CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l'ADN dans les cellules humaines Microarrayed

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment utiliser la puce COMET pour effectuer des mesures à haut débit des dommages à l’ADN dans des cellules de mammifères. Ceci est accompli en chargeant d’abord des cellules de mammifères dans la puce COMET. La deuxième étape consiste à traiter les cellules avec des produits chimiques connus pour causer des dommages à l’ADN.

Ensuite, les cellules sont lysées et Electro East à l’aide des protocoles de dosage COMET traditionnels. La dernière étape est l’imagerie par fluorescence de l’ADN cellulaire pour visualiser la migration de l’ADN endommagé. En fin de compte, un logiciel d’analyse d’images est utilisé pour quantifier l’étendue des dommages à l’ADN.

Le test com existe donc depuis très longtemps et c’est un test très utile pour examiner de nombreux types de dommages à l’ADN. Mais le problème est qu’il a un débit très faible et qu’il manque de sensibilité. Nous avons donc créé la puce COMET, qui est essentiellement une version à très haut débit du test COMET qui permet de faire du dépistage à haut débit pour le dépistage de drogues, par exemple, et pour des études épidémiologiques.

Jing GA, étudiant diplômé dans mon laboratoire, fera une démonstration de la procédure. La puce de coma est un gel avec un réseau de micro-puits produits à partir d’un tampon micro-fabriqué avec des micro-poteaux d’un diamètre aussi petit que celui d’une seule cellule pour commencer à être placés dans une plaque rectangulaire à un puits, un film de liaison de gel côté vers le bas. Après avoir lavé le gel deux fois en 25 millilitres dans un XPBS, réglez la puce virgule sur une plaque de verre, puis étiquetez l’orientation du gel en conséquence.

Maintenant, appuyez doucement sur une plaque inversée sans fond à 96 puits dans le gel, en vous assurant que tous les 96 puits se trouvent dans la zone du gel. Fixez ensuite l’un ou l’autre côté de la plaque à 96 puits à la plaque de verre à l’aide de pinces de reliure de 1,5 pouce. Enfin, aspirez tout excès de PBS de chacun.

Bien récolter les cellules en suspension ou adhérentes selon les procédures standard et diluer les cellules avec du milieu jusqu’à une concentration finale de 100 000 à 1 million de cellules par millilitre. S’assurer d’obtenir une suspension à cellule unique en passant à travers un filtre à cellules si nécessaire. Pipette 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits, la puce comète 96 plaque de puits une fois terminé.

Couvrez la plaque avec le film de liaison gel pour éviter l’évaporation, puis placez-la dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes après avoir retiré la plaque de l’incubateur. Lorsque les 30 minutes se sont écoulées, aspirez le support de chacun, puis retirez les pinces de reliure et la plaque sans fond à 96 puits Tenez la puce de la comète avec la plaque de verre en biais et rincez doucement avec un XPBS pour éliminer toutes les cellules en excès sur le dessus de l’aros. Maintenant, regardez la plaque à travers une lentille d’objectif quatre x sur un microscope à champ clair pour vérifier le chargement optimal des cellules Une fois qu’un nombre suffisant de cellules est chargé, placez une puce com sur une surface plane, une superposition avec 1 % de point de fusion bas agros qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius.

Laissez le revêtement se solidifier à température ambiante pendant trois minutes, puis placez-le à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour une dation complète afin de doser les cellules avec les produits chimiques d’intérêt. Tout d’abord, alignez soigneusement les puits de la puce de la comète avec les puits d’une nouvelle plaque de puits sans fond à 96 et appuyez dessus. Fixez la plaque à 96 puits à la plaque de verre à l’aide de pinces à liant comme précédemment.

Ensuite, placez la plaque sur de la glace et ajoutez 100 microlitres du produit chimique d’intérêt à la dose souhaitée Pour chaque puits, laissez le produit chimique à l’étude rester sur les cellules avec la période de temps souhaitée après le dosage, aspirez la solution chimique de chaque puits et rincez avec un XPBS si nécessaire. Coupez le gel en morceaux séparés. Ensuite, pour étudier la cinétique de réparation, ajoutez des milieux de culture dans les puits d’incubation et procédez à la lyse cellulaire à des moments précis sur les cellules LY pour le test des comètes alcalines.

Préparez environ 25 millilitres de tampon de lyse alcaline de travail pour chaque puce en ajoutant 1 % de Triton X 100 à la solution mère de lyse alcaline. Ensuite, pré-refroidissez à quatre degrés Celsius. Décantez le tampon de lyse alcaline dans un récipient juste plus grand que la puce de la comète.

Ensuite, plongez la puce alcaline dans le tampon de lyse alcalin de travail réfrigéré, placez-le au réfrigérateur et laissez la lyse se poursuivre pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez la puce de la comète du tampon de lyse et rends rapidement avec un XPBS. Placez ensuite la puce dans une chambre d’électrophorèse avec le côté du film de gel vers le bas et fixez-la avec du ruban adhésif double face.

Amenez la chambre dans la chambre froide à quatre degrés Celsius et remplissez la chambre avec un tampon d’électrophorèse alcaline froide à un niveau qui recouvre à peine le gel. Laissez ensuite la puce à quatre degrés Celsius pendant 40 minutes pour permettre un déroulement alcalin. Enfin, faites fonctionner le gel à un volt par centimètre et 300 milliampères pendant 30 minutes.

Dans la chambre froide, ajustez le volume du tampon d’électrophorèse dans la chambre pour obtenir le courant de fonctionnement souhaité. Pour le dosage de la comète neutre, fabriquer un tampon de lyse neutre fonctionnel en ajoutant 1 % de Triton X 110 % de DMSO à une solution mère de lyse neutre. Encore une fois, en préparant environ 25 millilitres de tampon de lyse de travail pour chaque puce.

Placez le tampon de lyse neutre de travail dans l’incubateur réglé à 43 degrés Celsius pour le préchauffer. Une fois que le tampon de lyse neutre est chauffé, plongez la puce de virgule dans le tampon de lyse neutre et placez-la dans un incubateur à 40 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, retirez le tampon de lyse neutre, puis res deux fois avec un tampon d’électrophorèse neutre pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius À chaque fois, fixez la puce dans la chambre d’électrophorèse et transférez-la dans la chambre froide.

Comme précédemment, remplissez la chambre d’électrophorèse avec un tampon d’électrophorèse neutre à un niveau qui ne couvre que le gel et laissez le gel reposer dans une pièce froide pendant 60 minutes, faites fonctionner le gel à 0,6 volts par centimètre et six milliampères pendant 60 minutes dans la chambre froide. Encore une fois, ajustez le volume du tampon d’électrophorèse dans la chambre pour obtenir le courant de fonctionnement souhaité si nécessaire. Après avoir retiré la puce com de la chambre froide, neutralisez les gels en les lavant et en neutralisant le tampon deux fois pendant 15 minutes chacun à quatre degrés Celsius.

Restez dans la puce avec une coloration d’ADN fluorescente telle que l’or cyberg ou le bromure d’iridium. Selon les instructions du fabricant et l’image utilisée par microscopie fluorescente représentative, les comètes Microwell de TK non traitées, six lymphoblastes sont représentés dans la partie supérieure de ce diagramme. Ceux de six cellules TK ont été exposés à 50 micromolaires de peroxyde d’hydrogène dans le panneau du milieu et à 100 micromolaires de peroxyde d’hydrogène dans le panneau inférieur.

Toutes les expositions ont duré 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ce graphique linéaire montre la relation dose-réponse au peroxyde d’hydrogène des cellules TK six. Chaque point de données est la moyenne de trois expériences indépendantes où le pourcentage médian d’ADN de queue d’au moins 50 comètes individuelles a été obtenu dans chaque expérience.

Ce graphique montre la variation d’un échantillon à l’autre du test de la puce de virgule pour TK : six cellules exposées au peroxyde d’hydrogène pour cent des données ADN de queue de chaque puits sont présentées ici. Chaque boîte représente la médiane d’au moins 50 comètes individuelles de chaque puits. La moyenne de 12 puits est de 77 virgule 53 %L’écart-type est de 3,99 % et le coefficient de variation est de 5,2 %Ce graphique montre la variation d’une expérience à l’autre.

La même exposition au peroxyde d’hydrogène a été répétée six fois, et les données de chaque répétition sont affichées sous forme de barre grise. Chaque boîte représente le pourcentage médian d’ADN de queue d’au moins 100 comètes individuelles de chaque répétition. La moyenne de six répétitions est de 49,57 %.

L’écart-type de six répétitions est de 4,99 % et la barre d’erreur de la moyenne est de 2,04 %, représentée par la barre d’air dans la figure Comme le test commun traditionnel. Les chercheurs sont libres d’apporter des modifications à cette procédure ou d’utiliser d’autres gâchis, tels que l’inclusion d’enzymes spécifiques aux lésions purifiées pour répondre à des questions supplémentaires sur le type de dommages à l’ADN produits dans les cellules. La technique de la puce comète a ouvert la voie à l’étude des cellules de mammifères pour en savoir plus sur les dommages et la réparation de l’ADN.

Et parce qu’il a un débit élevé, il permet de faire des études cliniques et épidémiologiques qui n’étaient tout simplement pas possibles auparavant en raison du nombre d’échantillons.