Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

L’objectif global de l’expérience suivante est de produire des nanocapteurs sensibles au pH et des échafaudages auto-déclarés qui peuvent être surveillés en temps réel et in situ afin d’aider à la compréhension des conditions qui influencent la croissance cellulaire. Pour ce faire, il faut d’abord préparer des nanocapteurs biocompatibles sensibles aux analytes, qui peuvent surveiller le pH grâce aux sorties de fluorescence. Dans un deuxième temps, des nanocapteurs sensibles au pH sont incorporés dans des échafaudages électro-filés polymères formant un environnement 3D sur lequel les cellules peuvent être cultivées et surveillées.

Ensuite, les cellules de mammifères sont installées sur les échafaudages électro-tissés et des nanocapteurs sont également livrés dans leur environnement intracellulaire afin de surveiller le pH intracellulaire. Au cours de l’expérimentation, des résultats sont obtenus qui montrent la capacité des nanocapteurs intracellulaires et des échafaudages auto-déclarés à surveiller le pH dans des environnements issus de l’ingénierie tissulaire sur la base des rapports de fluorescence acquis par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’utilisation de sondes de pH électroniques, est que les mesures peuvent être effectuées in situ et en temps réel sans avoir à perturber la croissance cellulaire.

Pour commencer, préparez les fluorophores en dissolvant 1,5 milligramme de fam SE dans un millilitre de diméthylformamide connu sous le nom de DMF dans un fond rond. Le flacon dissout également 1,5 milligramme de Tamara SE dans un millilitre de DMF dans un deuxième flacon. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de trois amino propyl triéthyle dans chaque flacon et remuez continuellement dans l’obscurité sous une atmosphère d’azote sec à 21 degrés Celsius pendant 24 heures.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres des deux solutions de colorant à un mélange contenant six millilitres d’éthanol et quatre millilitres d’hydroxyde d’ammonium contenu dans une fiole à fond rond. Remuez ce nouveau mélange à 21 degrés Celsius après une heure. Ajoutez lentement 0,5 millilitre de silicate de tétraéthyle orthos au mélange et continuez à remuer pendant encore deux heures.

Pendant ce temps, attendez-vous à ce que le mélange devienne trouble, puis collectez les nanocapteurs par évaporation rotative et stockez-les dans un flacon en verre à quatre degrés Celsius pour une utilisation future. Ensuite, ajoutez les nanocapteurs de pH séchés à cinq milligrammes par millilitre dans les tampons phosphate de Sorenson, allant de pH 5,5 à pH 7,5 par incréments de pH 0,5. Remettez les nanocapteurs en suspension en faisant tourbillonner les échantillons pendant trois minutes, puis sonisez-les pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que la solution devienne trouble.

Collectez les données d’étalonnage en mesurant les échantillons à une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres pour FAM et 568 nanomètres. Pour Tamara, collectez les émissions à 500 à 530 nanomètres pour FAM et 558 à 580 nanomètres pour Tamara, et calculez le rapport des maxima d’émission produits à chaque valeur de pH. Ensuite, préparez l’échantillon pour l’imagerie MEB en plaçant un échantillon de nanocapteurs sur un microscope électronique recouvert de carbone, en recouvrant les particules d’or pendant cinq minutes sous une atmosphère d’argon.

Une fois enrobés, placez les échantillons dans le microscope électronique et ajustez la distance de travail, la tension et le grossissement pour minimiser la charge d’électrons et produire les meilleures images dans une hotte. Préparez une solution PLGA à 20 % dans du chlorométhane avec 1 % de formiate de périnée. Chargez la solution dans une seringue de 10 millilitres à l’aide d’une aiguille de remplissage émoussée de calibre 18 et ajustez-la solidement sur un tire-seringue.

Cette solution sera utilisée pour faire en sorte que les échafaudages de contrôle PLGA éloignent la pointe de l’aiguille de 20 centimètres d’une plaque collectrice en aluminium de 20 x 15 centimètres, et fixent l’électrode d’une alimentation haute tension à l’extrémité de la seringue et mettent le fil à la terre sur la plaque collectrice en aluminium. Ensuite, allumez l’alimentation électrique et ajustez la tension à 12 kilovolts. Ensuite, allumez le pousse-seringue et administrez la solution en utilisant un débit constant de 3,5 millilitres par heure pendant deux heures.

Cela produira une profondeur d’échafaudage d’environ 60 microns. Une fois terminé, éteignez l’équipement et laissez l’échafaudage dans la hotte pendant 24 heures pour permettre aux résidus de solvant de s’évaporer. Pour préparer des échafaudages incorporés avec des nanocapteurs sensibles au pH, préparez la solution PLGA comme précédemment, mais cette fois ajoutez également cinq milligrammes par millilitre de nanocapteurs.

Ensuite, électro spin le pH réactif en utilisant les mêmes paramètres que précédemment. Ensuite, calibrez la réactivité au pH de l’échafaudage en plaçant de petits échantillons de l’échafaudage séché avec des nanocapteurs incorporés dans des plaques de culture de 35 millimètres et en les immergeant dans deux millilitres de tampons de phosphate de sorensen entre pH 5,5 et 7,5 par incréments de 0,5 sur un microscope confocal. Utilisez un laser à argon de 488 nanomètres pour exciter FAM et un laser à krypton de 568 nanomètres pour exciter Tamara dans les nanocapteurs.

Observez l’émission à 500 à 530 nanomètres pour FAM et 558 à 580 nanomètres pour Tamara, puis calculez le rapport des maxima d’émission produits à chaque valeur de pH. Tout d’abord, stérilisez les surfaces des échafaudages avec une source de lumière UV à une distance de huit centimètres pendant 15 minutes de chaque côté. Ensuite, transférez stérilement les échafaudages sur une plaque de culture à 12 puits et placez un anneau en acier d’un diamètre intérieur d’un centimètre et d’un diamètre extérieur de deux centimètres sur l’échafaudage.

Ensuite, ajoutez du PBS avec une bande de stylo à 5 % à l’intérieur et à l’extérieur de l’anneau en acier et incubez les échantillons pendant la nuit. Le lendemain. Retirez le PBS avec 5 % de streptocoque et lavez les échafaudages avec du PBS.

Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieu de culture cellulaire à l’intérieur et à l’extérieur de l’anneau en acier et préchauffez la plaque dans un incubateur. Ensuite, récoltez les cellules d’intérêt et préparez une suspension cellulaire d’un fois 10 à six cellules par millilitre. Lorsque les cellules sont prêtes, retirez le média du puits et ajoutez un millilitre de média frais à l’extérieur de l’anneau en acier.

Ajoutez ensuite 300 microlitres de suspension cellulaire à l’intérieur de l’anneau en acier et balancez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 et incubez les cellules aussi longtemps que nécessaire. Rafraîchir le milieu tous les deux à trois jours Semez les cellules sur les échafaudages comme décrit dans la section précédente, et laissez-les croître sans interruption pendant 72 heures.

Ensuite, rincez les cellules avec du PBS et ajoutez 500 microlitres de milieu sans sérum à l’extérieur de l’anneau et 300 microlitres à l’intérieur de l’anneau. Incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius pendant l’incubation. Préparez la solution A en ajoutant cinq milligrammes de nanocapteurs avec 50 microlitres d’optimum et en forniquant brièvement.

Ensuite, mélangez la solution B en ajoutant cinq microlitres de lipectomie 2000 à 45 microlitres d’Optum, et laissez le mélange incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez la solution A au mélange de solution B, puis incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour former la solution C, qui est le complexe de liposomes du nanocapteur. Retirez la plaque de l’incubateur et ajoutez 100 microlitres de la solution complexe à l’intérieur de l’anneau en acier.

Ensuite, remettez la plaque dans l’incubateur et incubez les cellules avec les complexes de réactifs de lipectomie pendant trois heures après l’incubation. Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS chauffé avant d’immerger l’échafaudage assis dans des tampons de différents phs pour surveiller la réponse des nanocapteurs. Maintenant, à l’intérieur des cellules, imagez les cellules à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence pour suivre l’emplacement des nanocapteurs dans les cellules de mammifères.

Tout d’abord, préparez et livrez uniquement des nanocapteurs contenant des fam aux cellules assises sur des échafaudages PLGA. Ajoutez ensuite deux microlitres de 50 nano molaires lyo tracker rouge à 300 microlitres de milieu et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius après la période d’incubation. Retirez le support et lavez les cellules deux fois avec du PBS.

Ajoutez ensuite deux microlitres de PBS ou un autre milieu sans rouge de phénol pour couvrir les cellules pendant l’imagerie confocale. Ensuite, ajoutez cinq micromolaires de la coloration nucléaire, en appliquez cinq au PBS et incubez avec les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Après trois minutes, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la sur la platine confocale pour l’imagerie de l’image, les organites acides des nanocapteurs et le noyau en utilisant diverses longueurs d’onde d’excitation et d’émission comme décrit dans le protocole de texte ci-joint tout en utilisant un balayage séquentiel pour éviter la collecte de longueurs d’onde d’excitation, la distribution de taille des nanocapteurs sensibles au pH préparés a été caractérisée à l’aide de MEB où la population de nanocapteurs imagés a été mesurée et s’est avérée ont des dimensions nanométriques de l’ordre de 240 à 470 nanomètres.

Sur la gauche, on voit une image de fibres PLGA filées électros, et sur la droite, on voit des fibres PLGA électro-filées avec des nanocapteurs. Les micrographies MEB des fibres fournissent des preuves de l’association de nanocapteurs à la surface des fibres. Cependant, ils peuvent également être incorporés dans les fibres de l’échafaudage.

Une fois que les électrocapteurs ont tourné, les nanocapteurs conservent leur capacité à rester optiquement et chimiquement actifs et sont montrés ici associés aux fibres de l’échafaudage. À gauche, la teinture fam est indiquée en vert, et à droite, la teinture Tamara est représentée en rouge. Le rapport d’intensité fluorescente produit une courbe d’étalonnage comme indiqué ici.

Les nanocapteurs évalués seuls et lorsqu’ils étaient incorporés dans des échafaudages PLGA filés électrostatiquement se reflétaient les uns les autres, démontrant que les nanocapteurs conservent leur activité optique après leur incorporation dans les échafaudages. Les nanocapteurs intégrés réagissent également bien de manière réversible aux variations de valeurs de pH, car le tampon a été alterné entre un pH de 5,5 et 7,5. Comme on pouvait s’y attendre, le ratio Tamra a répondu de manière prévisible à chaque fois qu’il était indiqué.

Voici des images confocales de fibroblastes dont les nanocapteurs étaient délivrés par voie intracellulaire via un réactif de transfection. La colocalisation ponctuée des colorants fam et Tamara suggère que les colorants sont restés piégés dans la matrice du nanocapteur. L’administration intracellulaire des nanocapteurs peut être confirmée en mesurant le rapport fam Tamara des cellules placées dans divers tampons.

Comme vous pouvez le voir ici, le rapport augmente lors de la mesure des nanocapteurs basés sur un échafaudage, mais reste stable lors de la mesure des capteurs à l’intérieur des cellules. Après le développement de cette technique, les chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire peuvent investiguer in situ et en temps réel. Le pH intracellulaire microenvironnemental change dans les constructions cellulaires 3D sans perturber l’expérience en cours.