Name: Infinium Assay pour Grands génotypage SNP Applications (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Découvrez le protocole Infinium pour le génotypage à grande échelle de millions de SNPs sur des centaines d'échantillons d'ADN en trois jours. Cette méthode Illumina facilite les études d'association maladie.

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Le financement de ce travail a été fourni par le NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, et les NIH R56 AI063274

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</ol>

Les auteurs de cet article n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents de divulguer.

Applications de génotypage à grande échelle ont été utilisées pour mieux comprendre le mécanisme génétique sous-jacente de nombreuses maladies humaines. La découverte d&#39;une variante importante grâce à une analyse de génome d&#39;association peut signaler une région candidate pour une étude plus approfondie. En outre, les données de génotype est un bon outil pour le contrôle de la qualité des projets de séquençage. Pour maximiser le débit d&#39;échantillons, de plaques échantillons multiples peuvent être amplifiés et stockés dans leurs Etats, remis en suspension fragmentés. Huit plaques peuvent être amplifiées en une seule journée, en combinant les 24 premières heures du protocole pour plusieurs lots et de fournir suffisamment de matière pour ~ 2-8 jours de la puce de traitement. Si les plaques amplifiés sont stockées à l&#39;avance, et si de nouveaux échantillons sont hybridées à des puces immédiatement après la numérisation commence sur la course précédente, le traitement peut fonctionner en continu sans avoir besoin de faire une pause pour la préparation de l&#39;échantillon supplémentaire. Par conséquent, bien que les échantillons auront trois jours pour subir la complèteessai, les données peuvent être générés quotidiennement. copeaux de Assuming24 sont traitées chaque jour, une semaine de travail de 5 jours permet depuis plus de 1000 échantillons d&#39;ADN pour être exécuté sur une puce de perles 12-échantillon. Si une étape ou réactif a échoué, cependant, plusieurs lots pourraient être à risque de mauvaise performance avant toute correction peut être appliquée. Des erreurs peuvent échapper à l&#39;attention jusqu&#39;à ce que les réseaux sont scannés ou analysés, par conséquent, si le débit est maximisé, des centaines d&#39;échantillons à différents stades du protocole pourraient déjà avoir reçu le même traitement défectueux lors de la découverte. Comme les réactifs et les données perdues ne peuvent pas être récupérés, l&#39;utilisateur doit peser ces risques contre la nécessité d&#39;un flux de travail accéléré. Le logiciel d&#39;analyse GenomeStudio est la première occasion de mesurer réellement la réussite du processus de génotypage. Si la norme R-vs parcelles d&#39;intensité Norm-Theta sont bien regroupés, le taux moyen de l&#39;appel (pour cent du total SNP tapé avec succès) des échantillons devrait approcher 99%, bien que cette valeur varie sliselon ghtly le type de tableau. Les données de n&#39;importe quel échantillon avec un taux inférieur à 85-90% d&#39;appels n&#39;est pas digne de confiance et doivent être jetés. À des fins de contrôle de la qualité, les résultats doivent être comparés à des génotypes déjà connues chaque fois que possible. Si aucune donnée n&#39;existe, intentionnelle duplication de l&#39;échantillon est un outil utile pour vérifier la plaque ou tableau placements. Ces paires en double doivent être placés sur des puces séparées, des assiettes, des lots, ou des projets; leurs génotypes vérifiés lors de la génération. Bien que les contraintes QC spécifiques varient en fonction de la préférence de l&#39;enquêteur, les contraintes communes SNP sont basés sur la réussite exemple d&#39;appel, Hardy-Weinberg, ou manquantes entre les cas et les témoins, tandis que les contraintes de l&#39;échantillon communes sont basés sur les taux d&#39;appel, les incohérences de Mendel, ou des références croisées de X-chromosome hétérozygotie des données cliniques entre les sexes [13]. En cas de problème, le tableau de bord des contrôles, a trouvé dans la suite de l&#39;analyse, peut être soumis à laentreprise afin de déterminer la cause. Ces contrôles peuvent souvent limiter la question à l&#39;étape la plus probable ou l&#39;échec de réactif. Si des SNP d&#39;intérêt se trouvent à travers une expérience de génotypage Infinium, leurs parcelles d&#39;intensité doivent être vérifiées dans GenomeStudio pour les erreurs de regroupement avant est effectué de nouvelles recherches. Une expérience de génotypage Infinium pas est probablement dû à une erreur de manipulation humaine ou l&#39;ADN d&#39;entrée de mauvaise qualité. quantification de l&#39;échantillon doit être exacte et précise. Pour de meilleurs résultats, tous les réactifs ajoutés à un échantillon ou puce doivent être dispensés au volume fixé par le protocole. Les pipettes doivent être correctement calibrés. Réactifs ne doivent pas être exécutés après expiration et ne doivent pas être recongelés une fois décongelé, sauf pour le réactif RA1. Afin de minimiser les erreurs de coloration et de vulgarisation possibles, le mélange formamide / EDTA doit être préparé chaque mois. Tous les -20 C ° réactifs doivent être stockés dans des congélateurs à dégivrage non automatique seulement. Tout le matériel de laboratoire utilisé dans la mAining, de vulgarisation, et lavage des parties du protocole doivent être rincés abondamment à l&#39;eau et un détergent doux dès désuétude. Les réservoirs d&#39;humidification dans la chambre de hyb doivent être lavés avec une brosse en tube à essai et un détergent doux. Les lames de verre doivent être lavés avec l&#39;eau de Javel à 10%, selon les instructions de leurs manuels de l&#39;utilisateur, une fois par semaine.

Taper polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) est une méthode clé de l&#39;identification des variantes de risque associés à la maladie. Historiquement, le champ d&#39;application de génotypage a été limitée par la technologie disponible. méthodes de génotypage basés sur l&#39;électrophorèse sur gel sont limitées dans l&#39;échantillon-et SNP-débit [1]. Le développement de ces tests peut souvent être main-d&#39;œuvre, en s&#39;appuyant sur ​​la composition et la structure de la région entourant la variante pour l&#39;optimisation [1]. TaqMan de génotypage, développé par Life Technologies, peuvent exécuter un grand nombre d&#39;échantillons rapidement et avec la participation de technicien minimal [2], mais les restrictions SNP-multiplexage continuent de limiter le nombre total de génotypes à bien moins d&#39;un million par jour [3,4 ]. La plate-forme iPlex Sequenom peut également exécuter plusieurs échantillons à la fois, mais, étant donné que moins d&#39;une centaine de SNPs peuvent être multiplexés, ce débit est comparable globalement faible [5]. La technologie de flux SNP de Beckman Coulterpourrait théoriquement produire plus de trois millions de génotypes par jour, mais cette gamme limites de la technologie du projet à un maximum de seulement quarante-huit SNPs par réaction [4,6]. Bien que l&#39;essai GoldenGate peut traiter près de deux cents échantillons d&#39;ADN chaque jour sur des centaines ou des milliers de SNP par exemple, le prix par génotype n&#39;est pas compétitif avec des techniques ultra-haut débit de pointe lors de la saisie de plus de trois mille SNP à la fois [4,7 ]. Afin de traiter plusieurs millions de génotypes par jour, à l&#39;échelle requise pour les grandes études d&#39;association pangénomique, analyses tableau d&#39;hybridation sont devenus l&#39;option la plus rentable sur le marché. La ligne de Affymetrix de tableaux d&#39;hybridation et de la ligne d&#39;Illumina de tableaux basés sur Infinium permettent potentiellement des centaines d&#39;échantillons à taper sur des centaines de milliers ou des millions de SNP en parallèle [4,8]. Ces SNP peuvent être dispersés sur l&#39;ensemble du génome, localisée dans les régions d&#39;intérêt, tels que les exomes, ou sur mesure selon les préférences de l&#39;utilisateur. Ces tableaux ont l&#39;avantage d&#39;être non seulement en mesure de déterminer le génotype précision d&#39;un million de SNPs par échantillon à la fois, mais aussi de mesurer la variation du nombre de copies, des anomalies chromosomiques potentiellement dévoilement. Infinium alignés tableaux OMNI BeadChip ont actuellement la capacité de génotype à près de cinq millions de marqueurs par échantillon, y compris un demi-million de loci de coutume, sur un maximum de près d&#39;une centaine d&#39;échantillons chaque jour. Comme la plupart des maladies ont une composante génétique, ces expériences à grande échelle peuvent être crucial dans la recherche des gènes associés à la maladie. Génotypage à haut débit permet de production efficace de génotype dans l&#39;échantillon fixe suffisante pour détecter de façon convaincante association génétique à des fréquences des allèles mineurs inférieurs. Projets de génotypage du génome entier peuvent être utilisés pour localiser des régions avec statistiquement significative cas-contrôle la fréquence des allèles ou des différences du nombre de copies [9,10,11]. Selon le National Human GeInstitut de recherche nome, les études d&#39;association du génome a conduit à 1490 publications distinctes entre le 25 Novembre 2008 et le 25 Janvier 2013, découlant de la découverte de 8283 SNP avec une p-valeur inférieure à 1 x 10 -5 (voir http:// www.genome.gov/gwastudies/). Ces études, qui fait des recherches sur des conditions allant de la hauteur de cancer du testicule, bénéficié de l&#39;approche globale offerte par une analyse de l&#39;ensemble du génome. Dans de tels cas, des régions entières d&#39;intérêt pourraient avoir échappé à l&#39;attention avait la portée de taper trop restrictive. Ainsi, pour les analyses d&#39;association à grande échelle, une technique de génotypage du génome est la technique de choix. Différentes versions de l&#39;essai Infinium existent, chacun destiné à être utilisé avec des types spécifiques de tableaux. Le dosage InfiniumUltra, discuté en détail ci-dessous, est approprié pour beaucoup 12 - ou 24-échantillons des puces de tableau. Ce génotype souvent plus de cent mille SNP par échantillon d&#39;ADN et de se concentrer sur trégions argeted, comme sur exome ou personnalisés panneaux. D&#39;autres versions de dosage peuvent être nécessaires pour d&#39;autres types de puces, telles que les matrices de génotypage du génome entier. Cependant, comme tous les tests Infinium partagent une base commune et diffèrent principalement que par les noms de réactifs, les volumes de réactifs ou de la procédure de réactif de coloration exacte, techniques perfectionnées sur une seule version d&#39;essai peuvent souvent être universellement appliquées. D&#39;autres tableaux, comme les tableaux de méthylation, peuvent utiliser un protocole pratiquement identique, aussi bien. Il faut prendre soin de n&#39;utiliser que la version du dosage requis pour le type de puce en cours d&#39;utilisation. Certains types, tels que ceux mesurant le niveau d&#39;expression des gènes, peuvent nécessiter l&#39;utilisation d&#39;un protocole de nonInfinium. Les échantillons doivent être traitées par lots. Par exemple, avec le dosage InfiniumUltra, tubes de réactif de pré-hybridation contiennent un volume suffisant pour exécuter 96 échantillons, et les tubes ne peuvent être recongelés. Par conséquent, les échantillons doivent être analysés en lots de 96 échantillons à la fois. Les échantillons seront amplifiés sur les sapinst jour. Après environ 1 heure de travail d&#39;établi, les échantillons doivent être chauffés dans un four à convection pendant 20-24 h. Le lendemain, près de 4 heures sera consacré fragmentation, la précipitation, et remise en suspension des échantillons, à quel point les échantillons peuvent être soit congelés pour une utilisation ultérieure ou hybridées sur la puce. Chargement puces prend près de 2 heures, après quoi les échantillons seront hybrides pendant une nuit pour 16-24 heures. Le troisième jour, l&#39;étape de coloration et d&#39;extension prend ~ 4 heures. Une heure supplémentaire sera consacré à laver, de revêtement, et le séchage des copeaux. Enfin, les tableaux sont analysés, ce qui peut prendre de 15 à 60 min / puce, selon le type utilisé. Les précautions de sécurité de laboratoire et de propreté standard s&#39;appliquent. Bien que basée sur la PCR de l&#39;amplification n&#39;est pas, les postes de travail séparés pour pré-et postamplification procédures sont nécessaires afin de minimiser la probabilité de contamination. Le numéro d&#39;identification de chaque réactif du kit fourni dans l&#39;utilisation doit être connecté sur une feuille de suivi. Reagents doivent être décongelés avant utilisation et immédiatement inversés plusieurs fois avant la distribution. L&#39;ADN doit être dactylographié doit être de l&#39;ADN génomique de haute qualité (260/280 rapport d&#39;absorbance de 1,6-2,0, 260/230 rapport d&#39;absorbance inférieure à 3,0), isolé par des méthodes classiques et quantifiés avec un fluorimètre. La dégradation de l&#39;ADN est souvent un facteur contribuant dans les résultats d&#39;analyse de qualité médiocre. Typiquement, 200 ng d&#39;ADN est nécessaire, si ce montant peut varier pour certains types de puces. Un robot de liquide de traitement Tecan peut automatiser de nombreuses étapes du protocole et de minimiser l&#39;erreur humaine comme un facteur.

<table><tbody><tr><td><fort>Consommable ou équipement</strong</td><td>>Fabricant<</td><td>strong>Part Number</td><td>Minimum requis pour 96 échantillons</td></tr><tr><td>0.8 ml Deep Well Plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0765</td><td>1</td></tr><tr><td>Tapis de plaques</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0674</td><td>2</td></tr><tr><td>Bassin de réactifs</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>9</td></tr><tr><td>Feuilles thermosoudables</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0559</td><td>1</td></tr><tr><td>Entretoise à écoulement</td><td>continu Fisher Scientific</td><td>NC9563984</td><td>6</td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 200 &mu ; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>192</td></tr><tr><td>Pointes de pipette - 10 &mu ; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>16</td></tr><tr><td>pointes de pipette - 1 000 &mu ; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td>16</td></tr><tr><td>DNA Suspension</td><td>Buffer Teknova</td><td>T0220</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>0,1 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12419-0010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol (grade HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Éthanol (200-proof)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>330 ml</td></tr><tr><td>Formamide (100 %)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001K38</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td>0,2 ml</td></tr><tr><td>10 &mu ; l Pipette 8 canaux</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>200 &mu ; l Pipette 8 canaux</td><td>Rainin</td><td>L8-200XLS</td><td>2</td></tr><tr><td>1 000 &mu ; l Pipette monocanal</td><td>Rainin</td><td>L-1000XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>Agitateur de microplaques</td><td>VWR</td><td>13500-890</td><td>1</td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée pour microplaques</td><td>VWR</td><td>BK369434</td><td>1</td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Illumina</td><td>SE-901-1001</td><td>1</td></tr><tr><td>Incubateur de micro-échantillons Hybex</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>1</td></tr><tr><td>Insert</td> <td>de bloc chauffant MIDI HybexIllumina</td><td>BD-60-601</td><td>1</td></tr><tr><td>Thermosoudeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0384</td><td>1</td></tr><tr><td>Chambre Hyb avec insert et tapis</td><td>Illumina</td><td>BD-60-402</td><td>2</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-20</td><td>1</td></tr><tr><td>Pièces d’assemblage Illumina</td><td></td><td>WG-10-202</td><td>8</td></tr><tr><td>Grille de lavage et vaisselle</td><td>Illumina</td><td>BD-60-450</td><td>1</td></tr><tr><td>Genepaint Rack de chambre</td><td>Tecan</td><td>760-800</td><td>1</td></tr><tr><td>Sonde de température</td><td>Illumina</td><td>A1-99-109</td><td>1</td></tr><tr><td>Grille de coloration et plat</td><td>Illumina</td><td>WG-10-207</td><td>1</td></tr><tr><td>Pince à épiler à fermeture automatique</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>5374-NM</td><td>1</td></tr><tr><td>Collecteur à vide</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>2240</td><td>1</td></tr><tr><td>iScan ou HiScan</td><td>Illumina</td><td>- </td><td>1</td></tr></tbody></table>

infinium assay pour grands génotypage snp applications

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

variantes de génotypage du génome humain s&#39;est avérée être une méthode efficace pour identifier les associations génétiques des phénotypes. La distribution des variantes au sein des familles ou des populations peut faciliter l&#39;identification des facteurs génétiques de la maladie. Le panneau d&#39;Illumina de BeadChips de génotypage permet aux enquêteurs de génotype des milliers ou des millions de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ou d&#39;analyser d&#39;autres variantes génomiques, tels que le nombre de copie, à travers un grand nombre d&#39;échantillons d&#39;ADN. Ces SNP peuvent être répartis sur tout le génome ou ciblées dans des régions spécifiques afin de maximiser le potentiel de découverte. L&#39;essai Infinium a été optimisé pour obtenir rapidement de haute qualité, des résultats fiables. Avec une configuration correcte, un seul technicien peut traiter de quelques centaines à plus d&#39;un millier d&#39;échantillons d&#39;ADN par semaine, selon le type de tableau. Ce test guide les utilisateurs à travers chaque étape, en commençant par l&#39;ADN génomique et se terminant avec le balayage de la matrice. Utilisation de bienséance Reagents, ​​les échantillons sont amplifiés, fragmenté, précipité, remis en suspension, hybridé à la puce, prolongée par une base unique, souillé, et scanné soit sur un système d&#39;imagerie optique à haute résolution iScan ou Salut Scan. Une étape d&#39;une nuit est nécessaire pour amplifier l&#39;ADN. L&#39;ADN est dénaturé et isotherme amplifié par amplification du génome entier et, par conséquent, pas de PCR est nécessaire. Les échantillons sont hybridées aux puces à ADN au cours d&#39;une seconde étape d&#39;une nuit. Dès le troisième jour, les échantillons sont prêts à être numérisée et analysée. L&#39;ADN amplifié peut être stocké en grandes quantités, ce qui permet des arrangements de billes à traiter chaque jour de la semaine, en maximisant ainsi le débit.

Une puce de perles bien-traité devrait afficher des intensités de lumière laser rouge et vert lumineux et distincts pendant la numérisation. Dans la figure 6, le logiciel de numérisation iScan affiche un échantillon d&#39;ADN génomique norme hybride avec succès à une coutume panneau tableau SNP de génotypage. Les nucléotides marqués qui ont été attachés pendant la prolongation et de coloration étapes fluorescence sous les lumières des deux lasers. Comme ces nucléotides s&#39;étendent de façon sélective la chaîne oligonucléotidique du bourrelet hybridée au brin de l&#39;ADN fragmenté, et que les chaînes oligonucléotidiques sont conçues pour se terminer au niveau du site de la variante, la couleur et l&#39;intensité du signal résultant peut être utilisé pour déterminer les allèles présents à l&#39; place SNP. Une feuille généré par les utilisateurs échantillon, ce qui correspond ID d&#39;échantillon et les renseignements cliniques à CHIPID et la position, et un SNP manifeste spécifique au réseau, obtenu directement à partir de l&#39;entreprise, sont à la fois nécessaire pour importer le scales fichiers de sortie de nner dans le logiciel d&#39;analyse GenomeStudio. Feuilles exemple d&#39;échantillons peuvent être trouvés sur le site Web de l&#39;entreprise. Une fois le projet GenomeStudio est construit, les génotypes peuvent être obtenus à partir des pôles d&#39;intensité résultant générés automatiquement par le logiciel. Bien que plusieurs options d&#39;affichage existent, la vue par défaut, Norm-R (une valeur d&#39;intensité normalisée) vs Norm-Theta (un ratio de l&#39;intensité allélique), est souvent l&#39;intrigue la plus facile de différencier trois groupes distincts. La plupart des SNP devraient montrer un, deux, ou trois groupes, en fonction de la fréquence de l&#39;allèle mineur. Les trois groupes représentent des échantillons démontrant AA, AB ou BB allèles (voir Figure 7). Ces groupes peuvent être affectés génotypes soit par l&#39;importation d&#39;un modèle de position de regroupement standard directement à partir de l&#39;entreprise, en sélectionnant «Cluster Tous les SNP&quot; de la barre d&#39;outils d&#39;analyse du logiciel, ou en cliquant et en faisant glisser les cercles colorés sur les parcelles d&#39;intensité à l&#39;EDI manuellement<html> t appelle. La couleur de l&#39;échantillon sur le terrain de l&#39;intensité (rouge, violet ou bleu) indique que l&#39;appel (AA, AB ou BB, respectivement); noir indique aucun appel. En faisant défiler les SNP répertoriés dans le volet de données complète du logiciel, le regroupement pour chaque SNP peut être consulté ou rappelé. Une fois que les groupes sont affectés appels satisfaisants, le volet de données complète du logiciel répertorie les génotypes pour chaque échantillon à chaque SNP particulier. L&#39;option Colonne Sélecteur dessus de la table peut basculer formats de données. Les données peuvent être exportées, soit par la barre d&#39;outils d&#39;analyse ou directement à partir de la table de données complet pour une analyse en profondeur. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. Aperçu - Infinium protocole de test.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> Figure 2. Complète Hyb Chambre base et tapis, plus couvercle. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Figure 3 Chargement d&#39;un BeadChip -.. Déposer l&#39;échantillon sur les ports d&#39;entrée [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir</a><html> l&#39;image. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Figure 4 Retrait de la BeadChip Coverseal -.. Saisissez le joint dans le coin et retirez délicatement diagonale [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> Figure 5. Ensemble complet BeadChip accréditives - Le BeadChip est séparée d&#39;une lame de verre avec une entretoise et lié avec des agrafes.&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> Figure 6. Le succès de numérisation BeadChip - A) Le BeadChip est scanné à la fois un laser rouge et vert, les logiciels de numérisation affiche à la fois simultanément. Sections passant intensité QC mettront en lumière verte sur l&#39;écran de BeadChip à gauche. Sections défaut intensité QC mettra en lumière rouge sur l&#39;écran de BeadChip. B) Une fois la numérisation terminée, le logiciel superposer les affichages rouges et verts. Une image zoomée s&#39;affiche. La couleur et l&#39;intensité de chaque bille individuelle indique l&#39;allèle présent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.wimince-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Figure 7. SNP NORM-R vs-Theta NORM Profils du cluster - A) Un SNP valide avec trois groupes distincts représentant AA, AB, BB et génotypes, de couleur rouge, violet et bleu B) Un SNP nécessitant édition.. Le groupe du milieu, qui doit être homozygote AB, est laissé non appelé. Le groupe BB est appelée à tort AB. C) Un SNP peu performant. Pas de génotypes peuvent être obtenus à partir de cette parcelle d&#39;intensité, comme aucun grappes distinctes existent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

Un protocole est décrit qui utilise les tests de Infinium d&#39;Illumina pour effectuer le génotypage à grande échelle. Ces dosages peuvent fiable génotype millions de SNP à travers des centaines d&#39;échantillons d&#39;ADN individuels en trois jours. Une fois généré, ces génotypes peuvent être utilisés pour vérifier les associations avec une variété de différentes maladies ou phénotypes.

Infinium Assay pour Grands génotypage SNP Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser avec succès le test Infinium afin de traiter une puce à ADN pour le génotypage. Cela est réalisé en amplifiant, fragmentant et isolant d'abord l'ADN. La deuxième étape consiste à hybridation du brin d'ADN dénaturé aux oligonucléotides fixés sur des billes de la matrice.Ensuite, l'oligonucléotide fixé sur la perle est coloré et étendu de manière sélective d'une base. La dernière étape consiste à analyser les puces à perles afin de détecter le nucléotide marqué. En définitive, les résultats de génotype sont utilisés pour déterminer les allèles présents au site d'intérêt.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car de nombreuses étapes de coloration et de chargement des puces à abeilles sont difficiles à apprendre. De nombreuses manipulations ne se retrouvent dans aucune autre méthode de génotypage, et plusieurs équipements portent des noms très similaires. Un jour avant l'amplification, préparez la distribution d'ADN en ajoutant 200 nanogrammes d'ADN par puits dans une plaque 96 puits profonds.Il faut planter au moins 96&nbsp;échantillons afin de garantir qu'aucun réactif ne soit gaspillé. Étiquetez la plaque avec une vignette à code-barres fournie dans le kit et centrifugez-la afin de normaliser les volumes. Laissez les échantillons dans un tiroir ou sous une hotte aspirante toute la nuit pour évaporation du liquide.Couvrir la plaque de manière lâche avec un couvercle ou une serviette en papier afin d’éviter la poussière le lendemain matin. Vérifier que les puits sont secs. Utiliser un récipient pour réactif et une pipette multicanaux de 10 microlitres à huit canaux pour distribuer quatre microlitres de tampon de resuspension d’ADN dans chaque puit afin de réhydrater les échantillons. Si l’on prend soin de ne pas toucher le liquide, il n’est pas nécessaire de jeter les embouts de pipette entre chaque colonne.Ensuite, distribuez 20 microlitres du réactif MA un dans chaque puits de la plaque à l’aide d’une pipette à huit canaux et d’un nouveau réservoir de réactif. Couvrez la plaque avec un scellé réutilisable, effectuez une courte centrifugation, puis agitez pendant une minute à 1600 tr/min sur un agitateur pour microplaque, et incubez à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Les étapes restantes de l’amplification ne seront pas montrées dans cette vidéo, mais le protocole est disponible dans l’article joint.Une fois tous les réactifs ajoutés, placer la plaque dans un four correctement étalonné réglé à 37 degrés Celsius pendant 20 à 24 heures. Après l'amplification, les échantillons d'ADN sont fragmentés et précipités comme décrit dans le manuscrit après la précipitation dans une centrifugeuse à grande vitesse. Examiner le fond de la plaque sans l'inverser.Pour confirmer que les échantillons sont précipités en un culot bleu, jetez le couvercle et retirez rapidement le liquide en retournant la plaque et en la tapotant fermement sur le plan de travail recouvert de papier essuie-tout. Une fois la plaque retournée, veillez à ne pas la remettre à l'endroit. Tant que du liquide reste, tapez répétitivement la plaque contre le plan de travail jusqu'à ce que tout le liquide soit éliminé.Placer la plaque sur un support pour tubes à essai, inversée, afin de l'incuber à l'air libre à température ambiante pendant une heure. Ensuite, l'ADN est remis en suspension pour commencer la procédure d'hybridation. Placer une plaque de 96 puits contenant l'ADN remis en suspension sur un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes.Pour dénaturer l'ADN après 20 minutes, retirez la plaque d'échantillons du bloc chauffant et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant que la plaque d'échantillons refroidit, préparez la chambre à alvéoles. Une chambre sera nécessaire pour chaque groupe de quatre puces à abeilles traitées. Placez un tapis en caoutchouc sur le dessus de la base de la chambre à alvéoles en alignant le trou plus épais avec l'avant de la base.Le symbole du code-barres gravé à la base doit toujours être visible. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, distribuez 400 microlitres de réactif PB deux dans chacun des huit réservoirs humidificateurs creusés dans la base. Placez le couvercle de la chambre hi sur la base et fixez les deux extrémités en positionnant deux attaches sur des côtés diagonalement opposés.Placez d'abord quatre inserts de chambre Hi sur la paillasse pour chaque chambre Hi utilisée, juste avant la fin des 30 minutes. Refroidissez. Ouvrez les emballages de puces contenant les billes argentées.Retirez les puces de leurs enveloppes en plastique transparent sans toucher les billes. Placez chaque puce à cellules sur un insert à chambre haute. Orientez la puce de manière à aligner son code-barres avec le symbole de code-barres gravé sur la surface supérieure de l'insert.L'étape suivante, qui consiste à charger les puces à abeilles, peut être l'étape la plus critique du protocole. Pour la réaliser correctement, il est nécessaire de visualiser à l'avance le transfert de l'échantillon de la plaque d'ADN vers la puce à abeilles. Retirez et jetez le couvercle de la plaque d'échantillons. Une pipette multicanal peut être utilisée pour distribuer le liquide sur les puces, mais il faut prévoir avec soin d'aspirer uniquement le nombre d'échantillons pouvant être placés en toute sécurité sur la puce à abeilles, car le nombre de rangées sur une plaque ne correspond pas toujours au nombre de rangées sur une puce.Prélèvez 15 microlitres d'échantillon à partir de la plaque d'échantillon et déposez-les lentement à l'entrée du réseau. Une attention particulière doit être portée à placer l'échantillon correct sur la puce à puces correspondante, à la position exacte correspondant à la puce à billes, conformément à l'ordre enregistré précédemment.Ouvrez la chambre hi et placez les inserts au-dessus des réservoirs humidifiants. Le code-barres de la puce doit être positionné au-dessus de la gravure du code-barres située sur la base de la chambre hive. Remettez le couvercle de la chambre hive en place et fermez les quatre attaches en refermant les attaches situées sur les côtés diagonalement opposés.Incubez d'abord la chambre hi dans un four à 48 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. À l'issue de l'hybridation, retirez les chambres hi du four et incubez-les à température ambiante pendant 25 minutes pour les refroidir. Une fois les chambres hi refroidies, ouvrez-en une. Retirez le scellant de protection d'une puce bee en saisissant le scellant à un coin et en le décollant doucement en diagonale.Une fois le sceau retiré, placez immédiatement la puce sur un plateau pour puce à abeille et immergez-la dans du PB1 sans toucher les billes. Répétez jusqu'à ce que le plateau soit rempli de puces à billes, en prenant soin de ne laisser sécher aucune puce.Agitez doucement le plateau pour éliminer les bulles éventuelles et laissez les puces immergées pendant une minute. Agitez à nouveau le plateau. Transférez le plateau de puces à abeilles dans un deuxième récipient de lavage rempli de PB.One, agitez doucement et laissez mouiller pendant une minute.Ensuite, agiter à nouveau dans le flux liquide à travers le poste d'assemblage. Placer quatre entretoises en plastique noir à travers les rainures. Remplir le poste avec du PB un jusqu'à ce que le liquide atteigne presque la hauteur des huit supports d'assemblage, un par un.Retirez les puces à billes du plateau et placez-les dans le poste d'assemblage sur un support en plastique à circulation directe, de sorte que le code-barres de la puce soit aligné au-dessus du symbole de code-barres gravé dans le poste d'assemblage. Une fois quatre puces placées dans le poste d'assemblage, positionnez un espaceur en plastique transparent sur chacune d'elles. Les bords extérieurs de l'espaceur doivent entourer les supports situés à l'intérieur du poste d'assemblage.Placer la barre d'assemblage en plastique dans la station d'assemblage en la positionnant sur les rainures. Poser délicatement une lame de verre sur le séparateur en plastique en poussant l'extrémité arrière de la lame contre la barre d'assemblage et en abaissant lentement l'avant dans le liquide. La rainure située sur le dessus de la lame doit être orientée vers le bas, directement au-dessus du code-barres de la puce, en laissant un espace entre la puce à abeille et la lame à l'extrémité du code-barres.Après avoir vérifié l'absence de bulles entre la puce et la lame, fixez deux attaches métalliques autour du verre. Faites glisser l'une vers l'extrémité du code-barres et l'autre vers l'arrière. Les bords des attaches en plastique doivent saisir l'entretoise plastique de passage du flux située sous la puce.Ce schéma montre un diagramme complet d'assemblage en flux traversant. Une fois que toutes les billes sont en place dans leurs assemblages en flux traversant, prenez une paire de ciseaux chirurgicaux et coupez les deux extrémités de l'entretoise aussi près que possible de la lame de verre. Lorsque le support de chambre est à 44 degrés, commencez cette procédure en plaçant un assemblage en flux traversant de puces à abeilles sur le support de chambre en faisant glisser l'assemblage vers le bas et en accrochant le support en haut. L'arrière de la puce à abeilles doit toucher le support de chambre.La lame de verre doit être orientée vers l'extérieur, avec la rainure en haut, afin de former un réservoir de réactif. Une fois que tous les assemblages de puces à abeilles ont été placés sur le support de chambre, utilisez une pipette de 200 microlitres pour ajouter 150 microlitres du réactif RA one aux assemblages en flux. En délivrant le liquide dans le réservoir en verre, le réactif s'écoulera naturellement le long de la lame et sortira à la base de l'assemblage, permettant ainsi aux réactifs ultérieurs d'être ajoutés directement dans le réservoir.Les étapes restantes pour la coloration d'une extension ne seront pas montrées. Veuillez vous référer au protocole décrit dans le manuscrit accompagnant l'achèvement de la coloration et de l'extension. Démontez l'assemblage de flux en insérant une barre métallique fine entre les attaches et l'armature.Ensuite, pivoter. Mettre de côté la lame en verre et retirer immédiatement la puce à abeille, puis placer une puce à abeille dans un plateau vertical pour puces à abeille et immerger dans le tampon PB1 ; répéter cette opération pour chaque assemblage en flux continu, en veillant à orienter chaque puce à abeille dans le même sens et à minimiser leur exposition à l'air.Ensuite, complétez cette procédure. Selon le protocole décrit dans le texte accompagnant, une puce à puces correctement traitée doit afficher des intensités lumineuses rouges et vertes brillantes et bien distinctes lorsqu'elle est analysée, car les nucléotides marqués fixés lors des étapes d'extension et de coloration fluoresceront sous les lumières des deux lasers. On voit ici un échantillon standard d'ADN génomique correctement hybridé à des sections de puces de génotypage SNP sur mesure, avec des intensités satisfaisantes.Le contrôle qualité apparaîtra en vert sur l'affichage de la puce à abeilles dans les sections situées à gauche. Intensité insuffisante. Le contrôle qualité apparaîtra en rouge sur l'affichage de la puce à abeilles.Une fois l'analyse terminée, le système superposera les affichages rouge et vert. Une image agrandie est présentée ici, car ces nucléotides prolongent de manière sélective la chaîne d'oligonucléotides liée aux billes, hybridée au brin d'ADN fragmenté. Étant donné que les chaînes de nucléotides sont conçues pour se terminer au niveau de la variante, la couleur et l'intensité du signal obtenu peuvent être utilisées pour déterminer les allèles présents au site du SNP.Les fichiers de sortie du scanner sont importés dans le logiciel d'analyse Genome Studio, qui génère des profils d'agglomérat. Voici un exemple de SNP valide avec trois groupes distincts représentant les génotypes aa, A, B et B, B, colorés respectivement en rouge, violet et bleu. Ce graphique d'intensité montre le SNP pour lequel il a fallu modifier le groupe central noir, qui devrait être homozygote.AB n'est pas appelé. L'amas BB est appelé ab par erreur. Le dernier tracé d'intensité montre un SNP à faible performance.Aucun génotype ne peut être obtenu à partir de ce tracé d'intensité, car aucun groupe distinct n'existe. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de traiter rapidement les puces à abeilles. Ne les exposez pas à l'air pendant une période prolongée.

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