Name: Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Découvrez le traçage transsynaptique des circuits prémoteurs centraux ciblant des structures périphériques chez la souris. Cette méthode combine virus pseudorabique et marqueurs classiques pour cartographier les réseaux neuronaux.

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Nous remercions le Dr Toshio Terashima de l&#39;Université de Kobe, au Japon, pour l&#39;enseignement de la technique de la chirurgie du larynx, et le Dr Lynn Enquist de l&#39;Université de Princeton pour fournir PRV-Bartha. Recherche a été soutenue par le NIH prix pionnier DP1 OD000448 Erich D. Jarvis et un prix NSF Graduate Research Fellowship à Gustavo Arriaga. Les chiffres de travail précédente de manière appropriée crédités sont utilisés dans le cadre du libre accès PLoS ONE licence Creative Commons (CC-BY) en conformité avec les politiques éditoriales de la revue.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université Duke. 1. Enregistrement des virus de la pseudo <ol><li> Nous obtenons virus vivant (PRV152) du laboratoire du Dr Lynn Enquist à l&#39;Université de Princeton à un titre de 1 x 10 9 pfu / m. Le protocole pour générer le virus a été publiée deux. </li><li> Aliquoter le virus à 20 pi par tube à l&#39;intérieur d&#39;une armoire et un magasin BSL-2 biosécurité à -80 ° C dans des conditions de biosécurité appropriées. </li><li> Décongeler une aliquote de PRV immédiatement avant injection. </li></ol> 2. Préparation chirurgicale pour injections dans le muscle <ol><li> Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane. </li><li> Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique. </li><li> Préparer til site chirurgical selon la technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site chirurgical avec gommages alternées de Bétadine et 70% d&#39;alcool (minimum de 3 cycles). Veillez à utiliser des champs stériles pour couvrir les zones chirurgicales. Assurez-vous d&#39;adhérer à des techniques stériles tout au long des procédures. </li><li> Faire une incision de la peau et de révéler le muscle d&#39;intérêt. Par exemple, pour accéder au muscle laryngé cricothyroïdienne il est nécessaire d&#39;enlever d&#39;abord la partie recouvrant le muscle sterno de. </li><li> Sceller toutes les muscles sectionnés avec colle tissulaire Vetbond. </li></ol> 3. Injection de PRV dans le muscle <ol><li> Charger le système d&#39;microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution de PRV fraîchement décongelé, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et monter avec précaution sur l&#39;appareil stéréotaxique. </li><li> Lentement effacer l&#39;espace mort et vérifiez que la solution quitte la pointe microseringue. Jeter fluide comme un déchet bioharzard. </li><li> Utilisation d&#39;un microP stéréotaxiqueDispositif OSITIONNEMENT placer soigneusement la pointe de la microseringue dans le muscle d&#39;intérêt et remplir lentement le muscle jusqu&#39;à ce qu&#39;une légère enflure est visible. La vitesse d&#39;injection varie en fonction de la taille du muscle et le volume à injecter. Par exemple, cinq injections de 200 nl (1 pi totale) à un taux de 4 nl / s devraient être faites 1 min part sur le même site pour remplir le muscle cricothyroïdienne. Déplacez la seringue à la prochaine musculaire d&#39;intérêt (le crico-aryténoïdienne latéral dans ce cas) et répétez la procédure d&#39;injection. Seulement une fois perforer chaque muscle. </li><li> Rétracter la microseringue après cinq minutes. </li><li> Sceller la rupture de l&#39;aponévrose en utilisant un adhésif de tissu Vetbond. </li><li> Après toutes les injections ont été réalisées, fermer la plaie avec de la colle tissulaire Vetbond. Selon vos INSTITUTIONNEL directives d&#39;utilisation des animaux locaux, des sutures ou des clips plaie peut être utilisé. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par ynos institutionnels directives d&#39;utilisation des animaux. </li><li> Après le temps de survie déterminée expérimentalement (dans ce cas, 90 h à l&#39;étiquette d&#39;ordre 2 neurones corticaux), sacrifier l&#39;animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS. </li><li> Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures. </li><li> Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures. </li></ol> 4. immunochimique Détection de eGFP <ol><li> Couper des sections à 40 um sur un microtome à glissière et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS. Sections plus minces, par exemple de 30 um, peuvent être utilisés lorsque la coloration sections montées. </li><li> Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière. </li><li> Bloquer antigènes non spécifiques dans les sections pendant 30 min dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de chèvre normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite (VE kit). </li><li&gt; Incuber sections bloqué pendant 3,5 heures chez le lapin anti-eGFP (1: 1 000) à température ambiante. </li><li> Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin de la VE kit à température ambiante. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, en les ensuite réagir pendant 1 heure dans une solution ABC de la VE kit à température ambiante. </li><li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) et 0,015% de H 2 O 2. </li><li> Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d&#39;alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun). </li><li> Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage. </li><li> Image les sections montées sur un microscope. Le produit de réaction DAB inside les cellules doivent apparaître brun. Les images numérisées peuvent être de couleur inversé pour mettre en évidence les processus fines. </li></ol> 5. Préparation chirurgicale pour injection de traceurs dans les régions cérébrales Découvert par PRV Tracing <ol><li> Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane. </li><li> Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique. </li><li> Fixer la tête dans un cadre stéréotaxique appropriée. </li><li> Préparer le site chirurgical selon une technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site avec des gommages alternées de Bétadine et 70% d&#39;alcool (minimum de 3 cycles). </li><li> Faire une incision du cuir chevelu et se rétracter la peau sur la région du cerveau d&#39;intérêt. </li><li> Effectuer une petite craniotomie les coordonnées stéréotaxiques appropriées. Par exemple, les coordonnées de laryngeally relié cortex moteur identifié par un PRV en traçantn souris adulte sont de 1,2 mm et 0,2 mm latérale rostrale à Bregma. </li></ol> 6. L&#39;injection de dextrane Amines biotinylés en réflexion <ol><li> Préparer 7,5% Amines dextran biotinylé (BDA) en dissolvant 25 mg de BDA (10.000 MW) dans 333 ul de solution saline stérile. </li><li> Charger le système d&#39;micropipette Nanoject II avec une solution BDA suffisante pour les injections prévues. </li><li> Lentement effacer l&#39;espace mort et vérifier que la solution est de quitter la pointe de la micropipette. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un dispositif de micropositionnement stéréotaxique abaisser soigneusement la pointe de la micropipette dans la région du cerveau d&#39;intérêt et injecter lentement BDA. Ajuster le débit d&#39;injection en fonction de la taille de la zone à marquer. Par exemple, 12 injections de 4,6 nl devraient être faites à quatre endroits différents de 0,2 mm de distance (direction rostro-caudale) pour couvrir le cortex moteur laryngeally connecté chez la souris adulte. Le volume d&#39;injection final doit être ajustée en fonction de la taille de la région du cerveau d&#39;intérêt, En gardant à l&#39;esprit que l&#39;étiquette peut se propager à partir du noyau d&#39;injection par diffusion à travers les tissus du cerveau et le long des processus de neurones marqués. </li><li> Sceller le craniotomie utilisant ciment dentaire, et de fermer la plaie du cuir chevelu avec de la colle tissulaire Vetbond. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l&#39;utilisation des animaux. </li></ol> 7. L&#39;injection de toxine cholérique Subunit b dans le muscle <ol><li> Préparer une sous-unité de choléra% toxine B (CTB) en dissolvant 1 mg de CTB dans 100 ul de solution saline stérile. </li><li> Six jours après l&#39;injection dans le cerveau BDA, effectuer la préparation chirurgicale décrite ci-dessus pour les injections dans le muscle PRV. </li><li> Charger le système d&#39;microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution CTb, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et soigneusement le monter sur le dispositif stéréotaxique. </li><li> Effectuez les micro-injections dans le muscle (s) d&#39;intérêt comme précédemment déprescrite pour PRV. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l&#39;utilisation des animaux. </li><li> Trois jours après l&#39;injection CTb, sacrifier l&#39;animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS. </li><li> Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures. </li><li> Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures. </li></ol> 8. Détection de BDA et la CTB dans les mêmes sections <ol><li> Couper des sections à 40 um sur un microtome et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS. </li><li> Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 1 heure dans une solution ABC à TA. </li&gt; <li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine), 0,015% de H 2 O 2, et 0,05% de chlorure de nickel. Le produit de la réaction DAB à l&#39;intérieur des cellules devrait apparaître en noir. </li><li> Sections de bloc pendant 30 minutes dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de lapin normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite. </li><li> Incuber sections bloqué pendant 2 heures dans de chèvre anti-CTB (1: 10,000) à la température ambiante. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de lapin anti-chèvre de la VE kit à température ambiante. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 30 min dans une solution ABC à TA. </li><li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et pour développer jusqu&#39;à 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) et 0,015% de H 2 O 2. Le produit de la réaction DAB à l&#39;intérieur des cellules devrait apparaître brun. </li><li> Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d&#39;alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun). </li><li> Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage. </li><li> Image les sections montées sur un microscope. </li></ol>

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Il ya un certain nombre de questions qui doivent être prises en considération lors de la planification d&#39;une expérience utilisant PRV152 4,21. Plus important encore, virus de la pseudorage est létale. Comme mentionné précédemment, les grands singes, dont les humains ne sont pas sensibles à l&#39;infection, mais des soins appropriés doivent être exercés pour protéger les autres animaux. Les souris adultes survivent généralement de cinq à sept jours après l&#39;inoculation avec la souche atténuée PRV152. Pa...

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau de rongeurs en utilisant le virus de la pseudo pathogènes porcine (PRV), en particulier la souche atténuée PRV-Bartha décrite pour la première en 1961 12. Ici, nous présentons un protocole pour identifier la représentation corticale motrice des muscles spécifiques ou groupes de muscles à l&#39;aide d&#39;une souche de virus de la pseudorage recombinant (PRV152) exprimant la protéine de renforcement fluorescente verte (EGFP) gène rapporteur 2. La méthode décrite exploite le comportement des virus neurotropes, qui produisent une descendance infectieuse que les synapses croisées pour infecter d&#39;autres neurones dans un circuit fonctionnel 3,4,13. PRV152, qui est isogénique avec PRV-Bartha, seule traverse synapses rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques en dehors du site d&#39;infection 3,5 &lt;/ sup&gt;. En contrôlant avec précision le site de l&#39;infection périphérique, il est possible de limiter la pénétration du virus dans le cerveau à travers un sous-ensemble spécifique des motoneurones. Comme le virus infecte de manière séquentielle de chaînes de neurones connectés, le motif de signal de eGFP dans le cerveau résultant sera alors de résoudre le réseau de neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Un avantage supplémentaire de l&#39;utilisation de virus pour le traçage de neurones est l&#39;amplification de la protéine rapporteur (eGFP dans ce cas) dans les cellules infectées. Cette amplification de signal fournit un niveau de sensibilité qui permet la détection des projections même clairsemés. Par exemple, une projection creuse de vibrisses de cortex moteur aux neurones moteurs faciaux contrôlant les whiskers a été trouvé chez les rats en utilisant viralement exprimé la protéine fluorescente verte 14; études précédentes ont échoué à trouver cette projection utilisant des traceurs classiques sans amplification du gène rapporteur 11,15. Malheureusement, De nombreux vecteurs de traçage virales, comme celui utilisé dans l&#39;étude citée, ne traversent pas les synapses, ce qui limite leur utilisation pour le traçage des circuits multi-synaptiques. Bien que présentant des avantages distincts pour identifier le réseau de cellules participant à un circuit de moteur, la nature distribuée transsynaptique de traçage avec PRV-152 rend l&#39;interprétation de liaisons spécifiques dans le circuit difficile. Par conséquent, nous présentons une méthode simple pour valider les connexions spécifiques au sein de circuits identifiés en utilisant PRV-152 par double marquage utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). L&#39;utilisation combinée de BDA et la CTB est une approche bien établie pour tracer des liens entre des ensembles spécifiques de neurones 6-8,11. Lorsqu&#39;ils sont utilisés ensemble, ces deux traceurs peuvent être visualisées dans la même section en utilisant un DAB à deux couleurs (3, 3 &#39;diaminobenzidine) procédure 16. Haut poids moléculaire BDA (BDA10kDa) a été choisi pour ce protocole parce qu&#39;il yOMAINES étiquetage détaillé des processus neuronaux 6,7,9. Des avantages supplémentaires de BDA10kDa sont les suivants: il est de préférence transporté dans le sens antérograde 6-8; il peut être livré par iontophorèse ou l&#39;injection de pression 6-8; il peut être visualisée par une simple avidine-HRP biotinylé de (ABC) 17 procédure; et il peut être imagée par microscopie optique ou électronique 6,7,18. La détection immunochimique de la CTB à la peroxydase et DAB a été choisi pour marquage rétrograde des motoneurones parce qu&#39;il est efficace à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 10,19. Nous avons récemment utilisé cette approche pour identifier la voie de moteur vocal chez la souris et de révéler une connexion clairsemée du cortex moteur primaire des neurones moteurs du larynx, qui était auparavant supposées être absent 20.

<table><tbody><tr><td>Nom du réactif/matériau</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires Système</td>de</tr><tr><td>microinjection</td><td>NanoFil World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 Option G</td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Injecteur auto-nanolitre</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Microtome coulissant</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane (Forane)</td><td>Baxter&nbsp ;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Bâtonnet d’écouvillon en bétadine</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 unités</td></tr><tr><td>Permount Support de montage</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus lames</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Amines dextran biotinylées</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10 000 MW</td></tr><tr><td>Virus de la pseudorage</td><td>Laboratoire du Dr. Lynn Enquist (Université de Princeton)</td><td>PRV152</td><td>Titre >1 x 107</td></tr><tr><td>Sous-unité B de la toxine anti-choléra (chèvre)</td><td>Liste Laboratoires biologiques</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Sous-unité B de la toxine cholérique</td><td>Liste Laboratoires biologiques</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>Comprimés de 10 mg</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Dilué à 4</td></tr><tr><td> %Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30 %</td></tr> <tr><td>Kétamine HCl & Xylazine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml & 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Chlorure de nickel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1,0 M ; pH 7,4</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x ; pH 7,4</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>dose</td></tr> <tr><td>de 50 mg/mlSaccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylènes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Histologique</td></tr><tr><td>grade VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (lapin) ; PK-6105 (chèvre)</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique Optixcare</td><td>Vétérinaire Dépôt</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsynaptique tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo suivi par la toxine cholérique et biotinylé dextran amines double marquage

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau en utilisant le virus de la pseudorage porcine pathogène (PRV) 1. PRV ne pas infecter les grands singes, dont les humains, il est le plus souvent utilisé dans les études sur les petits mammifères, en particulier les rongeurs. La souche de la pseudorage PRV152 exprime la protéine fluorescente (eGFP) gène rapporteur verte améliorée et que traverse synapses fonctionnelles manière rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques de distance à partir du site d&#39;infection de 2,3. D&#39;autres souches de PRV ont des propriétés distinctes et microbiologiques peuvent être transportés dans les deux directions (PRV-Becker et Kaplan-PRV) 4,5. Ce protocole traitera exclusivement avec PRV152. En fournissant le virus à un site périphérique, par exemple muscle, il est possible de limiter l&#39;entrée du virus dans til cerveau à travers un ensemble spécifique de neurones. Le motif de signal de eGFP résultant dans tout le cerveau résout alors les neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Comme la nature distribuée de traçage transsynaptique par le virus de la pseudo rend l&#39;interprétation des connexions spécifiques au sein d&#39;un réseau identifié difficile, nous présentons une méthode sensible et fiable utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la toxine du choléra sous-unité B (CTB) pour confirmer les connexions entre les cellules identifiées à l&#39;aide PRV152. La détection immunochimique de BDA et la CTB à la peroxydase et DAB (3, 3 &#39;diaminobenzidine) a été choisi parce qu&#39;ils sont efficaces à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 6-11.

Coloration pour eGFP devrait commencer à montrer des signaux faibles dans les neurones moteurs primaires d&#39;environ 72 heures après l&#39;injection dans le muscle PRV152. La réplication et de transport transsynaptique du virus sont titer- et dépendante du temps 4. Environ 90 heures après l&#39;injection, eGFP coloration va révéler signal fort dans les cellules infectées par ordre 2 e. Prolongement de la durée de survie révéleront 3 ème et cellules d&#39;ordre supérieur mais les heures...

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant pour analyser les efférences centrales régulant les cibles périphériques par le biais de circuits multi-synaptiques. Nous présentons ici un protocole qui exploite le virus de la pseudorage transsynaptique pour identifier et localiser un circuit cérébral fonctionnel, suivi de techniques classiques de traçage de tractus pour valider des connexions spécifiques dans le circuit entre des groupes de neurones identifiés.

Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

L'objectif général de cette procédure est de découvrir le réseau prémoteur central constitué de cellules distribuées qui influencent une cible périphérique spécifique, puis de confirmer les connexions précises entre ces cellules dans le cerveau. Cela est réalisé en premier lieu par une infection rétrograde des circuits prémoteurs à l'aide d'un vecteur viral transsynaptique administré par voie périphérique via le muscle. La deuxième étape de la procédure consiste à visualiser les cellules infectées par microscopie fluorescente en lumière. La troisième étape consiste à confirmer les connexions spécifiques dans le cerveau en injectant des traceurs monosynaptiques dirigés contre des nœuds précédemment identifiés dans un circuit pré-moteur. En fin de compte, les résultats peuvent montrer comment les cellules d'un réseau pré-moteur distribué sont interconnectées grâce à une combinaison de traçage viral transsynaptique et de techniques neuroanatomiques traditionnelles monosynaptiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le traçage neuroanatomique monosynaptique traditionnel, réside dans la possibilité d'identifier les nœuds d'un réseau

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Procédé de traçage neurones connectés synaptique est décrit. On utilise la spécificité de la TVA une cellule amont pour sonder si une population cellulaire d'intérêt synaptique reçoit une entrée à partir de types de cellules génétiquement déterminées.

Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

Capitalisant sur une stratégie génétique binaire, nous fournissons un protocole détaillé pour le traçage des circuits neuronaux chez les souris qui expriment des traceurs transsynaptiques complémentaires après recombinaison médiée par Cre. Parce que la production de traceurs spécifiques aux cellules est codée génétiquement, notre approche expérimentale convient pour étudier la formation et la maturation des circuits neuronaux au cours du développement du cerveau embryonnaire murin à une...

Transsynaptique génétique conditionnelle traçage dans le cerveau embryonnaire de souris

Nous décrivons une technique d'étiqueter les neurones et leurs processus via antérograde ou rétrograde traceurs injections dans les noyaux du cerveau en utilisant une préparation in vitro. Nous avons modifié une méthode existante de i n vitro traceur électroporation en profitant de marqué par fluorescence mutants de souris et de l'équipement optique de base afin d'augmenter la précision de l'étiquetage.

Neuronal Tracing dans des explants de cerveau à guidage laser

Cette vidéo montre la procédure de craniotomie qui permet l’imagerie chronique des neurones dans le cortex rétrosplénial de souris à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo dans la lignée transgénique Thy1-GFP. Cette approche est combinée à l’injection d’un virus adéno-associé exprimant mCherry dans l’hippocampe dorsal. Ces techniques permettent un suivi à long terme de la plasticité structurelle dépendante de l’expérience dans les RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle des populations neuronales sélectives, marquées après l'infection rétrograde avec un virus de la rage modifiée exprimant des marqueurs fluorescents, et des analyses indépendantes, impartiales grappe qui permettent la caractérisation complète des paramètres morphologiques parmi les sous-classes neuronales distinctes.

Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives

Nous présentons ici un protocole raffiné pour révéler efficacement amine de dextran biotinylé (BDA) marquage avec une fluorescence coloration méthode via une voie neurale réciproque. Il est adapté pour l’analyse de la structure fine des BDA étiquetage et qui le différencient des autres éléments neurones sous un confocal laser scanning microscope.

Amélioration de l’Application de poids moléculaire élevé biotinylé Dextran Amine pour la Projection de Thalamocortical suivi chez le Rat

Nous décrivons une analyse optique des vésicules synaptiques (SV) recyclage dans les neurones en culture. Alliant ce protocole de transfection double pour exprimer un marqueur présynaptique et la protéine d’intérêt permet de localiser les sites présynaptiques, leur Vésicule synaptique capacité de recyclage et déterminer le rôle de la protéine d’intérêt.

Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

Le protocole actuel démontre une méthode simple pour tracer les projections de glutamate de l’aire tegmentale ventrale (VTA) vers l’hippocampe. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a été combinée à l’enregistrement CA1 pour démontrer comment les terminaux VTA glutamate modulent la vitesse de tir pyramidale putative CA1 in vivo.

Traçage anatomique et fonctionnel in vivo combiné des terminaux de glutamate de la zone tegmentale ventrale dans l’hippocampe

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Ex Vivo Interrogation optogénétique de la transmission synaptique à longue distance et de la plasticité du cortex préfrontal médian au cortex entorhinal latéral

À l’aide de souris fluorescentes transgéniques, des protocoles détaillés sont décrits pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones moteurs et sensoriels du nerf sciatique intact chez les animaux vivants.

Élargir la boîte à outils pour l’imagerie in vivo du transport axonal

L’imagerie par tomographie à deux photons en série (STPT) est une technique permettant d’imager une masse de tissu dans sa forme tridimensionnelle en combinant l’imagerie à deux photons avec le contrôle automatique de la platine et le tranchage par microtome. Nous décrivons ici un protocole permettant de l’implémenter pour les cerveaux de ouistitis afin de mieux comprendre leurs caractéristiques structurelles.

Tomographie à deux photons en série de l’ensemble du cerveau du ouistiti pour les analyses neuroanatomiques

Découvrez le traçage transsynaptique des circuits prémoteurs centraux ciblant des structures périphériques chez la souris. Cette méthode combine virus pseudorabique et marqueurs classiques pour cartographier les réseaux neuronaux.

Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage (Vidéo) | JoVE Journal

Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage

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