Une In-vitro Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les neurones fonctionnellement viables et l’ICLA du plexus myentérique de souris adulte. Pour ce faire, il suffit d’abord d’enduire la surface de culture cellulaire stérile de polylysine et de laminine. La deuxième étape consiste à préparer les solutions et la zone chirurgicale pour l’isolement du plexus myenérique.

Ensuite, retirez le tractus gastro-intestinal et isolez la section souhaitée pour créer une préparation longitudinale du plexus myentérique musculaire. L’étape finale consiste à digérer séquentiellement la LMMP dans la collagénase et la trypsine, puis à plaquer les cellules sur les surfaces de culture cellulaire précodées. En fin de compte, l’électrophysiologie, l’immunochimie et la PCR sur cellule unique peuvent être utilisées pour étudier les effets des neurones entériques, de la glie ou de l’interaction entre ces deux types de cellules.

La Dre Trisha Har Smith, boursière postdoctorale dans tous les laboratoires, et Joy Gombe, candidate au doctorat dans tous les laboratoires, l’assistera. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes est que les neurones et la glie proviennent de la souris adulte. Cela permet des neurones et des cellules gliales entièrement fonctionnels, qui peuvent potentiellement provenir d’animaux génétiquement modifiés.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des propriétés électriques des neurones. Il peut également être appliqué à d’autres méthodologies telles que l’immunochimie, la PCR sur cellule unique et l’imagerie calcique en temps réel. Commencez cette procédure en plaçant une souris euthanasiée en position couchée dorsale sur la surface chirurgicale.

Ensuite, nettoyez la peau abdominale avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, soulevez-le à l’aide d’une pince et ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux pour révéler les organes digestifs internes. Après cela, soulevez une section de l’iléon pour révéler le mésentaire.

Retirez le tractus gastro-intestinal et coupez le mésentère avec des ciseaux. Ensuite, retirez et démêlez doucement l’iléon et le côlon. Veillez à ne pas retirer le mésentère de l’iléon et du côlon après que l’intestin sur toute sa longueur a été démêlé.

Retirez l’iléon en coupant à travers l’intestin distal à l’estomac et proximal au cæcum. Cette procédure peut également être réalisée avec un tissu colique en retirant le côlon du distal au caecum au proximal à l’anus. Ensuite, coupez l’iléon en trois gros morceaux ou plus.

Frottez doucement la solution de kreb à travers la section de l’intestin jusqu’à ce que toutes les matières fécales soient retirées dans un conteneur à déchets séparé. Placez la section propre dans le récipient de Krebs étiqueté propre et répétez les procédures jusqu’à ce que tout l’iléon soit nettoyé. Pour retirer le LMMP, coupez l’iléon en petits segments de deux à quatre centimètres.

Ensuite, placez un segment d’iléon sur une tige en plastique ou en verre. L’iléon doit être bien ajusté, mais pas lâche ou tendu. Empêchez le tractus gastro-intestinal de tourner autour de la tige en épinglant doucement le tube à la tige avec le pouce.

Ensuite, retirez délicatement les morceaux de mésentère qui sont encore attachés au tractus gastro-intestinal à l’aide d’une pince. Après cela, séparez le LMMP du muscle circulaire sous-jacent. En frottant d’abord doucement le bord de la pince le long de toute la ligne où le mésentère était attaché de haut en bas du segment.

Par la suite, créez doucement un espace dans le muscle longitudinal. Ensuite, retirez doucement le muscle longitudinal à l’aide d’un coton-tige marié à des crebs commençant en haut de l’espace, en utilisant le trait horizontal le plus léger tout en appliquant une pression très légère jusqu’à ce que le muscle longitudinal commence à se séparer du muscle circulaire. Faites-le sur toute la bande le long du point d’attache mésentaire.

Ensuite, faites doucement le tour du tube gastro-intestinal en vous déplaçant de haut en bas et inversement. Comme le muscle longitudinal est lentement séparé du muscle circulaire tout autour du tube. Une fois terminé, le LMMP se détachera naturellement du tube gastro-intestinal restant.

Placez ensuite la fine bande de muscle longitudinal résultante dans le bécher étiqueté LMMP et répétez les procédures pour tous les segments de cette procédure. Placez le rinçage des segments LMMP dans la solution de digestion. Ensuite, coupez le LMMP en petits morceaux avec des ciseaux.

Ensuite, digérez-les pendant 60 minutes. Dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec un agitateur tout en étant doucement bullé avec du carbogène. Une fois la digestion terminée, rassemblez les cellules par centrifugation pendant huit minutes à 356 G dans une centrifugeuse, refroidissez à quatre degrés Celsius.

Pendant ce temps, préparez une solution de trypsine à 0,05 % dans une hotte de culture cellulaire en ajoutant un millilitre de trypsine réchauffée à 0,25 % et quatre millilitres de HBSS réchauffé dans un tube de culture cellulaire stérile de 50 millilitres. Après la centrifugation, jetez le surnageant, retirez soigneusement la pastille cellulaire et placez-la dans un tube propre avec cinq millilitres de solution d’essai à 0,05 %. Ensuite, digérez les cellules dans une solution d’essai à 0,05 % dans un bain-marie à 37 degrés Celsius en agitant pendant sept minutes, neutralisez l’essai avec 10 millilitres de produit de rinçage à froid.

Après sept minutes de traitement tripsin, centrifugez les cellules pendant huit minutes à 356 g. Pendant ce temps, équilibrez la section de la maille TX stérilisée sur un tube de culture cellulaire stérile de 15 millilitres. Après la centrifugation, jetez le surnageant et remettez doucement en suspension le mélange cellulaire en le déclenchant dans trois millilitres.

Média neuronal complet. Toutes les modifications doivent être effectuées très doucement Pour éviter de générer des bulles d’air, filtrez ensuite la solution cellulaire à travers le maillage NYX dans un tube de culture cellulaire propre de 15 millilitres. Rassembler les cellules par centrifugation pendant huit minutes à 356 g.

Après cela, retirez et jetez le surnageant. Mettez les cellules en suspension dans 1200 microlitres de milieux neuronaux complets. Ensuite, tapotant doucement les cellules à l’aide d’une pointe de pipette en plastique d’un millilitre.

Veillez à ne pas générer de bulles d’air, pipetez lentement et doucement jusqu’à ce que la plupart des morceaux soient brisés et que les cellules soient en suspension dans le liquide. Maintenant, ajoutez 750 microlitres du média complet dans chacun des 12 puits contenant une lamelle de verre précodée. Ajoutez ensuite 100 microlitres de la solution de cellule nominale.

Incuber les neurones dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec un changement de dioxyde de carbone de 5 %. La moitié du milieu cellulaire tous les deux jours. Les neurones sont prêts pour les enregistrements électrophysiologiques après un à deux jours de culture.

La caractérisation immunohistochimique des neurones entériques est illustrée ici. Lea isolée de la souris. La microscopie confocale musculaire longitudinale a révélé la coloration neuronale spécifique de la bêta-trois tubuline dans l’ensemble de la préparation musculaire longitudinale iléale du mont de la souris.

Et ce sont les cellules isolées des préparations LMMP, qui contiennent les neurones qui se sont colorés positivement pour la liaison cal et les cellules gliales de Retin montrées ici ont été visualisées avec le marqueur glial spécifique GFAP. Cependant, aucune coloration n’a été observée lorsque l’anticorps primaire a été omis. Voici les neurones et les cellules gliales isolés du muscle longitudinal de la souris qui se développent à proximité les uns des autres.

Les images de microscopie confocale indiquent que les neurones verts et les ggl rouges se développent facilement à côté l’un de l’autre et semblent interagir in vitro. Cette figure montre l’électrophysiologie des neurones entériques en culture et de la CLIA en mode pince de courant. Tous les neurones présentaient des potentiels d’action lors de l’injection de courant.

Les CLIA n’ont pas de potentiels d’action, mais présentent de grands potentiels électrotoniques en réponse à l’injection de courant. Les neurones cultivés à partir de l’iléon de souris constituent une population hétérogène électrophysiologique. En mode de pince de courant, une injection de courant de 0,09 nanoampères dans les neurones entraîne des potentiels d’action.

Les neurones HP négatifs retournent immédiatement au potentiel de membrane au repos après la stimulation. Alors qu’un HP positif, les neurones affichent un A HP après la stimulation, dans lequel le potentiel de membrane au repos tombe en dessous de la ligne de base avant de revenir lentement à la valeur initiale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est correctement exécutée.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder la verrerie et les instruments chirurgicaux aussi propres que possible. De plus, itérez et bullez doucement les cellules et changez la moitié du milieu de culture cellulaire tous les deux jours après cette procédure. Des méthodes telles que l’électrophysiologie et l’immunochimie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la réponse des canaux ioniques dans l’intestin au traitement médicamenteux, et pour en savoir plus sur l’expression des protéines dans les neurones et les LIA, et comment l’interaction de ces deux types de cellules est modifiée par divers traitements après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer les fonctions de base des neuropathies et des neuropathies g du système nerveux entérique chez les animaux génétiquement modifiés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les neurones et la glie du plexus TER du système nerveux entérique de la souris adulte.