bon nombre de vos cellules. Pour les bactéries, les bonnes constantes de temps vont de 5 à 10 millisecondes.
Immédiatement après l’impulsion, retirez la cuvette et ajoutez 1 ml de média directement dans les cellules. Cette cellule contenant le milieu est placée dans un tube et incubée à 37° ? C pendant 1 heure, avec agitation, afin que les cellules se rétablissent.
Ensuite, en utilisant une technique aseptique, ajoutez 20 à 200 μL de la cellule dans une plaque de gélose contenant un antibiotique. Inversez les plaques de manière à ce que la gélose soit sur le dessus et que la condensation ne tombe pas dans vos cellules et incubez pendant la nuit à 37 ?C.
Les bactéries transformées avec le plasmide devraient former des colonies. Comptez les colonies et calculez l’efficacité de la transformation, c’est-à-dire le nombre de transformants réussis divisé par la quantité totale d’ADN plaqué.
La gélose et le milieu, qui fournissent la nutrition à vos bactéries, doivent être pré-préparés et stérilisés par autoclavage. Laisser refroidir le milieu liquide à température ambiante avant de l’utiliser et laisser refroidir la gélose à 50-55 ? C ? la température à laquelle l’antibiotique peut être ajouté et les assiettes versées. Ensuite, laissez les plaques refroidir à température ambiante pour se solidifier.
Étant donné que les bactéries utilisées pour la transformation sont stockées dans le congélateur, elles doivent d’abord être décongelées sur de la glace, étalées sur une plaque de gélose sans antibiotiques, puis cultivées pendant la nuit à 37 ?C.
À l’aide d’une technique aseptique, sélectionner une colonie bactérienne dans la plaque de gélose et la faire grandir dans une culture plus grande de 500 ml pendant la nuit à 37 ? C dans un incubateur à secousses.
Pendant que les cellules se développent, préparez environ un litre d’eau déminéralisée et préparez une solution de 10 % de glycérol et d’eau, volume à volume. Autoclavez les solutions et laissez-les refroidir à 4°C.
Les mesures d’absorbance sont utilisées pour déterminer si les bactéries sont ou non dans leur phase de croissance moyenne, ce qui signifie qu’elles absorberont facilement l’ADN. Une fois que les cellules ont atteint cette phase, placez-les sur de la glace et conservez-les là tout au long de la procédure.
Ensuite, lavez les cellules en les séparant dans deux grands tubes à centrifuger et tournez-les à 4° ? C, vider le surnageant et remettre en suspension dans de l’eau déminéralisée stérile froide de 100 ml. Répétez cette étape au moins une fois de plus. Le but de cette étape particulière est d’éliminer le sel, ce qui affectera fortement la technique d’électroporation.
Effectuez deux lavages supplémentaires dans 50 ml de glycérol à 10 % dans de l’eau et enfin remettez les bactéries en suspension dans cette même solution.
Ajouter 50 ? L de cellules dans plusieurs tubes d’Eppendorf. Ces cellules sont maintenant prêtes à être utilisées en électroporation et doivent être maintenues à 4°C. Ou ils peuvent être surgelés et stockés à -80 ?C.
Comme vous allez le voir, l’électroporation a de nombreuses applications.
Une alternative à l’électroporation est la transformation par choc thermique, qui repose sur l’exposition des bactéries à la fois au chlorure de calcium et à la chaleur afin d’introduire de l’ADN dans vos cellules.
En général, le choc thermique est plus doux pour vos bactéries que l’électroporation et ne nécessite pas une faible teneur en sel. Les réactions de ligature, celles qui impliquent l’insertion de votre gène cible dans le plasmide, peuvent être utilisées directement dans la transformation par choc thermique. La transformation par choc thermique est moins chère que l’électroporation et ne repose pas sur des équipements ou des cuvettes coûteux. D’autre part, le choc thermique entraîne des rendements de transformation inférieurs à ceux de l’électroporation et prend plus de temps. De plus, il est limité aux protoplastes bactériens, levures et plantes, tandis que l’électroporation peut être appliquée aux cellules de mammifères.
Ici, vous voyez des fibroblastes embryonnaires de souris chargés dans une cuvette d’électroporation. Une fois l’électroporation terminée, l’efficacité de la transformation peut être déterminée en observant dans quelle mesure les cellules produisent une protéine de fluorescence verte codée par le plasmide. La transfection est le terme donné à la transformation des cellules de mammifères, qui nécessite généralement des intensités de champ inférieures à celles des cellules bactériennes et des constantes de temps plus élevées.
L’électroporation peut également être effectuée chez des animaux entiers comme l’embryon de poulet en développement que vous voyez ici. L’ADN plasmidique est injecté dans le cerveau du poussin, puis une sonde d’électroporation est utilisée pour appliquer un champ électrique au tissu cérébral. Après un jour ou deux, des protéines fluorescentes vertes et rouges - codées par le plasmide - sont fabriquées par les neurones, et les scientifiques peuvent observer des changements structurels dans le cerveau du poussin en développement.
Vous venez d’assister à l’introduction de JoVE à la transformation bactérienne par électroporation. Cette vidéo présentait le plasmide comme le type d’ADN le plus couramment transformé, discutait du mécanisme biophysique qui sous-tendait l’électroporation, montrait une procédure généralisée de conduite de l’électroporation et décrivait comment l’électroporation peut être utilisée dans le système des mammifères. Merci d’avoir regardé !
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