Transsynaptique Tracing de cibles périphériques avec virus de la pseudo Suivi par la toxine cholérique et biotinylé Dextran Amines double marquage

L’objectif global de cette procédure est de découvrir le réseau prémoteur central des cellules distribuées qui interagissent avec une cible périphérique spécifique, puis de confirmer les connexions spécifiques entre ces cellules dans le cerveau. Ceci est accompli en infectant d’abord rétrograde les circuits prémoteurs avec un vecteur viral transsynaptique qui est délivré par voie périphérique à travers le muscle. La deuxième étape de la procédure consiste à visualiser les cellules infectées au microscope fluorescent optique.

La troisième étape consiste à confirmer des connexions spécifiques dans le cerveau en injectant des traceurs synaptiques monos ciblés sur des nœuds préalablement identifiés dans un circuit prémoteur. En fin de compte, les résultats peuvent montrer comment les cellules d’un réseau prémoteur distribué sont connectées les unes aux autres par une combinaison de traçage viral transsynaptique et de techniques neuro-anatomiques monosynaptiques traditionnelles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le neurotraçage monosynaptique traditionnel, est que les nœuds d’un réseau neurologique distribué peuvent être identifiés et que les connexions spécifiques entre les cellules de ce réseau peuvent être résolues sur une souris anesthésiée.

Préparez le site chirurgical en coupant les cheveux et en désinfectant la peau avec au moins trois gommages alternés de bétadine et d’alcool à 70 %. Faites maintenant une incision cutanée dans la région de la gorge et révélez le muscle d’intérêt. Par exemple, pour accéder au muscle laryngé cricothyroïdien, il est nécessaire de retirer d’abord la partie sus-jacente du muscle Sterno hyoïde sceller tous les muscles transectés avec un adhésif tissulaire vet bond.

Ensuite, chargez le système de micro-seringue nano fill de 10 microlitres avec une solution PR RV fraîchement décongelée. Nettoyez lentement l’espace mort et vérifiez que la solution sort de l’embout de la micro-seringue. Jetez le liquide en tant que déchet biologique dangereux et montez-le soigneusement sur l’appareil stéréotaxique.

À l’aide du dispositif de micro-positionnement, placez soigneusement la pointe de l’aiguille dans le muscle d’intérêt. Ensuite, remplissez lentement le muscle jusqu’à ce qu’un léger gonflement soit visible. Déplacez maintenant la seringue vers le muscle d’intérêt suivant, le crico-aryténoïde latéral dans ce cas, et répétez.

La procédure d’injection ne perfore que chaque muscle. Une fois le taux d’injection variera en fonction de la taille du muscle et du volume à injecter. Par exemple, cinq injections de 200 nanolitres à raison de quatre nanolitres par seconde doivent être effectuées à une minute d’intervalle au même endroit pour remplir le muscle cricothyroïdien.

Après avoir rétracté la micro-seringue, scellez la rupture du fascia à l’aide d’un adhésif tissulaire Vet Bond. Une fois toutes les injections terminées, fermez la plaie à l’aide d’un adhésif pour tissus Vet Bond. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il montre un gisant sternal.

Ensuite, fournissez des analgésiques, de la nourriture, de l’eau et des soins selon les besoins de votre animal institutionnel. Directives d’utilisation. La procédure d’analyse de l’expression de l’EGFP et des neurones infectés par le PRV est décrite en détail dans le protocole texte.

Le traitement des tissus est très similaire à celui abordé plus loin dans cette vidéo. Commencez par anesthésier une souris adulte, protégez ses yeux et fixez la position de sa tête. Préparez ensuite le site chirurgical comme indiqué précédemment avec une alternance de gommages de bétadine et d’alcool à 70 %.

Faites maintenant une incision du cuir chevelu et rétractez le cuir chevelu sur le cerveau. Région d’intérêt. Effectuez une petite craniotomie avec la perceuse aux coordonnées stéréotaxiques appropriées.

Par exemple, les coordonnées du cortex moteur connecté au larynx identifiées par le traçage du PRV chez une souris adulte sont de 1,2 millimètre latéralement et de 0,2 millimètre rostrale par rapport au bgma. Ensuite, préparez une solution à 7,5 % d’amines dextran biotinylées dans de l’eau stérile. Chargez ensuite le système de micro-pipettes nano jet avec suffisamment de solution BDA pour les injections prévues.

Nettoyez lentement l’espace mort et vérifiez que la solution sort de la pointe de la micro-pipette. À l’aide du dispositif de micro-positionnement, abaissez soigneusement la pointe de la micro-pipette dans la région cérébrale d’intérêt et injectez lentement la solution BDA. Ajustez le taux en fonction de la taille de la région à étiqueter.

Par exemple, 12 injections de 4,6 nanolitres doivent être effectuées à quatre endroits différents, à 0,2 millimètre de distance. Dorloter Stro pour couvrir le cortex moteur connecté laryngé chez une souris adulte.

Le volume d’injection final doit être ajusté en fonction de la taille de la région d’intérêt. En gardant à l’esprit que l’étiquette peut se diffuser à partir du noyau d’injection à travers le tissu cérébral et le long des processus des neurones marqués. Nettoyez et humidifiez la craniotomie avec une solution saline stérile et fermez la plaie du cuir chevelu à l’aide d’un adhésif tissulaire Vet Bond.

Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il montre un gisant sternal. Ensuite, fournissez des analgésiques, de la nourriture, de l’eau et des soins selon les besoins de votre animal institutionnel. Directives d’utilisation.

Six jours plus tard, la sous-unité B de la toxine cholérique peut être injectée dans le muscle de l’animal. Ensuite, dans trois jours, l’animal doit être sacrifié pour analyse. Coupez des sections à 40 microns sur un cryostat et enregistrez les sections flottantes dans du PBS 0,1 molaire, trempez les sections avec du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % dans du PBS pendant 30 minutes en secouant et à l’abri de la lumière.

Lavez les sections trois fois dans du PBS pendant cinq minutes par lavage. Ensuite, faites-les réagir pendant une heure dans une solution A, b, C fraîchement préparée à température ambiante. Maintenant, lavez les sections trois fois dans un tampon de phosphate pendant 10 minutes par lavage.

Ensuite, développez les sections pendant huit minutes en les agitant dans un tampon phosphate. pH 7,4 contenant du peroxyde d’hydrogène DAB et du chlorure de nickel. Le produit de réaction DAB à l’intérieur des cellules doit apparaître noir.

Ensuite, bloquez les sections en agitant pendant 30 minutes dans du PBS contenant 0,3 % entre 20 avec du sérum de lapin normal du kit de coloration vectorielle élite. Ensuite, incubez les sections bloquées dans un anti CTB de chèvre en secouant pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, lavez les sections trois fois de plus dans du PBS pendant cinq minutes par lavage.

Appliquez l’anticorps secondaire antigo de lapin du kit VE et incubez les sections en agitant pendant une heure à température ambiante. Lavez les sections trois fois dans du PBS pendant cinq minutes par lavage, puis faites-les réagir pendant 30 minutes dans une solution A, b, C fraîchement préparée à température ambiante. Lavez les sections trois fois dans un tampon de phosphate pendant 10 minutes et incubez les sections pendant huit minutes.

Dans la solution de développement, le produit de réaction DAB à l’intérieur des cellules doit apparaître brun. Montez maintenant les sections sur les super givres et les lames sur les lames, déshydratez le tissu à travers des séries d’alcool graduées, suivies de deux lavages de nettoyage au xylène. Ensuite, couvrez, glissez les diapositives avec du primordial et procédez à l’imagerie.

La coloration pour EGFP devrait commencer à montrer un signal faible dans les motoneurones primaires 72 heures après l’injection de P RV 1 52, la coloration devenant robuste après 90 heures. Ce noyau ambigu, qui abrite les motoneurones laryngés, est visible 94 heures après l’injection de P RV 1 52 dans deux des sept muscles laryngés. Parce que le virus est entré dans le cerveau par des neurones qui innervent les muscles infectés.

D’autres pools de motoneurones atorigènes, tels que le noyau hypoglosse, n’expriment pas l’EGFP après 90 heures. L’EGFP peut être vu dans les cellules de second ordre. Ces neurones du tronc cérébral ont été colorés après la primo-infection dans le noyau ambigu.

L’injection a été unilatérale et le modèle de marquage qui en résulte dans le tronc cérébral montre une infection du noyau ipsilatéral. Les interneurones réticulaires du noyau ambigus et solitaires ont également été infectés et se colorent fortement pour l’EGFP. Ces interneurones relient diverses structures, notamment les bassins de motoneurones atorigènes et le noyau controlatéral. Ambigu.

Cependant, leurs cibles efférentes ne sont pas étiquetées car le virus ne se propage que dans le sens rétrograde. Le temps de survie avec le PRV est limité, mais peut montrer une coloration EGFP dans les cellules tierces et supérieures infectées par les neurones prémoteurs du cortex moteur exprimant EGFP controlatéral au site d’injection périphérique. On peut supposer que seule la population de cellules qui composait la représentation corticale motrice de la musculature laryngée a été infectée.

BDA : axones marqués au niveau du noyau, ambigus, marqués par des pointes de flèches, entrent en contact avec les motoneurones CTB positifs, rétrogrades, marqués par des injections dans les muscles laryngés observés en brun, les axones forment des varicosités et des bâtons terminaux putatifs près des dendrites des motoneurones laryngés et près du soma des motoneurones laryngés. D’autres expériences utilisant la microscopie électronique ou l’électrophysiologie sont nécessaires pour déterminer si ces varicosités représentent des synaptes. Une injection bilatérale de BDA placée dans le cortex moteur connecté au larynx est visible en noir car le BDA n’est pas spécifique à la direction, les connexions afférentes et efférentes peuvent être marquées.

Par exemple, un champ de projection de marquage antérograde et des corps cellulaires marqués par rétrograde sont observés dans le thalamus. Les cellules thalamiques sont identifiées par la pointe de la flèche et la capsule interne est étiquetée pour l’orientation. N’oubliez pas que travailler avec le virus de la pseudo-rage et le DAB peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la stérilisation peuvent être prises.

Tous les matériaux qui ont été en contact avec le PRV ou le DAB à l’aide d’une solution d’eau de Javel à 10 %. Une élimination appropriée des déchets solides et liquides présentant un risque biologique conformément à la réglementation de votre établissement doit toujours être prise lors de l’exécution de cette procédure.