Name: Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Découvrez le traçage transsynaptique des circuits prémoteurs centraux ciblant des structures périphériques chez la souris. Cette méthode combine virus pseudorabique et marqueurs classiques pour cartographier les réseaux neuronaux.

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Nous remercions le Dr Toshio Terashima de l&#39;Université de Kobe, au Japon, pour l&#39;enseignement de la technique de la chirurgie du larynx, et le Dr Lynn Enquist de l&#39;Université de Princeton pour fournir PRV-Bartha. Recherche a été soutenue par le NIH prix pionnier DP1 OD000448 Erich D. Jarvis et un prix NSF Graduate Research Fellowship à Gustavo Arriaga. Les chiffres de travail précédente de manière appropriée crédités sont utilisés dans le cadre du libre accès PLoS ONE licence Creative Commons (CC-BY) en conformité avec les politiques éditoriales de la revue.

NOTE: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université Duke. 1. Enregistrement des virus de la pseudo <ol><li> Nous obtenons virus vivant (PRV152) du laboratoire du Dr Lynn Enquist à l&#39;Université de Princeton à un titre de 1 x 10 9 pfu / m. Le protocole pour générer le virus a été publiée deux. </li><li> Aliquoter le virus à 20 pi par tube à l&#39;intérieur d&#39;une armoire et un magasin BSL-2 biosécurité à -80 ° C dans des conditions de biosécurité appropriées. </li><li> Décongeler une aliquote de PRV immédiatement avant injection. </li></ol> 2. Préparation chirurgicale pour injections dans le muscle <ol><li> Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane. </li><li> Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique. </li><li> Préparer til site chirurgical selon la technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site chirurgical avec gommages alternées de Bétadine et 70% d&#39;alcool (minimum de 3 cycles). Veillez à utiliser des champs stériles pour couvrir les zones chirurgicales. Assurez-vous d&#39;adhérer à des techniques stériles tout au long des procédures. </li><li> Faire une incision de la peau et de révéler le muscle d&#39;intérêt. Par exemple, pour accéder au muscle laryngé cricothyroïdienne il est nécessaire d&#39;enlever d&#39;abord la partie recouvrant le muscle sterno de. </li><li> Sceller toutes les muscles sectionnés avec colle tissulaire Vetbond. </li></ol> 3. Injection de PRV dans le muscle <ol><li> Charger le système d&#39;microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution de PRV fraîchement décongelé, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et monter avec précaution sur l&#39;appareil stéréotaxique. </li><li> Lentement effacer l&#39;espace mort et vérifiez que la solution quitte la pointe microseringue. Jeter fluide comme un déchet bioharzard. </li><li> Utilisation d&#39;un microP stéréotaxiqueDispositif OSITIONNEMENT placer soigneusement la pointe de la microseringue dans le muscle d&#39;intérêt et remplir lentement le muscle jusqu&#39;à ce qu&#39;une légère enflure est visible. La vitesse d&#39;injection varie en fonction de la taille du muscle et le volume à injecter. Par exemple, cinq injections de 200 nl (1 pi totale) à un taux de 4 nl / s devraient être faites 1 min part sur le même site pour remplir le muscle cricothyroïdienne. Déplacez la seringue à la prochaine musculaire d&#39;intérêt (le crico-aryténoïdienne latéral dans ce cas) et répétez la procédure d&#39;injection. Seulement une fois perforer chaque muscle. </li><li> Rétracter la microseringue après cinq minutes. </li><li> Sceller la rupture de l&#39;aponévrose en utilisant un adhésif de tissu Vetbond. </li><li> Après toutes les injections ont été réalisées, fermer la plaie avec de la colle tissulaire Vetbond. Selon vos INSTITUTIONNEL directives d&#39;utilisation des animaux locaux, des sutures ou des clips plaie peut être utilisé. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par ynos institutionnels directives d&#39;utilisation des animaux. </li><li> Après le temps de survie déterminée expérimentalement (dans ce cas, 90 h à l&#39;étiquette d&#39;ordre 2 neurones corticaux), sacrifier l&#39;animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS. </li><li> Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures. </li><li> Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures. </li></ol> 4. immunochimique Détection de eGFP <ol><li> Couper des sections à 40 um sur un microtome à glissière et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS. Sections plus minces, par exemple de 30 um, peuvent être utilisés lorsque la coloration sections montées. </li><li> Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière. </li><li> Bloquer antigènes non spécifiques dans les sections pendant 30 min dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de chèvre normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite (VE kit). </li><li&gt; Incuber sections bloqué pendant 3,5 heures chez le lapin anti-eGFP (1: 1 000) à température ambiante. </li><li> Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin de la VE kit à température ambiante. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, en les ensuite réagir pendant 1 heure dans une solution ABC de la VE kit à température ambiante. </li><li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) et 0,015% de H 2 O 2. </li><li> Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d&#39;alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun). </li><li> Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage. </li><li> Image les sections montées sur un microscope. Le produit de réaction DAB inside les cellules doivent apparaître brun. Les images numérisées peuvent être de couleur inversé pour mettre en évidence les processus fines. </li></ol> 5. Préparation chirurgicale pour injection de traceurs dans les régions cérébrales Découvert par PRV Tracing <ol><li> Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane. </li><li> Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique. </li><li> Fixer la tête dans un cadre stéréotaxique appropriée. </li><li> Préparer le site chirurgical selon une technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site avec des gommages alternées de Bétadine et 70% d&#39;alcool (minimum de 3 cycles). </li><li> Faire une incision du cuir chevelu et se rétracter la peau sur la région du cerveau d&#39;intérêt. </li><li> Effectuer une petite craniotomie les coordonnées stéréotaxiques appropriées. Par exemple, les coordonnées de laryngeally relié cortex moteur identifié par un PRV en traçantn souris adulte sont de 1,2 mm et 0,2 mm latérale rostrale à Bregma. </li></ol> 6. L&#39;injection de dextrane Amines biotinylés en réflexion <ol><li> Préparer 7,5% Amines dextran biotinylé (BDA) en dissolvant 25 mg de BDA (10.000 MW) dans 333 ul de solution saline stérile. </li><li> Charger le système d&#39;micropipette Nanoject II avec une solution BDA suffisante pour les injections prévues. </li><li> Lentement effacer l&#39;espace mort et vérifier que la solution est de quitter la pointe de la micropipette. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un dispositif de micropositionnement stéréotaxique abaisser soigneusement la pointe de la micropipette dans la région du cerveau d&#39;intérêt et injecter lentement BDA. Ajuster le débit d&#39;injection en fonction de la taille de la zone à marquer. Par exemple, 12 injections de 4,6 nl devraient être faites à quatre endroits différents de 0,2 mm de distance (direction rostro-caudale) pour couvrir le cortex moteur laryngeally connecté chez la souris adulte. Le volume d&#39;injection final doit être ajustée en fonction de la taille de la région du cerveau d&#39;intérêt, En gardant à l&#39;esprit que l&#39;étiquette peut se propager à partir du noyau d&#39;injection par diffusion à travers les tissus du cerveau et le long des processus de neurones marqués. </li><li> Sceller le craniotomie utilisant ciment dentaire, et de fermer la plaie du cuir chevelu avec de la colle tissulaire Vetbond. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l&#39;utilisation des animaux. </li></ol> 7. L&#39;injection de toxine cholérique Subunit b dans le muscle <ol><li> Préparer une sous-unité de choléra% toxine B (CTB) en dissolvant 1 mg de CTB dans 100 ul de solution saline stérile. </li><li> Six jours après l&#39;injection dans le cerveau BDA, effectuer la préparation chirurgicale décrite ci-dessus pour les injections dans le muscle PRV. </li><li> Charger le système d&#39;microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution CTb, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et soigneusement le monter sur le dispositif stéréotaxique. </li><li> Effectuez les micro-injections dans le muscle (s) d&#39;intérêt comme précédemment déprescrite pour PRV. </li><li> Surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à décubitus sternal et de fournir l&#39;analgésie, de la nourriture, de l&#39;eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l&#39;utilisation des animaux. </li><li> Trois jours après l&#39;injection CTb, sacrifier l&#39;animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS. </li><li> Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures. </li><li> Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures. </li></ol> 8. Détection de BDA et la CTB dans les mêmes sections <ol><li> Couper des sections à 40 um sur un microtome et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS. </li><li> Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 1 heure dans une solution ABC à TA. </li&gt; <li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine), 0,015% de H 2 O 2, et 0,05% de chlorure de nickel. Le produit de la réaction DAB à l&#39;intérieur des cellules devrait apparaître en noir. </li><li> Sections de bloc pendant 30 minutes dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de lapin normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite. </li><li> Incuber sections bloqué pendant 2 heures dans de chèvre anti-CTB (1: 10,000) à la température ambiante. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de lapin anti-chèvre de la VE kit à température ambiante. </li><li> Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant. </li><li> Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 30 min dans une solution ABC à TA. </li><li> Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et pour développer jusqu&#39;à 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) et 0,015% de H 2 O 2. Le produit de la réaction DAB à l&#39;intérieur des cellules devrait apparaître brun. </li><li> Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d&#39;alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun). </li><li> Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage. </li><li> Image les sections montées sur un microscope. </li></ol>

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Il ya un certain nombre de questions qui doivent être prises en considération lors de la planification d&#39;une expérience utilisant PRV152 4,21. Plus important encore, virus de la pseudorage est létale. Comme mentionné précédemment, les grands singes, dont les humains ne sont pas sensibles à l&#39;infection, mais des soins appropriés doivent être exercés pour protéger les autres animaux. Les souris adultes survivent généralement de cinq à sept jours après l&#39;inoculation avec la souche atténuée PRV152. Pa...

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau de rongeurs en utilisant le virus de la pseudo pathogènes porcine (PRV), en particulier la souche atténuée PRV-Bartha décrite pour la première en 1961 12. Ici, nous présentons un protocole pour identifier la représentation corticale motrice des muscles spécifiques ou groupes de muscles à l&#39;aide d&#39;une souche de virus de la pseudorage recombinant (PRV152) exprimant la protéine de renforcement fluorescente verte (EGFP) gène rapporteur 2. La méthode décrite exploite le comportement des virus neurotropes, qui produisent une descendance infectieuse que les synapses croisées pour infecter d&#39;autres neurones dans un circuit fonctionnel 3,4,13. PRV152, qui est isogénique avec PRV-Bartha, seule traverse synapses rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques en dehors du site d&#39;infection 3,5 &lt;/ sup&gt;. En contrôlant avec précision le site de l&#39;infection périphérique, il est possible de limiter la pénétration du virus dans le cerveau à travers un sous-ensemble spécifique des motoneurones. Comme le virus infecte de manière séquentielle de chaînes de neurones connectés, le motif de signal de eGFP dans le cerveau résultant sera alors de résoudre le réseau de neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Un avantage supplémentaire de l&#39;utilisation de virus pour le traçage de neurones est l&#39;amplification de la protéine rapporteur (eGFP dans ce cas) dans les cellules infectées. Cette amplification de signal fournit un niveau de sensibilité qui permet la détection des projections même clairsemés. Par exemple, une projection creuse de vibrisses de cortex moteur aux neurones moteurs faciaux contrôlant les whiskers a été trouvé chez les rats en utilisant viralement exprimé la protéine fluorescente verte 14; études précédentes ont échoué à trouver cette projection utilisant des traceurs classiques sans amplification du gène rapporteur 11,15. Malheureusement, De nombreux vecteurs de traçage virales, comme celui utilisé dans l&#39;étude citée, ne traversent pas les synapses, ce qui limite leur utilisation pour le traçage des circuits multi-synaptiques. Bien que présentant des avantages distincts pour identifier le réseau de cellules participant à un circuit de moteur, la nature distribuée transsynaptique de traçage avec PRV-152 rend l&#39;interprétation de liaisons spécifiques dans le circuit difficile. Par conséquent, nous présentons une méthode simple pour valider les connexions spécifiques au sein de circuits identifiés en utilisant PRV-152 par double marquage utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). L&#39;utilisation combinée de BDA et la CTB est une approche bien établie pour tracer des liens entre des ensembles spécifiques de neurones 6-8,11. Lorsqu&#39;ils sont utilisés ensemble, ces deux traceurs peuvent être visualisées dans la même section en utilisant un DAB à deux couleurs (3, 3 &#39;diaminobenzidine) procédure 16. Haut poids moléculaire BDA (BDA10kDa) a été choisi pour ce protocole parce qu&#39;il yOMAINES étiquetage détaillé des processus neuronaux 6,7,9. Des avantages supplémentaires de BDA10kDa sont les suivants: il est de préférence transporté dans le sens antérograde 6-8; il peut être livré par iontophorèse ou l&#39;injection de pression 6-8; il peut être visualisée par une simple avidine-HRP biotinylé de (ABC) 17 procédure; et il peut être imagée par microscopie optique ou électronique 6,7,18. La détection immunochimique de la CTB à la peroxydase et DAB a été choisi pour marquage rétrograde des motoneurones parce qu&#39;il est efficace à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 10,19. Nous avons récemment utilisé cette approche pour identifier la voie de moteur vocal chez la souris et de révéler une connexion clairsemée du cortex moteur primaire des neurones moteurs du larynx, qui était auparavant supposées être absent 20.

<table><tbody><tr><td>Nom du réactif/matériau</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires Système</td>de</tr><tr><td>microinjection</td><td>NanoFil World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 Option G</td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modèle 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Injecteur auto-nanolitre</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Microtome coulissant</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane (Forane)</td><td>Baxter&nbsp ;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Bâtonnet d’écouvillon en bétadine</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 unités</td></tr><tr><td>Permount Support de montage</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus lames</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Amines dextran biotinylées</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10 000 MW</td></tr><tr><td>Virus de la pseudorage</td><td>Laboratoire du Dr. Lynn Enquist (Université de Princeton)</td><td>PRV152</td><td>Titre >1 x 107</td></tr><tr><td>Sous-unité B de la toxine anti-choléra (chèvre)</td><td>Liste Laboratoires biologiques</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Sous-unité B de la toxine cholérique</td><td>Liste Laboratoires biologiques</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>Comprimés de 10 mg</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Dilué à 4</td></tr><tr><td> %Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30 %</td></tr> <tr><td>Kétamine HCl & Xylazine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml & 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Chlorure de nickel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1,0 M ; pH 7,4</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x ; pH 7,4</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>dose</td></tr> <tr><td>de 50 mg/mlSaccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylènes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Histologique</td></tr><tr><td>grade VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (lapin) ; PK-6105 (chèvre)</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique Optixcare</td><td>Vétérinaire Dépôt</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsynaptique tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo suivi par la toxine cholérique et biotinylé dextran amines double marquage

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau en utilisant le virus de la pseudorage porcine pathogène (PRV) 1. PRV ne pas infecter les grands singes, dont les humains, il est le plus souvent utilisé dans les études sur les petits mammifères, en particulier les rongeurs. La souche de la pseudorage PRV152 exprime la protéine fluorescente (eGFP) gène rapporteur verte améliorée et que traverse synapses fonctionnelles manière rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques de distance à partir du site d&#39;infection de 2,3. D&#39;autres souches de PRV ont des propriétés distinctes et microbiologiques peuvent être transportés dans les deux directions (PRV-Becker et Kaplan-PRV) 4,5. Ce protocole traitera exclusivement avec PRV152. En fournissant le virus à un site périphérique, par exemple muscle, il est possible de limiter l&#39;entrée du virus dans til cerveau à travers un ensemble spécifique de neurones. Le motif de signal de eGFP résultant dans tout le cerveau résout alors les neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Comme la nature distribuée de traçage transsynaptique par le virus de la pseudo rend l&#39;interprétation des connexions spécifiques au sein d&#39;un réseau identifié difficile, nous présentons une méthode sensible et fiable utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la toxine du choléra sous-unité B (CTB) pour confirmer les connexions entre les cellules identifiées à l&#39;aide PRV152. La détection immunochimique de BDA et la CTB à la peroxydase et DAB (3, 3 &#39;diaminobenzidine) a été choisi parce qu&#39;ils sont efficaces à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 6-11.

Coloration pour eGFP devrait commencer à montrer des signaux faibles dans les neurones moteurs primaires d&#39;environ 72 heures après l&#39;injection dans le muscle PRV152. La réplication et de transport transsynaptique du virus sont titer- et dépendante du temps 4. Environ 90 heures après l&#39;injection, eGFP coloration va révéler signal fort dans les cellules infectées par ordre 2 e. Prolongement de la durée de survie révéleront 3 ème et cellules d&#39;ordre supérieur mais les heures...

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant pour analyser les efférences centrales régulant les cibles périphériques par le biais de circuits multi-synaptiques. Nous présentons ici un protocole qui exploite le virus de la pseudorage transsynaptique pour identifier et localiser un circuit cérébral fonctionnel, suivi de techniques classiques de traçage de tractus pour valider des connexions spécifiques dans le circuit entre des groupes de neurones identifiés.

Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

L'objectif général de cette procédure est de découvrir le réseau prémoteur central constitué de cellules distribuées qui influencent une cible périphérique spécifique, puis de confirmer les connexions précises entre ces cellules dans le cerveau. Cela est réalisé en premier lieu par une infection rétrograde des circuits prémoteurs à l'aide d'un vecteur viral transsynaptique administré par voie périphérique via le muscle. La deuxième étape de la procédure consiste à visualiser les cellules infectées par microscopie fluorescente en lumière. La troisième étape consiste à confirmer les connexions spécifiques dans le cerveau en injectant des traceurs monosynaptiques dirigés contre des nœuds précédemment identifiés dans un circuit pré-moteur. En fin de compte, les résultats peuvent montrer comment les cellules d'un réseau pré-moteur distribué sont interconnectées grâce à une combinaison de traçage viral transsynaptique et de techniques neuroanatomiques traditionnelles monosynaptiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le traçage neuroanatomique monosynaptique traditionnel, réside dans la possibilité d'identifier les nœuds d'un réseau neurologique distribué et de résoudre les connexions spécifiques entre les cellules de ce réseau chez une souris anesthésiée.Préparez le site chirurgical en rasant les poils et en désinfectant la peau avec au moins trois frictions alternées de Bétadine et d'alcool à 70 %. Effectuez maintenant une incision cutanée dans la région du cou et exposez le muscle d'intérêt. Par exemple, pour accéder au muscle laryngé cricothyroïdien, il est nécessaire d'abord d'ôter la portion recouvrante du muscle sterno-épihyoïdien et de sceller les muscles sectionnés avec un adhésif tissulaire Vet Bond.Ensuite, charger le système de microsyringe nano fill de 10 microlitres avec la solution PR RV récemment décongelée. Éliminer lentement l'espace mort et vérifier que la solution sort de l'extrémité de la microsyringe. Jeter le liquide comme déchet biologique dangereux et monter soigneusement la microsyringe sur le dispositif stéréotaxique.À l’aide du dispositif de micro-positionnement, placer délicatement la pointe de l’aiguille dans le muscle d’intérêt. Ensuite, remplir lentement le muscle jusqu’à ce qu’un léger gonflement soit visible. Déplacer ensuite la seringue vers le muscle suivant d’intérêt, dans ce cas le muscle cricoaryténoïdien latéral, et répéter l’opération.La procédure d'injection ne fait qu'entailler chaque muscle. Le débit d'injection varie selon la taille du muscle et le volume à injecter. Par exemple, cinq injections de 200 nanolitres à un débit de quatre nanolitres par seconde doivent être réalisées à une minute d'intervalle au même site afin de remplir le muscle cricothyroïdien.Après avoir retiré la microsyringe, refermer la rupture du fascia à l’aide d’un adhésif tissulaire Vet Bond. Une fois toutes les injections terminées, fermer la plaie à l’aide d’un adhésif tissulaire Vet Bond. Surveiller l’animal jusqu’à ce qu’il adopte une position sterno-étagée.Ensuite, administrer une analgésie, de la nourriture, de l'eau et des soins selon les directives de l'animalerie de votre institution. Les modalités d'analyse de l'expression de l'EGFP et des neurones infectés par le PRV sont décrites en détail dans le protocole écrit.La préparation du tissu est très similaire à celle décrite ultérieurement dans cette vidéo. Commencez par anesthésier une souris adulte en protégeant ses yeux et en fixant la position de sa tête. Préparez ensuite le site chirurgical comme indiqué précédemment, en effectuant des alternances de désinfection avec de la Bétadine et de l'alcool à 70 %.Effectuez maintenant une incision du cuir chevelu et rétractez le cuir chevelu au-dessus du cerveau. Région d'intérêt. Réalisez une petite craniotomie à l’aide du foret aux coordonnées stéréotaxiques appropriées.Par exemple, les coordonnées du cortex moteur connecté au larynx identifiées par traçage au PRV chez une souris adulte sont situées à 1,2 millimètres latéralement et à 0,2 millimètres rostralement par rapport au bgma. Préparez ensuite une solution à 7,5 % d'amines de dextrane biotinylées dans de l'eau stérile. Chargez alors le système de micropipette NanoJet 2 avec suffisamment de solution BDA pour les injections prévues.Éliminer lentement l'espace mort et vérifier que la solution sort de l'embout de la micropipette. À l'aide du dispositif de positionnement microscopique, abaisser soigneusement l'embout de la micropipette dans la région cérébrale d'intérêt et injecter lentement la solution de BDA. Ajuster le débit en fonction de la taille de la région à marquer.Par exemple, 12 injections de 4,6 nanolitres doivent être réalisées à quatre emplacements différents, espacés de 0,2 millimètre, afin de couvrir le cortex moteur laryngé connecté chez une souris adulte.Le volume final d'injection doit être ajusté en fonction de la taille de la région d'intérêt. Garder à l'esprit que le marqueur peut diffuser depuis le site d'injection à travers le tissu cérébral et le long des prolongements des neurones marqués. Nettoyer et humidifier la trépanation avec du sérum physiologique stérile, puis fermer la plaie du cuir chevelu à l’aide d’un adhésif tissulaire Vet Bond.Surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il présente une décubitus sternal. Ensuite, administrez une analgésie, de la nourriture, de l'eau et prodiguez les soins nécessaires conformément aux directives de votre établissement en matière de bien-être animal.Six jours plus tard, la sous-unité B de la toxine du choléra peut être injectée dans le muscle de l'animal. Puis, trois jours après, l'animal doit être sacrifié pour analyse. Réaliser des coupes de 40 micromètres au cryostat et conserver les sections flottantes dans du PBS 0,1 molaire. Éteindre les sections avec du peroxyde d'hydrogène 0,3 % dans du PBS pendant 30 minutes sous agitation et à l'abri de la lumière.Lavez les sections trois fois dans du PBS pendant cinq minutes par lavage. Incubez-les ensuite pendant une heure dans une solution A b, C fraîchement préparée à température ambiante. Lavez maintenant les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes par lavage.Ensuite, développer les coupes pendant huit minutes avec agitation dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant du peroxyde d'hydrogène DAB et du chlorure de nickel. Le produit de réaction DAB à l'intérieur des cellules doit apparaître noir.Ensuite, bloquer les sections en les agitant pendant 30 minutes dans du PBS contenant 0,3 % de Tween 20 et du sérum de lapin normal provenant du kit Vector Stain Elite. Incuber ensuite les sections bloquées avec un anticorps caprin anti-CTB en agitant pendant deux heures à température ambiante. Laver ensuite les sections trois fois supplémentaires dans du PBS, cinq minutes par lavage.Appliquer l'anticorps secondaire anti-lapin provenant du kit VE et incuber les sections sous agitation pendant une heure à température ambiante. Laver les sections trois fois dans du PBS, cinq minutes par lavage, puis les faire réagir pendant 30 minutes dans une solution A, b, C fraîchement préparée à température ambiante. Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes et incuber les sections pendant huit minutes.Dans la solution de développement, le produit de la réaction DAB à l'intérieur des cellules doit apparaître brun. Montez maintenant les sections sur des lames super frosts plus, déshydratez le tissu à l'aide d'une série d'alcools gradués, suivie de deux rinçages de clarification dans le xylène. Ensuite, couvrez les lames avec du paramount et procédez à l'acquisition d'images.La coloration pour l'EGFP devrait commencer à montrer un signal faible dans les motoneurones primaires 72 heures après l'injection du P RV 1 52, la coloration devenant robuste après 90 heures. Ce noyau ambigu, qui abrite les motoneurones laryngés, est visible 94 heures après l'injection du P RV 1 52 dans deux des sept muscles laryngés. Parce que le virus est entré dans le cerveau par les neurones qui innervent les muscles infectés.D'autres pools de motoneurones atypiques, tels que le noyau du nerf hypoglosse, n'expriment pas l'EGFP après 90 heures. L'EGFP peut être observé dans les cellules de second ordre. Ces neurones du tronc cérébral ont été révélés après l'infection primaire survenue dans le noyau ambigu.L'injection était unilatérale et le motif de marquage résultant dans le tronc cérébral montre une infection du noyau homolatéral. Les interneurones réticulaires des noyaux ambigu et solitaire étaient également infectés et se coloraient fortement pour EGFP. Ces interneurones établissent des connexions avec diverses structures, notamment les pools de motoneurones moteurs et le noyau ambigu controlatéral.Cependant, leurs cibles efférentes restent non marquées car le virus ne se propage que dans le sens rétrograde. La durée de survie avec le PRV est limitée, mais peut révéler une coloration EGFP dans les cellules de troisième ordre et d'ordres supérieurs infectées ; les neurones prémoteurs du cortex moteur exprimaient EGFP du côté controlatéral par rapport au site d'injection périphérique. On suppose que seule la population de cellules constituant la représentation corticale motrice de la musculature laryngée a été infectée.Les axones marqués par le BDA au niveau du noyau ambigu, indiqué par des flèches, entrent en contact avec les motoneurones positifs au CTB, rétrogradement marqués par des injections dans les muscles laryngés (visibles en brun). Les axones forment des varicosités et des bâtonnets terminaux putatifs près des dendrites des motoneurones laryngés ainsi que près du soma de ces motoneurones. Des expériences supplémentaires utilisant la microscopie électronique ou l'électrophysiologie sont nécessaires pour déterminer si ces varicosités représentent des synapses. Une injection bilatérale de BDA réalisée dans le cortex moteur connecté au larynx apparaît en noir, car le BDA n'est pas directionnellement spécifique, de sorte que les connexions afférentes et efférentes peuvent être marquées.Par exemple, on observe dans le thalamus à la fois un champ de projection marqué de façon antérograde et des corps cellulaires marqués de façon rétrograde. Les cellules thalamiques sont indiquées par la flèche et la capsule interne est repérée à des fins d'orientation. N'oubliez pas que le travail avec le virus de la rage pseudo et le DAB peut être extrêmement dangereux et nécessite des précautions telles que la stérilisation.Tous les matériaux ayant été en contact avec le PRV ou le DAB ont été traités avec une solution d'eau de javel à 10 %. Une élimination appropriée des déchets biologiques solides et liquides, conformément aux réglementations de votre établissement, doit toujours être effectuée lors de la réalisation de cette procédure.

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Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage

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