Les échafaudages auto-déclaration pour les 3-Dimensional Culture cellulaire

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des nanocapteurs sensibles au pH et des supports autorévélateurs pouvant être surveillés en temps réel et in situ afin de contribuer à la compréhension des conditions influençant la croissance cellulaire. Cela est réalisé en premier lieu en préparant des nanocapteurs biocompatibles sensibles à un analyte, capables de mesurer le pH par des signaux de fluorescence. Dans un deuxième temps, les nanocapteurs sensibles au pH sont intégrés à des supports polymères électrofilés, formant un environnement tridimensionnel sur lequel des cellules peuvent être cultivées et surveillées.

Ensuite, des cellules mammaliennes sont placées sur des échafaudages électrofilés et des nanosenseurs sont également introduits dans leur environnement intracellulaire afin de surveiller le pH intracellulaire. Au cours de l'expérimentation, des résultats sont obtenus qui démontrent la capacité des nanosenseurs intracellulaires et des échafaudages autorapporteurs à suivre le pH dans des environnements de tissus ingénierisés, basée sur les rapports de fluorescence acquis par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'utilisation de sondes électroniques de pH, est que les mesures peuvent être effectuées in situ et en temps réel sans perturber la croissance cellulaire.

Pour commencer, préparez les fluorophores en dissolvant 1,5 milligramme de FAM SE dans un millilitre de diméthylformeamide, appelé DMF, dans un ballon à fond rond. Dissolvez également 1,5 milligramme de TAMRA SE dans un millilitre de DMF dans un second ballon. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de triéthoxypropylamine à chaque ballon et agitez en continu à l’abri de la lumière, sous une atmosphère d’azote sec, à 21 degrés Celsius pendant 24 heures.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres des deux solutions colorantes à un mélange contenant six millilitres d'éthanol et quatre millilitres d'hydroxyde d'ammonium placés dans un ballon à fond rond. Agitez ce nouveau mélange à 21 degrés Celsius après une heure. Ajoutez lentement 0,5 millilitre de tétraéthoxysilane au mélange, puis continuez à agiter pendant deux heures supplémentaires.

Pendant ce temps, prévoir que le mélange devienne trouble, puis récupérer les nanosenseurs par évaporation rotative et les conserver dans un flacon en verre à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Ensuite, ajouter les nanosenseurs de pH séchés à une concentration de cinq milligrammes par millilitre dans des tampons phosphates de Sorenson, allant de pH 5,5 à pH 7,5 par incréments de pH 0,5. Resuspendre les nanosenseurs en vortexant les échantillons pendant trois minutes, puis les soniquer pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que la solution devienne trouble.

Recueillir les données d'étalonnage en mesurant les échantillons à une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres pour le FAM et de 568 nanomètres pour Tamara. Pour Tamara, recueillir les émissions entre 500 et 530 nanomètres pour le FAM et entre 558 et 580 nanomètres pour Tamara, puis calculer le rapport des maxima d'émission obtenus à chaque valeur de pH. Ensuite, préparer l'échantillon pour l'imagerie en MEV en déposant un échantillon de nanocapteurs sur une embase de microscope électronique recouverte de carbone, puis en recouvrant les particules par pulvérisation cathodique d'or pendant cinq minutes sous une atmosphère d'argon.

Une fois revêtus, placer les échantillons dans le microscope électronique et régler la distance de travail, la tension et le grossissement afin de minimiser la charge électronique et obtenir les meilleures images sous une hotte. Préparer une solution de 20 % de PLGA dans le dichlorométhane avec 1 % de formiate de péridinium. Charger la solution dans une seringue de 10 millilitres munie d'une aiguille de remplissage émoussée de calibre 18 et la fixer solidement sur une pompe à seringue.

Cette solution sera utilisée pour fabriquer des échafaudages PLGA témoins. Placez la pointe de l'aiguille à 20 centimètres d'une plaque de collecte en aluminium mesurant 20 sur 15 centimètres, reliez l'électrode d'une alimentation haute tension à la pointe de la seringue et reliez le fil de masse à la plaque de collecte en aluminium. Ensuite, allumez l'alimentation et réglez la tension à 12 kilovolts. Puis, mettez en marche la pompe à seringue et délivrez la solution à un débit constant de 3,5 millilitres par heure pendant deux heures.

Cela produira une profondeur de l'échafaudage d'environ 60 micromètres. Une fois terminé, éteignez l'appareil et laissez l'échafaudage dans la hotte aspirante pendant 24 heures afin que les résidus de solvant s'évaporent. Pour préparer des échafaudages incorporant des nanocapteurs sensibles au pH, préparez la solution de PLGA comme précédemment, mais ajoutez cette fois cinq milligrammes par millilitre de nanocapteurs.

Ensuite, électrofilerez le matériau sensible au pH en utilisant les mêmes paramètres qu'auparavant. Puis, étalonnez la sensibilité au pH du support en plaçant de petits échantillons du support séché contenant les nanosenseurs dans des plaques de culture de 35 millimètres et en les immergeant dans deux millilitres de tampons phosphate de Sørensen, dont le pH varie de 5,5 à 7,5 par incréments de 0,5, sur un microscope confocal. Utilisez un laser à argon de 488 nanomètres pour exciter le FAM et un laser au krypton de 568 nanomètres pour exciter Tamara à l'intérieur des nanosenseurs.

Observer l'émission à 500 à 530 nanomètres pour le FAM et à 558 à 580 nanomètres pour Tamara, puis calculer le rapport des maxima d'émission produits à chaque valeur de pH. Tout d'abord, stériliser les surfaces des échafaudages à l'aide d'une source de lumière UV à une distance de huit centimètres pendant 15 minutes de chaque côté. Ensuite, transférer stérilement les échafaudages dans une plaque de culture de 12 puits et placer un anneau en acier d'un diamètre intérieur d'un centimètre et d'un diamètre extérieur de deux centimètres au-dessus de l'échafaudage.

Ensuite, ajouter du PBS avec 5 % de pénicilline-streptomycine à l'intérieur et à l'extérieur de l'anneau en acier et incuber les échantillons toute la nuit. Le jour suivant, retirer le PBS contenant 5 % de pénicilline-streptomycine et laver les supports avec du PBS.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu de culture cellulaire à l'intérieur et à l'extérieur de l'anneau en acier et préchauffez la plaque dans un incubateur. Puis, récoltez les cellules d'intérêt et préparez une suspension cellulaire contenant un fois dix puissance six cellules par millilitre. Lorsque les cellules sont prêtes, retirez le milieu du puits et ajoutez un millilitre de milieu frais à l'extérieur de l'anneau en acier.

Ensuite, ajouter 300 microlitres de la suspension cellulaire à l'intérieur de l'anneau en acier et agiter doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules. Placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2, et incuber les cellules pendant la durée requise. Renouveler le milieu tous les deux à trois jours, semer les cellules sur les supports comme décrit dans la section précédente, et les laisser croître sans interruption pendant 72 heures.

Ensuite, rincez les cellules avec du PBS et ajoutez 500 microlitres de milieu sans sérum à l'extérieur de l'anneau et 300 microlitres à l'intérieur de l'anneau. Incubez la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius pendant l'incubation. Préparez la solution A en ajoutant cinq milligrammes des nanocapteurs à 50 microlitres d'OptiMEM et en vortexant brièvement.

Ensuite, préparer la solution B en ajoutant cinq microlitres de lipectomy 2000 à 45 microlitres d'Optum, puis laisser le mélange incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter ensuite la solution A au mélange B, puis incuber à température ambiante pendant 20 minutes afin d'obtenir la solution C, qui correspond au complexe de liposomes nanosenseurs. Retirer la plaque de l'incubateur et ajouter 100 microlitres du complexe à l'intérieur de l'anneau en acier.

Ensuite, remettez la plaque dans l'incubateur et incubez les cellules avec les complexes de réactif de lipolyse pendant trois heures après l'incubation. Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS réchauffé avant d'immerger la matrice contenant les cellules dans des tampons de différents pH afin de surveiller la réponse des nanosenseurs. À l'intérieur des cellules, réalisez l'imagerie des cellules par microscopie confocale à fluorescence pour suivre la localisation des nanosenseurs au sein des cellules de mammifères.

Tout d'abord, préparez et ajoutez uniquement les fam contenant les nanosenseurs aux cellules cultivées sur des supports en PLGA. Ensuite, ajoutez deux microlitres de lyo tracker red à 50 nanomolaires à 300 microlitres de milieu et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius après la période d'incubation. Retirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de PBS ou d'un autre milieu sans rouge de phénol pour recouvrir les cellules pendant l'imagerie confocale. Puis, ajoutez cinq micromoles du colorant nucléaire drac cinq au PBS et incubez avec les cellules pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Après trois minutes, retirez la plaque de l'incubateur et placez-la sur la platine confocale pour l'imagerie, en visualisant les nanosenseurs, les organites acides et le noyau à l'aide de différentes longueurs d'onde d'excitation et d'émission, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant, tout en utilisant un balayage séquentiel afin d'éviter la détection des longueurs d'onde d'excitation. La distribution de taille des nanosenseurs sensibles au pH préparés a été caractérisée par MEB, où la population de nanosenseurs imagés a été mesurée et s'est révélée avoir des dimensions nanométriques comprises entre 240 et 470 nanomètres.

À gauche, on voit une image de fibres de PLGA obtenues par électrofilage, et à droite, des fibres de PLGA obtenues par électrofilage contenant des nanocapteurs. Les microphotographies au MEB des fibres fournissent des preuves de l'association des nanocapteurs à la surface des fibres. Toutefois, ceux-ci peuvent également être intégrés à l'intérieur des fibres du support.

Une fois électrofilés, les nanocapteurs conservent leur capacité à rester optiquement et chimiquement actifs et sont ici associés aux fibres du support. À gauche, la teinture fam apparaît en vert, et à droite, la teinture Tamara apparaît en rouge. Le rapport d'intensité fluorescente produit une courbe d'étalonnage telle qu'illustrée ici.

Les nanosenseurs évalués seuls et lorsqu'ils étaient intégrés à des échafaudages en PLGA électrofilés se reflétaient mutuellement, démontrant que les nanosenseurs conservent leur activité optique après incorporation dans les échafaudages. Les nanosenseurs intégrés réagissaient également de manière réversible aux variations du pH lorsque le tampon alternait entre un pH de 5,5 et 7,5. Le rapport fam Tamra a répondu de façon prévisible à chaque fois.

Voici des images confocales de fibroblastes ayant reçu des nanosenseurs intracellulairement par l'intermédiaire d'un réactif de transfection. La colocalisation ponctuelle des colorants fam et Tamara suggère que les colorants sont restés piégés dans la matrice du nanosenseur. La livraison intracellulaire des nanosenseurs peut être confirmée en mesurant le rapport fam/Tamara de cellules placées dans divers tampons.

Comme vous pouvez le constater ici, le rapport augmente lors de la mesure des nanosenseurs basés sur des échafaudages, mais reste stable lors de la mesure des capteurs à l'intérieur des cellules. Après le développement de cette technique, les chercheurs dans le domaine du génie tissulaire pourront étudier en temps réel et in situ les variations du pH intracellulaire dans l'environnement microscopique des constructions cellulaires tridimensionnelles, sans perturber l'expérience en cours.