Name: Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Découvrez la fabrication de nanocapteurs pH-réactifs intégrés dans des échafaudages PLGA pour la culture cellulaire 3D. Cette méthode permet le suivi en temps réel et in situ du microenvironnement cellulaire sans perturbation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Le financement du BBSRC est aimablement reconnu (numéro de subvention BB H011293 / 1).

Vue d&#39;ensemble Section 1 décrit la préparation de pH nanocapteurs sensibles et la caractérisation de la réponse de nanocapteurs à pH en utilisant la spectrométrie de fluorescence et leur taille au MEB. Section 2 décrit la préparation d&#39;échafaudages polymères électrofilées et caractérisation de leur morphologie et de la taille par MEB. Section 2 décrit également la préparation d&#39;échafaudages d&#39;auto-déclaration qui sont échafaudages électrofilées avec l&#39;inclusion des pH nanocapteurs sensibles. Les échafaudages auto-déclaration qui en résultent sont caractérisés par SEM d&#39;évaluer si des changements morphologiques dans les fibres électrofilées s&#39;est produite. La fluorescence à partir des échafaudages d&#39;auto-vérification qui résultent des nanocapteurs intégrés est évaluée par microscopie confocale. La section 3 décrit la culture de cellules sur l&#39;échafaud électrofilé et l&#39;échafaud de l&#39;auto-déclaration. Les échafaudages sont d&#39;abord stérilisés en préparation pour la culture cellulaire après quoi les échafaudages sont évaluées afin de déterminer si la stérilisation et la culture de cellules influent sur la capacité de la fluorescence des échafaudages d&#39;auto-vérification. Le protocole décrit également la livraison de nanocapteurs à des cellules qui sont cultivées sur des échafaudages électrofilées. Lysotracker colorant est utilisé pour s&#39;assurer que les nanocapteurs n&#39;ont pas été prises en compartiments acides cellulaires. Une. Préparation et analyse de pH Responsive nanocapteurs Sol-gel 1.1 Préparation des réactifs pH nanocapteurs Sol-gel Remarque: Cette préparation doit être effectuée dans une hotte de laboratoire. <ol><li> Préparer les fluorophores destiné à être utilisé dans le cadre des nanocapteurs de pH par dissolution de 5 - (et-6)-carboxyfluorescéine, ester de succinimidyle (FAM-SE) (1,5 mg) dans du diméthylformamide (DMF) (1 ml) dans un ballon à fond rond et 6-carboxytétraméthylrhodamine , ester de succinimidyle (TAMRA-SE) (1,5 mg) dans du DMF (1 ml) dans un autre ballon à fond rond.Ajouter 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) (1,5 ml) à chaque flacon et agiter sous une atmosphère d&#39;azote sec (21 ° C) pendant 24 heures dans l&#39;obscurité dire envelopper les échantillons dans du papier. </li><li> Ajouter à la fois des colorants ci-dessus (250 ul) à un mélange d&#39;éthanol (6 ml) et de l&#39;hydroxyde d&#39;ammonium (30% en poids, 4 ml) contenu dans un ballon à fond rond et on agite pendant 1 heure (21 ° C). </li><li> Ajouter lentement le tétraéthylorthosilicate (TEOS) (0,5 ml) au mélange, continuer l&#39;agitation pendant encore 2 h. Le mélange va devenir trouble. Les nanocapteurs peuvent être recueillies par evaporation rotative. Nanocapteurs peuvent être stockées dans un flacon en verre à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. ATTENTION: la manipulation ultérieure des nanocapteurs dans leur forme sèche doit être effectuée dans une hotte ou dans le cas de les peser la balance doit être fermée, par exemple dans un Weighsafe. </li></ol> 1.2 Réponse nanocapteur à pH <ol><li> Préparer les solutions tampons de phosphate de Sorensen allant de pH 5,5 à 8,0 par mixing ratios spécifiques de phosphate monosodique (0,2 M) et de phosphate disodique (0,2 M) de solutions mères. Vérifier le pH final à l&#39;aide d&#39;un pH-mètre. Faire les ajustements mineurs au pH à l&#39;aide d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) (4 M) ou de l&#39;acide chlorhydrique (HCl) (2 M). </li><li> Suspendre les nanocapteurs de pH dans les tampons de pH (5 mg / ml) en maintenant tout d&#39;abord la cuve contenant la solution de nanocapteur au vortex pendant 3 minutes, puis l&#39;immersion du récipient dans un appareil à ultrasons jusqu&#39;à ce que la solution devienne trouble (environ 5 min). Répétez ces étapes pour suspendre totalement les nanocapteurs en solution. </li><li> Placez la première solution dans une cuvette optique et utiliser des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 488 nm pour 5 - (et 6)-carboxyfluorescéine (FAM) et 568 nm pour 6 carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA). Recueillir les longueurs d&#39;onde d&#39;émission à 500-530 nm pour FAM et TAMRA 558 à 580 nm pour l&#39;aide d&#39;un spectromètre à fluorescence. </li><li> Changer les solutions dans la cuve optique de sorte que le pH peut être observée à un pH différent et continuer collecting les spectres d&#39;émission. </li><li> Calculer le rapport des maxima d&#39;émission produite à chaque valeur de pH pour produire une courbe d&#39;étalonnage. </li></ol> 1.3 SEM de nanocapteurs <ol><li> Placez un échantillon des nanocapteurs sur un microscope électronique à talon recouvert de carbone et de projections manteau d&#39;or pendant 5 min sous atmosphère d&#39;argon. </li><li> Observer par microscopie électronique à balayage (MEB). Au cours de l&#39;imagerie de régler la distance de travail, de la tension et de l&#39;agrandissement d&#39;électrons pour réduire au minimum la charge (figure 1). </li></ol> 2. Préparation et analyse de PLGA échafaudages 2.1 Électrofilage PLGA échafaudages <ol><li> Dans une hotte dissoudre le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans du dichlorométhane (DCM) (20% (w / w)) avec le formiate de pyridinium (PF) (1% (p / p)). Placer la solution dans une seringue de 10 ml avec une aiguille émoussée de remplissage 18 G et en toute sécurité, en forme d&#39;une pompe à seringue. </li><li> Distance de la pointe de l&#39;aiguille 20 cm à partir d&#39;un 20cm x 15 cm plateau de collecte d&#39;aluminium. </li><li> Attachez l&#39;électrode d&#39;une alimentation électrique à haute tension à l&#39;extrémité de la seringue et de la terre à la plaque d&#39;aluminium de collecte. ATTENTION: Il faut faire attention que la haute tension est utilisé à savoir toujours couper l&#39;alimentation électrique avant de manipuler un des équipements de électrofilature. </li><li> Livrer la solution en utilisant un débit constant de 3,5 m / h à 12 kV pendant 2 heures. Électrofilage utilisant ces conditions donnera une profondeur d&#39;environ 60 um d&#39;échafaudage. </li><li> Laissez l&#39;échafaud dans une hotte pendant 24 heures pour permettre résidu de solvant s&#39;évapore. </li></ol> 2.2 Électrofilage pH Responsive PLGA échafaudages <ol><li> Préparer échafaudages incorporant pH nanocapteurs sensibles comme décrit dans la section 2.1, mais avec la modification de l&#39;ajout de nanocapteurs pour la solution de polymère (5 mg / ml). Suspendre les nanocapteurs dans la solution de PLGA avec l&#39;aide d&#39;ultrasons (environ 5 min) avant<html> à placer dans une seringue de 10 mL. </li></ol> 2.3 SEM de PLGA Échafaudages Échafaudages et pH Responsive <ol><li> Placez un échantillon de l&#39;échafaud PLGA ou pH échafaud sensible sur un électron revêtu microscope talon de carbone et procéder comme décrit pour SEM de nanocapteurs (Figure 1). </li></ol> 2.4 Étalonnage du pH Échafaudages Responsive <ol><li> Placez un échantillon de pH échafaud sensible dans une plaque de culture de 35 mm et plonger dans des solutions tampons appropriées. </li><li> Sur un microscope confocal en utilisant un laser à argon de 488 nm pour exciter la FAM et un laser à krypton 568 nm pour exciter le TAMRA à l&#39;intérieur des nanocapteurs. Observer l&#39;émission de fluorescence pour pH échafaudages sensibles à 500-530 nm pour FAM et 558-580 nm pour TAMRA. (Figure 2). Utilisation balayage séquentiel pour éviter la collecte de longueurs d&#39;onde d&#39;excitation. </li></ol> 3. Culture cellulaire sur PLGA échafaudages et pH Responsive PLGA échafaudages ntent &quot;&gt; Note: Ce qui suit doit être effectué dans une armoire de culture cellulaire. 3.1 Préparation de PLGA échafaudages pour la culture cellulaire <ol><li> Couper les PLGA ou pH sensibles échafaudages PLGA dans 2 cm 2 pièces. </li><li> Stériliser par irradiation d&#39;échafaudages avec des rayons ultraviolets (UV), à une distance de 8 cm pour 15 min de chaque côté. </li><li> Transférer les échafaudages sur une plaque de culture de 12 puits et placer un anneau en acier sur le dessus. Ajouter une solution de pénicilline / streptomycine (5% v / v) dans du tampon phosphate salin (PBS) à l&#39;intérieur et à l&#39;extérieur de la bague en acier, laisser incuber pendant une nuit (37 ° C, 5% CO 2). Notez l&#39;anneau d&#39;acier a été fabriqué à l&#39;Université de Nottingham et a les dimensions suivantes: diamètre extérieur de 2 cm, 1 cm de diamètre intérieur, 1 cm de profondeur. </li><li> Retirer la solution de stérilisation et de lavage avec du PBS. </li><li> Ajouter milieux de culture cellulaire à l&#39;intérieur (500 pl) et à l&#39;extérieur (500 ul) de la bague d&#39;acier, placer dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;), tout en préparant une suspension de cellules. </li><li> Préparer une suspension de cellules et effectuer un comptage des cellules en utilisant un dosage d&#39;exclusion au bleu Trypan. </li><li> Créer une suspension de cellules pour obtenir un nombre de cellules de 1 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Retirez le support de l&#39;intérieur et à l&#39;extérieur de la bague d&#39;acier. </li><li> Remplacer préchauffé avec des milieux de culture cellulaire à l&#39;extérieur de la bague en acier (1 m). </li><li> Ajouter 300 ul de la suspension de cellules à l&#39;intérieur de la bague en acier - plaque de roche vers l&#39;arrière et vers l&#39;avant en douceur pour distribuer des cellules. </li><li> Placer la plaque de culture cellulaire dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) - la fixation des cellules aurait dû avoir lieu dans les 24 heures, mais continuer la culture pour aussi longtemps que l&#39;expérience nécessite - rafraîchissant les médias tous les 2-3 jours. </li></ol> 3.2 nanocapteur livraison de cellules cultivées sur PLGA Échafaudages <ol><li> cellules de semences donnant sur PLGA échafaud, comme décrit dans la section 3.1. Pour cette étude, un échafaudage PLGA vierge (non containanocapteurs ning) a été utilisé en raison du chevauchement de l&#39;émission de fluorescence lors de l&#39;imagerie. </li><li> Placez la cellule échafaudage tête de série dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 72 heures pour permettre aux cellules de se développer et migrent à travers l&#39;échafaud avant nanocapteur livraison. </li><li> Avant nanocapteur livraison laver les cellules avec du PBS et changer le support du milieu de culture standard pour des médias libres antibiotiques et de sérum, incuber (37 ° C, 5% CO 2) pendant 1 heure. Remarque: les milieux de culture standard pour les cellules 3T3 comprend de Eagle modifié de milieu de Dulbecco additionné de sérum de veau foetal (10% (v / v)), solution de L-glutamine (2 mM), de pénicilline / streptomycine (1% (v / v)) . </li><li> Au cours de la période d&#39;incubation préparer le complexe nanocapteur-liposomes par sonication brièvement nanocapteurs (5 mg) avec Optimem (50 pi) pour créer la solution A. </li><li> Créer une solution B en ajoutant Lipofectamine 2000 (5 pi) de Optimem (45 ul), incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter solutionA à la solution B, incuber à température ambiante pendant 20 min pour former une solution C, qui est le complexe liposome-nanocapteur. </li><li> Ajouter la solution C (100 ul) aux cellules et incuber (37 ° C, 5% CO2) pendant 3 heures. </li><li> Retirez les échafaudages ensemencés de cellules de l&#39;incubateur, les médias aspirer et laver deux fois avec du PBS avant d&#39;ajouter PBS (1 ml) pour permettre la visualisation des cellules vivantes par microscopie confocale. Note: Le PBS a été utilisé dans ce protocole pour que l&#39;indicateur rouge de phénol présent dans les milieux de culture cellulaire n&#39;a pas causé autofluorescence et aussi parce qu&#39;un étalonnage à différents pH a été effectuée. Cependant phénol médias libres rouges pourraient être utilisés pour analyse à plus long terme de cultures cellulaires. </li><li> Plonger la cellule échafaudage tête de série dans les tampons de pH différents et surveiller la réponse des nanocapteurs associés aux cellules. </li><li> Surveiller le pHi par la détermination du rapport des intensités de fluorescence de la FAM et TAMRA par l&#39;observation de la fluorescence en utilisant la microscopie confocale (Figure 3). </li></ol> 3.3 nanocapteur Situation dans les cellules de mammifères <ol><li> Incuber les cellules avec nanocapteurs ne contenant que le colorant FAM comme décrit dans la section 3.2 (c&#39;est parce que l&#39;émission de fluorescence de TAMRA est dans la même région spectrale que le Lysotracker rouge). Préparer ces nanocapteurs comme décrit dans la section 1.1, mais avec l&#39;omission de la préparation et en ajoutant TAMRA. </li><li> Après la période de livraison nanocapteur diluer la solution mère Lysotracker Rouge à 50 nM. </li><li> Ajouter une fraction aliquote de la solution diluée (2 ul) de cellules cultivées sur des échafaudages de PLGA. </li><li> Incuber les cellules avec Lysotracker rouge pendant 1 heure (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Après la période d&#39;incubation, retirer le support et laver les cellules deux fois avec du PBS (pH 7,4) avant de changer le média de PBS (pH 7,4) (2 ml) en vue de la visualisation en utilisant la microscopie confocale. Remarque: phénol médias libres rouges pourraient être utilisés à la place de PBS. </li><li> Ajouter le colorant nucléaire Draq5 au PBS de sorte que la concentration finale est de 5 uM et incuber avec les cellules pendant 3 min (à 37 ° C, 5% CO 2). Il n&#39;est pas nécessaire de changer les médias après la période d&#39;incubation avec DRAQ5. </li><li> Utilisez un laser 488 nm de l&#39;argon pour exciter le FAM ne nanocapteurs, un laser krypton 568 nm pour exciter le Lysotracker rouge et 633 nm hélium / néon laser pour exciter le chromophore DRAQ5 et observer la fluorescence à 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm, respectivement (Figure 3). Utilisation balayage séquentiel pour éviter la collecte de longueurs d&#39;onde d&#39;excitation. </li></ol>

<ol><li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li>
<li>Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precoating+of+elastomeric+tissue-engineering+scaffolds+increased+cellularity%2C+enhanced+extracellular+matrix+protein+production%2C+and+differentially+regulated+the+phenotypes+of+circulating+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).</li>
<li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).</li>
<li>Li, D., Xia, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+nanofibers%3A+Reinventing+the+wheel%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?</a> Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro+spinning%3A+Applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).</li>
<li>Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+monitoring+of+3D+in+vitro+cell+aggregation+using+an+optical+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).</li>
<li>Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Response+to+Interstitial+Flow%3A+A+State-of-the-Art+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).</li>
<li>Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+tools+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Enabling tools for tissue engineering.</a> Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).</li>
<li>You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+degradation+behaviour+of+non-porous+ultra-fine+poly%28glycolic+acid%29%2Fpoly%28L-lactic+acid%29+fibres+and+porous+ultra-fine+poly%28glycolic+acid%29+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres.</a> Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).</li>
<li>Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+degradation+behaviors+of+electrospun+PGA%2C+PLGA+and+P%28LLA-CL%29+nanofibers+cultured+with%2Fwithout+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Multi-Functional+Materials+and+Structures%22%5BJournal%5D)">Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture.</a> Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).</li>
<li>Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+glucose+monitoring+and+control+in+a+rotating+wall+perfused+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).</li>
<li>Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+PLGA+fibre+sheets+incorporating+fluorescent+nanosensors%3A+self-reporting+scaffolds+for+application+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering.</a> Analytical Methods. 5 (1), (2013).</li>
<li>Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+membranes+for+highly+sensitive+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors.</a> Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).</li>
<li>Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+fluorescent+monitoring+of+the+degradation+of+polymeric+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering.</a> Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).</li>
<li>Blackwood, K. A., McKean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).</li>
<li>Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter+and+orientation+on+fibroblast+morphology+and+proliferation+on+electrospun+poly%28D%2CL-lactic-co-glycolic+acid%29+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes.</a> Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).</li>
<li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).</li>
<li>Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+scaffold+degradation+rate+on+three-dimensional+cell+growth+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis.</a> Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

L&#39;ingénierie tissulaire aspire à créer des substituts biologiques pouvant être utilisé à la fois in vivo comme des modèles in vitro de tissus et dans la thérapie de remplacement de tissu à réparer, de remplacer, de maintenir ou d&#39;améliorer la fonction d&#39;un tissu ou d&#39;un organe particulier. Substituts synthétiques ont été utilisés pendant de nombreuses années pour remplacer ou réparer des tissus de l&#39;aide, mais ceux-ci échouent souvent en raison de la faible intégration avec le tissu...

Une stratégie clé dans l&#39;ingénierie tissulaire est l&#39;utilisation de matériaux biocompatibles pour fabriquer des échafaudages dont la morphologie ressemble le tissu qu&#39;il va remplacer et est également capable de soutenir la croissance et la fonction 1,2 cellule. La matrice de support fournit un support mécanique en permettant la fixation des cellules et la prolifération permet encore de la migration des cellules à travers les interstices d&#39;une construction cellulaire 3D. L&#39;échafaudage doit également permettre le transport de masse de nutriments cellulaires et pas inhiber l&#39;enlèvement des déchets métaboliques 3. Électrofilage a émergé comme un procédé prometteur pour la fabrication d&#39;échafaudages polymères capables de soutenir la croissance cellulaire de 4-6. Les fibres électrofilées non tissées produites sont appropriées pour la croissance cellulaire car elles sont souvent poreuses et permettent l&#39;interaction cellule-cellule, ainsi que la migration des cellules à travers les interstices d&#39;une construction 3D cellulaire 7. Il est important de surveiller la viabilité des cellules au cours de til période de culture et de faire en sorte que la viabilité cellulaire est maintenue tout au long de l&#39;ensemble de la construction 3D. Par exemple, des conditions de culture, tels que l&#39;oxygène et le pH nécessitent un contrôle soigneux, que les gradients de concentration de l&#39;analyte peut exister dans le produit de construction 3D. Bioréacteurs ou des systèmes de perfusion peuvent être utilisés pour mimer les conditions in vivo de débit interstitiel et en tant que résultat de l&#39;augmentation transfert des nutriments et l&#39;élimination des déchets du métabolisme 8. La question de savoir si ces systèmes sont en s&#39;assurant des conditions de micro constants peut être adressée en évaluant le microenvironnement cellulaire en temps réel. Les principaux paramètres de micro-environnement qui pourraient être surveillés en temps réel comprennent: la température, la composition chimique du support de cellules, la concentration de l&#39;oxygène dissous et le gaz carbonique, le pH et l&#39;humidité. Parmi ces paramètres, la température peut être plus facilement contrôlée en utilisant des sondes in situ. Méthodes de suivi des mesures énumérées restants couramment dansenlèvement de volve d&#39;une aliquote d&#39;échantillonnage et donc perturbent la culture cellulaire et d&#39;augmenter le risque de contamination. , Les méthodes en temps réel en continu sont recherchés. Méthodes actuelles de surveillance s&#39;appuient généralement sur des instruments qui sondent physiquement la construction cellulaire comme un moniteur de pH ou de la sonde d&#39;oxygène. Cependant, ces méthodes intrusives peuvent endommager la construction cellulaire et perturber l&#39;expérience en cours. Surveillance non invasive des concentrations de l&#39;analyte dans la construction 3D pourrait permettre un suivi en temps réel des différents aspects environnementaux tels que l&#39;épuisement des nutriments 9. Cela permettrait une évaluation de l&#39;apport de nutriments à l&#39;intérieur des régions plus profondes de la structure et déterminer si les déchets métaboliques a été éliminé efficacement 10,11. Les systèmes qui tentent de répondre à la question de l&#39;invasivité impliquent généralement l&#39;utilisation d&#39;une chambre de perfusion qui passe à travers un milieu de culture à la fois du récipient de culture et à des capteurs externes pour surveiller le pH, l&#39;oxygène et le glucose, 12. Lare un intérêt croissant dans le développement de capteurs qui peuvent être directement intégrées dans le récipient de culture qui ne nécessitent pas l&#39;élimination d&#39;une partie aliquote de l&#39;échantillonnage et en tant que tel serait d&#39;assurer une surveillance in situ. Pour remédier à ces lacunes pour in situ et de la surveillance non invasive des conditions micro-environnementales que nous avons incorporés analyte nanocapteurs sensibles dans les échafaudages électrofilées à produire des échafaudages d&#39;auto-déclaration 13. Les échafaudages qui agissent dispositifs comme de détection par contrôle de l&#39;activité de fluorescence ont été préparés préalablement, où le dispositif de détection est soit l&#39;échafaudage polymérique réelle créée par électrofilage ou par l&#39;utilisation d&#39;un colorant sensible à l&#39;analyte, qui est incorporé dans le polymère avant la formation de l&#39;échafaudage 14,15 . Cependant, ces dispositifs de détection ont le potentiel d&#39;améliorer les sorties optiques erronées causées par des interférences provenant d&#39;autres analytes possible. L&#39;utilisation d&#39;un dispositif de détection ratiométrique such que ceux préparés dans le protocole décrit détient le potentiel d&#39;éliminer ces effets indésirables possibles et apporter une réponse spécifique à l&#39;analyte en question. Les échafaudages électrofilées présentés ici ont été préparés à partir de poly co-polymère synthétique (acide lactique-co-glycolique) (PLGA), choisi en raison d&#39;avoir Food and Drug Administration (FDA), en raison de ses propriétés biodégradables et biocompatibles et une piste enregistrement de soutenir la croissance et la fonction des divers types de cellules 16 à 18. Les analytes quotientométrique nanocapteurs sensibles préparés sont sensibles au pH. Les nanocapteurs incorporent deux colorants fluorescents dans une matrice sol-gel biocompatible, où un colorant, FAM est sensible au pH et l&#39;autre, TAMRA agit comme étalon interne car il n&#39;est pas sensible aux pH. En outre, la fluorescence des deux FAM et TAMRA peut être analysé séparément car elles ne se chevauchent pas de manière significative. La détermination du rapport de la fluorescence de emission de deux colorants à des longueurs d&#39;onde spécifiques donne une réponse de pH indépendant d&#39;autres conditions environnementales. Les échafaudages d&#39;auto-déclaration pourraient permettre l&#39;évaluation de la répétition de pH in situ et en temps réel sans perturber le modèle 3D développé. Nous avons démontré que ces échafaudages sont capables de supporter la fixation et la prolifération cellulaire et restent sensibles à l&#39;analyte en question. La cinétique de sous-produits acides dans les constructions du génie reste peu étudié et en tant que tel en utilisant les réactifs pH échafaudages peuvent considérablement faciliter ces études 19. En outre, l&#39;utilisation des échafaudages d&#39;auto-déclaration pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire présente la possibilité de comprendre, surveiller et optimiser la croissance de modèle constructions de tissu 3D in vitro, de manière non invasive et en temps réel. Les pH nanocapteurs sensibles ont également été livrés à l&#39;environnement intracellulaire de fibroblastes cultivés sur électrofilé scaffol PLGAds. Le ratio de l&#39;émission de fluorescence à partir des colorants ont été utilisés pour surveiller le pHi et comparée à un échafaudage nanocapteurs Incorporation de pH d&#39;auto-vérification. La livraison des nanocapteurs de cellules cultivées dans un environnement 3D peut permettre la surveillance de la concentration de substance à analyser en profondeur dans le produit d&#39;assemblage d&#39;une manière non destructive. Par conséquent nanocapteurs peuvent être un outil d&#39;imagerie viable pour évaluer de façon non destructive comportement des cellules tout au long de 3D construit permettant l&#39;analyse à long terme. La sélection de la concentration en analyte de cellules individuelles au sein d&#39;une construction 3D pourrait assurer qu&#39;ils reçoivent en nutriments et en oxygène des concentrations suffisantes. paramètres du procédé de surveillance pourraient aider dans le développement de techniques normalisées pour le transport de masse efficace de l&#39;oxygène et de nutriments. La livraison des nanocapteurs à l&#39;environnement intracellulaire et l&#39;incorporation de nanocapteurs dans échafaudages polymères pourrait être combinée à permettre l&#39;évaluation de la viabilité des cellules ainsi que la performance de l&#39;échafaudage dans const 3Dructs au cours du processus de croissance de tissu. Cela peut conduire à une meilleure connaissance de ces constructions et progresser la fabrication de produits de remplacement de tissus biologiques pertinents.

<table><tbody><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylformamide anhydre (DMF)</td><td>Sigma</td><td>270547</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium 50 % (v/v) solution aqueuse</td><td>Alfa Aesar</td><td>35574</td><td>diluée à 30 % (v/v) avec de l’eau pure</td></tr><tr><td>TEOS</td><td>Sigma</td><td>13190-3</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>5-(et-6)-carboxyfluorescéine, ester succinimidylique (FAM-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1311</td><td></td></tr><tr><td>6-carboxytétraméthylrhodamine, ester succinimidylique (TAMRA-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique (0,2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique (0,2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Source Bioscience</td><td>Batch-213-101992</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rouge</td><td>Invitrogen</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus Ltd</td><td>DR50050</td><td></td></tr><tr><td>Azote gazeux</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica TCS-SP</td><td></td><td>équipé de lasers à argon et krypton et d’une lentille d’immersion dans l’eau 63X 0.9NA</td></tr><tr><td>Lumière UV</td><td>UVLS28 UVP, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’agitation</td><td>SB161-3 Jencons-PLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-mètre</td><td>Jenway modèle 3510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>Buchi Rotary Centrifugeuse d’évaporateur R200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(nanocapteurs)</td><td>Centrifugeuse Hermle Z300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(culture cellulaire)</td><td>Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Whirlimixer Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>FB11021 Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Université de Nottingham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 35mm</td><td>Iwaki</td><td>3000035</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 10 ml</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3 Cellules fibroblastiques</td> Collection <td>européenne de cultures</td><td></td><td></td>cellulaires</tr><tr><td>PLGA</td><td>Lakeshore Biomaterials</td><td>7525 DLG 7E</td><td></td></tr><tr><td>Formate de pyridinium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8535</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr></tbody></table>

les échafaudages auto-déclaration pour les 3-dimensional culture cellulaire

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

La culture de cellules en 3D sur des échafaudages appropriés est pensé pour mieux imiter le microenvironnement in vivo et augmenter les interactions cellule-cellule. La construction cellulaire 3D obtenu peut souvent être plus pertinent d&#39;étudier les événements moléculaires et interactions cellule-cellule que des expériences similaires étudiés en 2D. Pour créer des cultures 3D efficaces avec la viabilité cellulaire élevée tout au long de l&#39;échafaud les conditions de culture tels que l&#39;oxygène et le pH ont besoin d&#39;être soigneusement contrôlé que les gradients de concentration de l&#39;analyte peuvent exister tout au long de la construction 3D. Nous décrivons ici des procédés de préparation de pH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel et leur incorporation dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées ainsi que leur préparation ultérieure pour la culture de cellules de mammifères. Les échafaudages pH sensibles peuvent être utilisés comme outils pour déterminer microenvironnement pH dans une construction cellulaire 3D. En outre, nous détaillons la livraison de pH nanose sensiblensors à l&#39;environnement intracellulaire de cellules de mammifères dont la croissance a été soutenue par des échafaudages PLGA électrofilé. La localisation cytoplasmique des pH nanocapteurs sensibles peut être utilisé pour contrôler le pH intracellulaire (pHi) lors de l&#39;expérimentation en cours.

La distribution de taille des pH nanocapteurs sensibles préparés a été caractérisé par MEB, où la population de nanocapteurs imagées ont été mesurés et ont des dimensions nanométriques dans la gamme de 240 à 470 nm (figure 1A). La réalisation d&#39;un petit diamètre et assez petit est conforme à l&#39;aide de la méthode Stöber pour préparer des nanoparticules. Il a été trouvé que l&#39;utilisation d&#39;un environnement à pH basique au cours de la synthèse de nanoparticules IE nanoparticules pr...

PH biocompatibles adaptés nanocapteurs sol-gel peuvent être incorporés dans le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) échafaudages électrofilées. Les échafaudages d&#39;auto-déclaration produits peuvent être utilisés pour la surveillance in situ des conditions micro-environnementales dans tout la culture de cellules sur l&#39;échafaud. Cela est bénéfique que la construction cellulaire 3D peut être contrôlé en temps réel sans perturber l&#39;expérience.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des nanocapteurs sensibles au pH et des supports autorévélateurs pouvant être surveillés en temps réel et in situ afin de contribuer à la compréhension des conditions influençant la croissance cellulaire. Cela est réalisé en premier lieu en préparant des nanocapteurs biocompatibles sensibles à un analyte, capables de mesurer le pH par des signaux de fluorescence. Dans un deuxième temps, les nanocapteurs sensibles au pH sont intégrés à des supports polymères électrofilés, formant un environnement tridimensionnel sur lequel des cellules peuvent être cultivées et surveillées.Ensuite, des cellules mammaliennes sont placées sur des échafaudages électrofilés et des nanosenseurs sont également introduits dans leur environnement intracellulaire afin de surveiller le pH intracellulaire. Au cours de l'expérimentation, des résultats sont obtenus qui démontrent la capacité des nanosenseurs intracellulaires et des échafaudages autorapporteurs à suivre le pH dans des environnements de tissus ingénierisés, basée sur les rapports de fluorescence acquis par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux mét

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous présentons deux procédés pour la microfabrication de puces polymère poreux pour la culture cellulaire en trois dimensions. Le premier est gaufrage à chaud combiné avec un processus de soudage à la vapeur de solvant. Le second utilise un procédé développé récemment microthermoforming combinée à la technologie d'ions piste menant à une simplification significative de la fabrication.

La microfabrication de Chip entreprises Échafaudages pour la culture cellulaire en trois dimensions

Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour la fabrication d’une plate-forme émergente de culture d’hépatocytes tridimensionnels, l’échafaudage à cristaux colloïdaux inversés et les techniques concomitantes pour évaluer le comportement des hépatocytes. Les pores contrôlables en taille contrôlée, l’interconnectivité et la capacité à conjuguer les protéines de la matrice extracellulaire à l’échafaudage du poly(éthylène glycol) (PEG) améliorent les performances des cellules Huh-7.5.

Fabrication de Inverted colloïdal cristal Poly (éthylène glycol) Échafaudages: Une cellule plate-forme en trois dimensions de la culture pour l&#39;ingénierie tissulaire du foie

Ici, nous décrivons un protocole rapide et flexible pour la formation de sphéroïdes cellulaires 3D par agrégation cellulaire. Il s’adapte facilement à plusieurs types de cellules et peut être utilisé dans une variété d’applications, notamment la migration cellulaire, l’invasion ou les tests d’anoïkis, ainsi que pour l’imagerie et la quantification des interactions cellule-matrice.

Une méthode d&#39;agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des systèmes 3D-culture en auto-assemblage peptide échafaudages pour promouvoir la différenciation des chondrocytes articulaires humains dédifférenciées en tissu cartilagineux.

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

Cet article énumère les étapes nécessaires pour ensemencer des lignées cellulaires de neuroblastome sur des échafaudages tridimensionnels à base de collagène décrits précédemment, maintenir la croissance cellulaire pendant une période prédéterminée et récupérer des échafaudages pour plusieurs analyses de croissance cellulaire et de comportement cellulaire et applications en aval, adaptables pour répondre à une gamme d’objectifs expérimentaux.

Modèle biomimétique in vitro tridimensionnel de neuroblastome à l’aide d’échafaudages à base de collagène

Ce protocole détaille une méthode pour la production de trois types différents de sphéroïdes d’une manière qui les rend adaptés au criblage et à l’analyse à grande échelle à haute teneur. En outre, des exemples sont présentés montrant comment ils peuvent être analysés au niveau des sphéroïdes et des cellules individuelles.

Une méthode robuste pour la production à grande échelle de sphéroïdes pour les applications de criblage et d’analyse à haute teneur

La minimisation de la variabilité de la fraction de particules dans les échafaudages granulaires facilite l’expérimentation reproductible. Ce travail décrit des méthodes de génération d’échafaudages granulaires avec des fractions de particules contrôlées pour des applications d’ingénierie tissulaire in vitro .

Contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3D

Nous présentons un protocole de culture de sphéroïdes hautement reproductibles et leur caractérisation phénotypique par capture d’images et protéomique.

Analyse phénotypique semi-automatisée de cultures fonctionnelles de cellules sphéroïdes 3D

Les sphéroïdes cellulaires ont été considérés comme un modèle potentiel dans le domaine des applications biologiques. Cet article décrit les protocoles permettant de générer de manière évolutive des sphéroïdes cellulaires à l’aide d’un dispositif d’assemblage acoustique 3D, qui fournit une méthode efficace pour la fabrication robuste et rapide de sphéroïdes cellulaires uniformes.

Dispositif d’assemblage acoustique tridimensionnel pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires

Il existe un besoin critique de modèles de cancer 3D qui capturent la diaphonie hétérocellulaire pour étudier les métastases cancéreuses. Notre étude présente la génération d’épithélium stromal hétéromulticellulaire dans un environnement sans échafaudage qui peut être utilisé pour étudier l’invasion et les distributions spatiales cellulaires.

Cellules stromales hétéromulticellulaires dans des cultures 3D sans échafaudage de cellules cancéreuses épithéliales pour stimuler l’invasion

Découvrez la fabrication de nanocapteurs pH-réactifs intégrés dans des échafaudages PLGA pour la culture cellulaire 3D. Cette méthode permet le suivi en temps réel et in situ du microenvironnement cellulaire sans perturbation.

Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

Explorer plus de vidéos