Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l'adulte

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules microgliales primaires du cortex de la souris néonatale ou de la moelle épinière d’une souris adulte. Ceci est accompli en retirant d’abord le cerveau d’un bébé souris postnatal ou d’un bébé adulte ou d’une moelle épinière adulte. Ensuite, soit les cortex sont prélevés dans le tissu néonatal, soit le tissu de la moelle épinière est digéré.

Les cellules du tissu cortical et rachidien sont ensuite cultivées jusqu’à une utilisation expérimentale. En fin de compte, les cellules microgliales néonatales et adultes récoltées peuvent être analysées par microscopie immunofluorescente. Le principal avantage de notre protocole de culture microgliale néonatale par rapport aux méthodes existantes telles que l’agitation des cellules microgliales pour des plaques corticales mixtes est que les cellules retournent facilement à un état de repos et peuvent fournir une image plus précise du comportement des cellules microgliales in vivo.

Le principal avantage de la culture dans la microglie de la moelle épinière adulte est que les cellules peuvent être citées dans le contexte de pathologies qui affectent principalement le système nerveux central de l’adulte avant la dissection. Boîtes de culture tissulaire Preco de 10 centimètres avec cinq microgrammes par millilitre de poly de lycine ou PDL diluées dans de l’eau d’autoclave Après trois heures à 37 degrés Celsius, aspirez le PDL et lavez les plaques une fois avec de l’eau d’autoclave juste avant de commencer la dissection de la microglie néonatale. Faites sécher les plaques sous la lumière UV dans une hotte de culture tissulaire pendant 20 minutes.

Ensuite, utilisez une lingette Kim, imbibée d’éthanol à 70 % pour désinfecter les têtes des chiots anesthésiés après avoir retiré les têtes avec une paire de ciseaux. Placez quatre têtes par assiette dans des boîtes de Pétri de 10 centimètres contenant une solution saline tamponnée d’écheveaux glacés. À l’aide d’une pince incurvée, ancrez les têtes dans les orbites, puis utilisez des micro-pinces droites pour retirer soigneusement la peau recouvrant le crâne.

Ensuite, en commençant près du cervelet, retirez les os crâniens en prenant soin de ne pas percer ou endommager les cortex. À l’aide d’une petite spatule, retirez les cerveaux qui regroupent les organes dans une boîte de Pétri fraîche contenant du HBSS glacé. Commence maintenant sur la face ventrale du cerveau.

Tenez le cervelet avec la micro-pince pour ancrer le tissu, puis faites deux petites incisions de chaque côté du mésencéphale sans couper complètement le tissu. Taquinez doucement le mésencéphale et le cervelet en un seul morceau à partir des cortex, qui doivent former une forme concave. Ensuite, séparez les cortex isolés et orientez un seul cortex avec le côté médial vers le haut pour une dissection ultérieure.

Dans les protocoles néonatals et adultes, l’une des étapes les plus complexes est l’ablation adéquate des méninges. Il est également difficile d’enlever l’hippocampe. Dans le protocole néonatal, nous utilisons une solution saline tamponnée d’écheveaux glacés pour rigidifier les tissus et nous utilisons également une procédure de dissection lente et méthodique pour minimiser le déchiquetage.

Retirez l’hippocampe en forme de croissant situé à l’opposé du bulbe olfactif, qui apparaît comme un petit nodule à l’extrémité pointue du cortex. Retournez ensuite le cortex pour voir la face dorsale. Ensuite, en utilisant le bulbe olfactif comme point de départ, retirez toutes les méninges et le bulbe olfactif lui-même du cortex.

Ensuite, tirez les cortex disséqués dans un tube conique de 15 millilitres contenant 14 millilitres de HBSS glacé sur de la glace. Maintenant, aspirez le HBSS du Cordis et utilisez une pointe de pipette P 1000 pour tritter les cortex plusieurs fois. Ajoutez quatre millilitres de trypsine EDTA aux tissus, puis incubez les tissus à 37 degrés Celsius.

Après 15 minutes, arrêtez la réaction enzymatique avec quatre millilitres de milieu microglial complet, puis faites tourner les suspensions cellulaires pendant cinq minutes à 1000 fois G et à température ambiante. Après un deuxième lavage avec quatre millilitres de support complet, suspendez la pastille cellulaire dans 10 millilitres de média microglial complet, puis filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine à mailles de 40 microns. Enfin, plaquez les cellules à une densité de huit centimètres par 10 millilitres de milieu microglial dans l’une des plaques de culture tissulaire de 10 centimètres recouvertes de L et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après 10 jours de culture cellulaire, détachez la microglie en ajoutant 400 microlitres de lidocaïne de 60 millimolaires dans HBSS dans la plaque de culture tissulaire, et incubez la plaque à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Récupérez ensuite les cellules remises en suspension. Rincez la plaque une fois avec du HBSS et récupérez le lavage pour récupérer toute microglie restante.

Ensuite, ajoutez 0,5 molaire d’EDTA à la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de cinq millimolaires, puis faites tourner les cellules vers le bas. Suspendez le palais dans un millilitre de DMEM avec 1 % de FBS et déterminez le nombre de cellules viables par exclusion du bleu trian. Cultivez ensuite les cellules à la densité expérimentale souhaitée.

Par exemple, pour l’analyse par microscopie immunofluorescente, les cellules à 2,5 fois 10 à la quatrième cellule par 18 millimètres se glissent pour le prélèvement de tissu microglial adulte. Commencez par utiliser de l’éthanol à 70 % pour nettoyer la colonne vertébrale d’une souris adulte euthanasiée. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux pour couper la peau au-dessus de la moelle épinière et procédez à la découpe du cordon de la région T un à T 12.

Coupez le muscle restant des côtés de la moelle épinière, puis tenez doucement la moelle épinière du bout des doigts d’une main. Utilisez des micro-ciseaux pour couper lentement les vertèbres sans percer le cordon. Ensuite, à l’aide d’une paire de micro-pinces, extrayez lentement la moelle épinière, immergez-la dans une boîte de Pétri contenant du HBSS glacé, puis retirez toutes les méninges visibles au microscope.

Coupez maintenant la moelle épinière en segments transversaux, d’une épaisseur maximale de deux millimètres pour faciliter une digestion efficace, puis transférez les fragments dans un tube conique de 15 millilitres contenant un millilitre de HBSS refroidi par de la glace sur de la glace. Pour digérer les fragments de tissu de la moelle épinière, commencez par aspirer le HBS du tissu de la moelle épinière, en faisant attention de ne pas perturber le tissu. Ensuite, incubez le tissu dans un millilitre de trypsine à 37 degrés Celsius.

Après 30 minutes, retirez la trypsine et ajoutez trois millilitres de milieu microglial primaire contenant du sérum pour arrêter la digestion enzymatique. Après avoir pipeté de haut en bas plusieurs fois pour déloger le tissu, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 microns. Ensuite, mélangez une aliquote de la suspension cellulaire avec un volume égal de DPI et comptez les cellules au microscope fluorescent pour déterminer le nombre total de cellules viables.

Enfin, plaquez les cellules de tissu dissocié de la moelle épinière dans des plaques revêtues de L à la densité expérimentale appropriée. Effectuez un changement complet de support quatre heures après le placage pour éliminer les débris cellulaires en excès. Dans cette première série d’images, les cellules microgliales au repos et activées sont montrées 24 heures après le placage de la morphologie microgliale, ramifiée ou rouillée. L’exposition au réactif d’amorçage lipopolysaccharide bactérien entraîne des changements dans la morphologie microgliale vers une forme plus amiboïde à mesure que les cellules deviennent activées.

Le globe oculaire qui colore un marqueur spécifique des macrophages et des protéines de surface des cellules microgliales et qui apparaît en vert, facilite la visualisation des cellules. L’image en fond clair montre les populations cellulaires globales et le DPI en bleu met en évidence les noyaux et indique la pureté de la culture. Dans cette image représentative de cellules isolées de la moelle épinière d’une souris adulte, environ sept fois 10 à cinq cellules viables ont été obtenues.

Les paramètres du microscope à fond clair et à fluorescence ont été combinés pour visualiser les cellules DAPI positives ainsi que la grille du cytomètre hémologique pour un comptage précis des cellules. Microglie entièrement fixée aux plaques de culture revêtues de L après environ deux jours. En culture ici, des microglies isolées de la moelle épinière de souris vertes Mac, qui expriment la GFP sous le contrôle de la microglie et du promoteur de macrophages CSF one R sont montrées dans l’image en fond clair.

La microglie comme indiqué par les flèches bleues et les astrocytes comme indiqué par les flèches rouges, peuvent être observés une fois maîtrisés. Cette technique peut être complétée en environ une heure après cette procédure. D’autres méthodes comme l’acculturation de la microglie avec d’autres types de cellules peuvent être effectuées afin d’étudier l’effet que la microglie a sur d’autres cellules.

À la suite de cette procédure, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la dissection délicate nécessaire à la culture de cellules néocorticales et de cellules de la moelle épinière adulte, et d’utiliser ces cellules dans des applications en aval.