Impression Moules Reverse thermosensible pour la création de motifs d'hydrogels à deux composants pour la culture cellulaire 3D

L’objectif global de cette procédure est d’imprimer un moule inversé pour créer des hydrogels à deux composants pour la culture cellulaire 3D. Ceci est accompli en imprimant d’abord un moule inversé à partir d’un polymère thermo-réversible, qui est un liquide à quatre degrés Celsius, mais un gel mou à température ambiante. Ce moule inversé peut ensuite être éludé.

La deuxième étape consiste à remplir le moule inversé avec un biopolymère de votre choix. Ici, nous avons utilisé aros. Le biopolymère peut être réticulé par réticulation enzymatique, UV ou thermique.

Ensuite, le moule inversé est El allusion en immergeant le moule dans de l’eau froide. Après cette étape, le moule AROS résultant est prêt pour un traitement ultérieur. La dernière étape consiste à remplir les vides avec un deuxième biopolymère, qui pourrait contenir des cellules et peut être réticulé au moyen d’enzymes, de lumière UV ou de température.

En fin de compte, nous avons mis au point une méthode reproductible pour créer des échafaudages de culture de cellules D organisés dans l’espace. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsqu’un collègue a suggéré que nous pourrions tirer parti des propriétés thermosensibles de l’Oxr en l’utilisant comme moule sacrificiel. La démonstration de la procédure sera faite par Misha Muah, un étudiant diplômé de mon laboratoire.

Pour commencer, ajoutez 60 millilitres de solution PBS glacée dans une bouteille en verre et remuez vigoureusement à l’aide d’un brassage magnétique. Ensuite, pesez 24,5 grammes de Paul ER et ajoutez-le en petites quantités au PBS froid. Attendez que le Paul Oxr se soit partiellement dissous dans le PBS avant d’en ajouter d’autres.

Continuez à remuer la solution jusqu’à ce que tout Paul Oxr soit dissous. Ensuite, ajoutez du PBS glacé supplémentaire jusqu’à ce qu’un volume final de 100 millilitres soit atteint, produisant une concentration finale de 24,5 % en poids par volume. Remuez ensuite le mélange jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé.

Arrêtez de remuer la solution et laissez-la reposer à quatre degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à ce que les bulles et la mousse dans la solution aient disparu. Les bulles qui sont piégées dans le gel sont transférées dans la cartouche de l’imprimante et entraîneront des défauts dans les moules sacrificiels imprimés. Filtrez la solution directement dans la cartouche d’impression à l’aide d’un filtre de pré-refroidissement pour éliminer toutes les particules indésirables qui pourraient obstruer l’aiguille.

Conservez la cartouche à quatre degrés Celsius jusqu’à 30 minutes avant l’expérience. Préparez l’électrovanne et l’aiguille pour l’impression en les plaçant dans des microtubes à centrifuger séparés de 1,5 millilitre remplis d’eau ultrapure et en les syndiquant pendant 30 minutes. Rincez ensuite les vannes nettoyées avec de l’éthanol et séchez-les avec un pistolet à azote.

Ensuite, installez l’électrovanne et l’aiguille propres dans l’imprimante. Installez également une cartouche d’impression vide et propre pour tester le système. Appliquez une pression de trois bars sur le système et soufflez tous les liquides résiduels de la vanne installée et de l’aiguille avec de l’air comprimé.

Pour les petits diamètres d’aiguilles. Installez un filtre à la sortie de l’air comprimé pour éviter l’entrée de petites particules qui pourraient obstruer l’aiguille. Ensuite, coupez la pression.

Lorsque la pression est tombée à zéro, installez la cartouche préchargée avec le poly oxr. La cartouche doit être sortie du réfrigérateur environ 30 minutes avant de monter la cartouche afin que le polyoxr encore liquide puisse atteindre la température ambiante et le gel avant l’impression. Vérifiez si le poly oxr est éjecté en retournant la cartouche.

Ensuite, appliquez trois bars de pression sur le système et distribuez Paul Emer jusqu’à ce qu’il atteigne la pointe de l’aiguille et soit extrudé en un brin continu. À l’aide du logiciel de CAO bio, tracez une seule ligne à peu près de la même longueur que la structure que vous avez l’intention d’imprimer dans le menu des paramètres du logiciel de l’imprimante. Réglez l’électrovanne sur une fréquence élevée de 50 hertz dans la section des paramètres et réglez à la main le réglage haute pression sur trois bars.

Ensuite, placez un microscope en verre, glissez-le dans l’imprimante et fixez-le en place en allumant l’aspirateur. Imprimez ensuite une couche d’une seule ligne à une vitesse de scène de 300 millimètres par minute. Obtenez la largeur de ligne souhaitée en réduisant la pression à la main et les paramètres de fréquence dans le logiciel pour chaque nouvelle ligne, assurez-vous que la ligne reste continue.

Si la ligne tracée est rompue, la limite inférieure a été atteinte. Une fois qu’une ligne continue de la largeur souhaitée est atteinte, déterminez la vitesse de scène et l’épaisseur de couche optimales en vérifiant les défauts dans les constructions imprimées. Afin d’affiner l’épaisseur de la couche, il peut également être nécessaire de légèrement réajuster la pression et la fréquence.

Afin de tester le réglage de l’épaisseur de la couche, imprimez plusieurs couches les unes sur les autres et assurez-vous que l’aiguille est dans la bonne position au-dessus de la couche précédente. Ajustez l’épaisseur de la couche de sorte que chaque couche soit imprimée directement sur la précédente. Pour optimiser la vitesse de la scène, commencez par diminuer la vitesse de la scène de 300 millimètres par minute par étapes, de sorte que les couches extrudées commencent et se terminent aux mêmes positions que les précédentes.

Si la scène se déplace trop vite, un motif ondulé apparaîtra en haut du calque. Pour l’impression de structures de piliers, tracez un seul point au lieu d’une ligne dans le logiciel de CAO. Ajustez ensuite la pression et la fréquence pour réguler l’épaisseur de la couche et le diamètre du pilier ainsi que le temps de pas de la tête d’impression afin de maximiser la vitesse d’impression.

Une fois optimisés, enregistrez les paramètres pour une utilisation ultérieure. Tout d’abord, imprimez la structure interne telle que ce réseau de piliers sur une lame de microscope en verre et laissez-la sécher. Le séchage de nuit réduit la taille et l’épaisseur des structures et offre une meilleure adhérence entre la structure et le substrat.

Le lendemain, dessinez une structure qui consiste en un mur extérieur entourant les structures que vous avez l’intention d’évader et de remplir. La paroi en polymère doit être imprimée à au moins 3,5 millimètres des structures internes en raison des dimensions de l’aiguille. Ensuite, préparez un mélange de 1 % d’aros dans de l’eau déminéralisée en le chauffant au micro-ondes une fois complètement dissous.

Refroidissez la solution agricole entre 35 et 45 degrés Celsius. Remplissez ensuite le moule sacrificiel avec la solution agricole à l’aide d’une pipette. Cela doit être fait lentement pour éviter la destruction de la structure à l’intérieur du mur.

Une fois rempli, placez le moule à quatre degrés Celsius pour solidifier le gel. Après environ 10 minutes, sortez le gel du réfrigérateur et placez-le dans un bain de glace pendant 10 minutes pour éluer la structure polymère. Retirez ensuite la structure avec précaution et éliminez l’eau résiduelle en l’épongeant avec un mouchoir en papier.

Appuyez soigneusement la structure sur une nouvelle lame de microscope en verre pour créer une bonne étanchéité empêchant les fuites du troisième hydrogel. Ensuite, préparez une solution à 1 % de méthacrylate d’alginate dans du chlorure de sodium à 0,15 molaire. Vortex la solution pour dissoudre le méthacrylate d’alginate.

Ajoutez ensuite 2,5 % de volume à volume. Alexa, 4 88 fibrinogène conjugué et 0,05 % poids par volume. Lithium phényle 2 4 6 triméthylbenzoyl phosphate pour obtenir un troisième hydrogel qui peut être facilement visualisé par fluorescence.

Placez cette solution dans une seringue de 0,3 millilitre équipée d’une aiguille de calibre 30. Utilisez ensuite la seringue pour remplir les vides laissés par le polymère éludé. Assurez-vous de remplir complètement chaque colonne en éjectant le polymère au fur et à mesure que l’aiguille est tirée de chaque colonne.

Enfin, photopolymérisez le polymère injecté avec une lampe UV à haute intensité pendant cinq minutes, puis imagez la construction à l’aide d’une épifluorescence ou d’un microscope confocal. On voit ici une reconstruction 3D Zack d’une construction similaire à celle qui vient d’être fabriquée, l’alginate marqué par fluorescence utilisé pour le remplissage. Les formes des piliers apparaissent sous forme de colonnes vertes et la partie extérieure de la construction est transparente.

Les techniques présentées dans cette vidéo sont largement adaptables à de nombreux arrangements 3D différents, tels que les cercles concentriques présentés ici. La résolution dépend du diamètre de l’aiguille. L’aiguille de 150 microns de diamètre utilisée pour cette conception peut produire des brins de 120 à 200 microns de diamètre.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des étapes de l’impression de l’oxr. Nous avons démontré l’utilisation de l’oxr comme moule sacrificiel pour créer des hydrogels à motifs, mais l’oxr peut également être stabilisé aux UV si une version du polymère liée à la fabrication est utilisée.