Name: Une In-vitro Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Apprenez à isoler des neurones et des cellules gliales viables du plexus myentérique de souris adulte. Cette méthode de culture cellulaire permet d'étudier les interactions neuronales et gliales du système nerveux entérique.

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National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.

Tous les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été conformes et approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Commonwealth de Virginie.
1. Préparation de lamelles en verre stériles revêtues de poly-D-lysine et de laminine en plaques à 24 puits
<ol>
	<li>Toutes les procédures de l’étape 1 sont effectuées dans des conditions stériles, sous une cagoule et avec des réactifs stériles. Les lamelles en verre et l’eau double désionisée (ddH2O) doivent être stérilisées à l’avance. La préparation des plaques peut être effectuée jusqu’à deux semaines avant l’isolement des neurones.</li>
	<li>Sous le capot, à l’aide d’une pince stérile, placez des lamelles en verre autoclavées dans 12 puits d’une plaque de 24 puits.</li>
	<li>Préparez à l’avance le bouillon de poly-D-lysine. Ajouter 50 ml de ddH2O stérile à 5 mg de poly-D-lysine. Vortex et conserver dans 3 ml d’aliquotes à -20 °C. Décongeler les aliquotes avant utilisation.</li>
	<li>Pour une concentration finale de 1 ml de stock de poly-D-lysine par 25cm2 : pipeter 80 μl de stock de poly-D-lysine sur chaque lamelle en verre (2 cm2). Laisser reposer la solution pendant 10 min.</li>
	<li>Retirez la poly-D-lysine à l’aide d’un aspirateur et rincez 3 fois avec du ddH2O stérile.</li>
	<li>Laissez sécher les assiettes pendant au moins 2 heures sous le capot.</li>
	<li>Les plaques peuvent être stockées à 4 °C ou - 20 °C avant de procéder à l’enrobage de laminine.</li>
	<li>Préparez le bouillon de laminine à l’avance. Décongeler la laminine sur de la glace et la garder sur la glace pendant l’utilisation. Diluer à une concentration de 50 μg/ml ; faire attention à la concentration du lot ; Chaque lot sera différent. En fonction de la concentration du lot, environ 20 ml dejjdH2 O seront ajoutés à chaque flacon de laminine. Aliquote (5 ml) et conserver à -80 °C. Décongeler les aliquotes sur de la glace avant utilisation.</li>
	<li>Enduire les lamelles avec 5 μg/cm2 de laminine ; pipeter 200 μl de laminine sur chaque lamelle.</li>
	<li>Incuber la solution de laminine sur des lamelles pendant 1 heure.</li>
	<li>Aspirez la solution de laminine restante et rincez les lamelles une fois avec du ddH2O. Évitez de gratter la surface des lamines.</li>
	<li>Conservez les assiettes à 4 °C jusqu’à deux semaines.</li>
</ol>
2. Préparation avancée des solutions d’isolement des neurones
<ol>
	<li>Préparez la solution de Krebs (en mM : 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH2PO4, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO3, 11 glucose et 2,5 CaCl2). Placer 13,79 g de NaCl (FW 58.44), 0,686 g de KCl (FW 74.55), 0,312 g de NaH2PO4 (FW 120), 0,289 g de MgSO4 (FW 120.4), 4,20 g de NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 g de glucose (FW 180.2) et 0,555 g de CaCl2 (FW 111) dans 2 L ddH20. Réfrigérer à 4 °C.</li>
	<li>Préparez un milieu de rinçage (milieu F12 avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et un antibiotique/antimycosique) : À un flacon de 500 ml de milieu F12, ajoutez 50 ml de FBS et 5 ml d’antibiotique/antimycosique 100x liquide (Gibco).</li>
	<li>Préparez un milieu entérologique (milieu neurobasal A avec B-27, 2 mM de L-glutamine, 1 % de FBS, 10 ng/ml, facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF) et antibiotique/antimycosique 100 fois liquide). Pour faire du bouillon GDNF, ajoutez 1 ml de ddH2O à 10 μg de GDNF et congelez dans des aliquotes de 50 μl, conservez à -80 °C. Pour obtenir un flacon de 50 ml de milieu neuronal complet, combinez 47,5 ml de milieu neurobasal A, 1 ml de B-27 (50x), 500 μl de FBS, 500 μl de L-glutamine (Gibco), 50 μl de stock GDNF et 500 μl d’antibiotique/antimycosique 100x liquide. Le milieu est fabriqué en petits lots de 50 ml pour assurer la fraîcheur du GDNF et éviter la contamination de grandes quantités de ce mélange coûteux de milieux cellulaires.</li>
</ol>
3. Préparation du muscle longitudinal/plexus myentérique (LMMP) à partir de souris
<ol>
	<li>Une éthique nationale et institutionnelle appropriée doit être en place avant de procéder à des expériences sur des animaux. Des souris Swiss Webster adultes pesant plus de 25 g (généralement âgées de plus de 8 semaines) sont logées en groupes de 6 avant les expériences. Les tissus de deux souris sont utilisés pour l’isolement des neurones entériques iléaux et de la glie et trois souris sont utilisés pour l’isolement des cellules du côlon.</li>
	<li>Préparez la zone chirurgicale. Rassemblez de petits ciseaux chirurgicaux, des pinces coudées, des cotons-tiges, trois béchers en verre de 200 ml et une tige en verre/plastique (pinceau). Assurez-vous que toutes les fournitures sont soigneusement lavées et rincées avant utilisation afin de minimiser la contamination. Cette étape peut être effectuée la veille de l’expérience.</li>
	<li>Placez la solution de Krebs sur de la glace et faites bouillir du carbogène (95 % d’oxygène, 5 % de CO2) pendant au moins 30 minutes pour stabiliser le pH.</li>
	<li>Allumez divers équipements et réchauffez les produits chimiques pour les stabiliser aux températures souhaitées ; chauffez-le(s) bain-marie à 37 °C, refroidissez la centrifugeuse à 4 °C, placez la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et la trypsine à 0,5 % dans le bain-marie (37 °C). Les milieux neuronaux complets et les milieux de rinçage doivent rester réfrigérés.</li>
	<li>Placez 150 ml de Krebs à bulles glacés dans trois béchers en verre de 200 ml étiquetés « sale », « propre » et « LMMP ». Bécher à bulles étiqueté 'LMMP' avec carbogène.</li>
	<li>Après approbation du comité d’éthique, euthanasier la souris par luxation cervicale ou asphyxie au CO2.</li>
	<li>Placez la souris en décubitus dorsal sur la surface chirurgicale, nettoyez la peau avec 70 % d’EtOH et soulevez la peau abdominale à l’aide d’une pince. À l’aide de ciseaux, ouvrez la cavité abdominale et révélez les organes digestifs internes.</li>
	<li>Retirez la longueur du tractus gastro-intestinal en soulevant une section de l’iléon et en révélant son mésentère. Coupez le mésentère avec des ciseaux pour retirer et démêler doucement l’iléon et le côlon, en faisant attention de ne pas retirer le mésentère de l’iléon / côlon.</li>
	<li>Une fois toute la longueur de l’intestin effilochée, retirez l’iléon en coupant à travers l’intestin distal par rapport à l’estomac et proximal par rapport au cæcum. Remarque : cette procédure peut également être effectuée avec du tissu colique en retirant le côlon de distal au cæcum à proximal à l’anus.</li>
	<li>Les tissus peuvent être divisés en côlon proximal et distal, et jéjenum et iléon. Le reste de cette procédure se référera à l’isolement de l’iléon ; la procédure est la même pour l’isolement de la LMMP du côlon. Placez l’iléon entier dans un récipient en verre avec des Krebs glacés marqués « sale ».</li>
	<li>Créez un outil pour nettoyer l’iléon, émoussez une grosse aiguille de 20 G à l’aide d’une pierre de limage et fixez-la à une grande seringue (10 ml) contenant des Krebs glacés.</li>
	<li>Nettoyez les matières fécales de l’iléon en le sectionnant en trois gros morceaux ou plus. Retirez une section iléale du bécher et placez l’aiguille émoussée à l’extrémité d’un morceau iléal.</li>
	<li>Passez doucement Krebs dans la section de l’intestin jusqu’à ce que toutes les matières fécales soient retirées dans un conteneur à déchets séparé. Placez la section nettoyée dans le récipient de Krebs marqué « propre ». Répétez l’opération jusqu’à ce que tout l’iléon soit nettoyé.</li>
	<li>Pour retirer le LMMP, coupez l’iléon en petits segments d’environ 2 à 4 cm. Placez un segment d’iléon sur une tige en plastique ou en verre ; l’iléon doit être bien ajusté mais pas lâche ou tendu (~2 mm). Commencez l’ablation de la LMMP en retirant doucement les morceaux de mésentère encore attachés au tractus gastro-intestinal (GI) à l’aide d’une pince. Empêchez le tractus gastro-intestinal de tourner autour de la tige en épinglant doucement le tube à la tige à l’aide du pouce.</li>
	<li>Séparez le LMMP du muscle circulaire sous-jacent ; frottez d’abord doucement le bord de la pince le long de toute la ligne où le mésentère était attaché, de haut en bas du segment, créant doucement un espace dans le muscle longitudinal. Ensuite, taquinez doucement le muscle longitudinal à l’aide d’un coton-tige imbibé de Krebs.</li>
	<li>Commencez par le haut de l’espace dans le muscle longitudinal et taquinez en utilisant le mouvement horizontal le plus léger tout en appliquant une pression très légère jusqu’à ce que le muscle longitudinal commence à peine à se séparer du muscle circulaire ; faites-le le long de toute la bande le long du point d’attache du mésentère.</li>
	<li>Ensuite, commencez doucement à travailler autour de la sonde gastro-intestinale, en vous déplaçant de haut en bas et de retour alors que le muscle longitudinal est lentement séparé du muscle circulaire tout autour du tube. Une fois terminé, le LMMP se détachera naturellement du reste du tube gastro-intestinal.</li>
	<li>Placez la fine bande de muscle longitudinal obtenue dans le bécher marqué « LMMP ». Répétez l’opération pour tous les segments.</li>
	<li>Une fois que toutes les bandes de LMMP ont été recueillies sur une souris, répétez la procédure pour toutes les autres souris utilisées. Rincez abondamment les béchers « sales » et « propres » avant de les réutiliser.</li>
	<li>Rincez le LMMP 3x pour éliminer la contamination biologique. Remplissez trois tubes Eppendorf de 2 ml avec des Krebs glacés. Placez les bandes LMMP dans le premier tube et faites-les tourner pendant 30 secondes à 356 x g dans une centrifugeuse refroidie à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et déplacez les bandes LMMP dans le tube propre suivant, rempli de Krebs. Répétez cette procédure pour chaque tube restant.</li>
</ol>
4. Digest LMMP
<ol>
	<li>Préparez la solution de digestion en plaçant 13 mg de collagénase de type 2 et 3 mg de BSA dans 10 ml de solution de Krebs à bulles de carbogène.</li>
	<li>Placez des segments de LMMP rincés dans la solution de digestion et utilisez des ciseaux pour couper LMMP en petits morceaux.</li>
	<li>Digérer LMMP pendant 60 min à 37 °C au bain-marie avec un agitateur tout en étant doucement bullé avec du carbogène.</li>
	<li>Une fois la digestion terminée, recueillir les cellules par centrifugation pendant 8 min à 356 x g dans une centrifugeuse refroidie à 4 ° C.</li>
	<li>À partir de ce moment, toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte de culture cellulaire ! Tous les réactifs et récipients doivent être stérilisés avant utilisation.</li>
	<li>Pendant la centrifugation, préparer une solution de trypsine à 0,05 % en plaçant 1 ml de trypsine à 0,25 % réchauffée et 4 ml de HBSS réchauffé dans un tube de culture cellulaire stérile de 50 ml.</li>
	<li>Après la centrifugation, retirer et jeter le surnageant. N’utilisez pas d’aspirateur ; Cela aspirera probablement la pastille de cellule en raison des faibles vitesses de centrifugation. Retirez délicatement la pastille de cellule et placez-la dans un tube propre avec 5 ml de solution de trypsine à 0,05 %.</li>
	<li>Digérer les cellules dans une solution de trypsine à 0,05 % au bain-marie à 37 °C en agitant pendant 7 min. Ne dépassez pas 7 min de traitement total à la trypsine ou les neurones périront.</li>
	<li>Neutralisez la trypsine avec 10 ml de produit de rinçage à froid après 7 min de traitement à la trypsine.</li>
	<li>Cellules de centrifugation pendant 8 min à 356 x g. Retirez et jetez le support.</li>
	<li>Pendant la centrifugation, équilibrez une section de maille Nitex stérilisée sur un tube de culture cellulaire stérile de 15 ml.</li>
	<li>Après la centrifugation, retirer et jeter le surnageant. Remettre doucement en suspension le mélange cellulaire en le triturant dans 3 ml de milieux neuronaux complets. Évitez de générer des bulles d’air pendant cette étape et toutes les étapes ultérieures au cours desquelles le mélange cellulaire est trituré. Toutes les triturations doivent être faites très doucement. Filtrer la solution cellulaire à travers un treillis Nitex dans un tube de culture cellulaire propre de 15 ml.</li>
	<li>Facultatif : Boucher le tube de culture cellulaire et le placer dans un mélangeur Hula réfrigéré (ou tout mélangeur qui assure la rotation) en le roulant doucement et en l’inclinant pendant 30 min. Cette étape est facultative mais recommandée.</li>
	<li>Facultatif : Après le mélangeur Hula, ajoutez 2 ml de produit de rinçage à froid pour laver les cellules.</li>
	<li>Recueillir les cellules par centrifugation (8 min, 356 x g). Retirer et jeter le surnageant.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans un milieu neuronal complet de 1 200 μl. Triturez doucement les cellules à l’aide d’une pointe de pipette en plastique de 1 ml. Ne générez pas de bulles d’air. Pipetez lentement et doucement jusqu’à ce que la plupart des morceaux soient brisés et que les cellules soient suspendues dans le liquide.</li>
	<li>Ajouter 750 μl de milieu complet dans chacun des 12 puits contenant une lamelle de verre pré-enduite et ajouter 100 μl de la solution de cellules triturées.</li>
	<li>Incuber les neurones dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Changez la moitié du support cellulaire tous les 2 jours.</li>
	<li>Les neurones sont prêts pour les enregistrements électrophysiologiques après 1 à 2 jours de culture.</li>
</ol>

<ol><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents majeurs.

Animaux utilisés
Ce protocole a été optimisé pour les souris Swiss Webster. Cependant, cette méthode est facilement adaptable à d’autres mammifères de petite taille tels que les rats et à d’autres souches de souris. Nous avons réalisé avec succès des isolements préliminaires avec des souris C57 et des knock-outs de récepteurs μ-opioïdes. Cependant, il est également possible que d’autres souches de souris puissent être problématiques en raison de variations morphologiques du tractus gastro-intesti...

Le système nerveux entérique (SNE) est un vaste réseau de nerfs et de cellules gliales qui s’étend sur toute la longueur du tractus gastro-intestinal (GI). Le SNE contrôle fonctionnellement tous les aspects de la digestion, y compris le péristaltisme, l’absorption/sécrétion de liquide, la sensation de stimuli, etc. Il contient plus de 500 millions de neurones, plus que ce que l’on trouve dans la moelle épinière, et contient toutes les classes de neurotransmetteurs présentes dans le cerveau. De plus, le SNE est unique en ce sens qu’il peut fonctionner de manière réflexe sans intervention du système nerveux central 2. La compréhension du SNE est cruciale, non seulement pour comprendre son rôle physiologique normal, mais aussi pour comprendre son implication dans une variété de neuropathies qui peuvent être congénitales (maladie de Hirschsprung), acquises (maladie de Chagas), secondaires à des états pathologiques (gastroparésie diabétique), induites par des médicaments (syndrome intestinal opioïde) ou dues à une lésion (iléus postopératoire) 1. De plus, les neurones entériques peuvent être un réservoir d’infection virale (varicelle-zona)3. En raison de ses similitudes avec le cerveau et des niveaux élevés de sérotonine dans l’intestin, les médicaments visant à traiter les anomalies du système nerveux central ont souvent des effets secondaires indésirables sur l’ENS 2. Il convient également de noter que de nombreuses neuropathies telles que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson présentent des changements cellulaires similaires dans les neurones entériques bien avant leur apparition dans les neurones centraux, faisant du SNE un modèle accessible pour étudier la pathogenèse de ces maladies 4. Par conséquent, une compréhension approfondie du SNE est nécessaire pour comprendre les états pathologiques et prévenir/prédire les effets secondaires pharmacologiques.
Les neurones du SNE ont été traditionnellement étudiés chez le cobaye à l’aide de préparations entières 5-7 ou de neurones cultivés 8. Malgré la facilité avec laquelle les neurones peuvent être étudiés chez ce grand animal, ce modèle présente de nombreuses limites, notamment le manque de souches génétiquement modifiées, le manque de réactifs spécifiques à cette espèce et le coût élevé associé à la commande et à l’hébergement de ces sujets. La mise au point d’un modèle de système nerveux entérique murin présente l’avantage unique de divers systèmes d’élimination, d’une vaste gamme d’autres méthodologies établies qui peuvent être utilisées conjointement avec la technique de culture cellulaire et de la capacité de fournir une validation pour le modèle de cobaye.
Le SNE est composé de trois plexus qui s’étendent sur toute la longueur du tractus gastro-intestinal : le plexus myentérique externe (entre le muscle longitudinal et le muscle circulaire) qui est principalement responsable des actions péristaltiques de l’intestin, ainsi que les plexi sous-muqueux et muqueux (situés respectivement sous et à l’intérieur de la muqueuse) qui contrôlent en grande partie l’absorption/sécrétion de liquide et la détection des stimuli 1. Cette méthode commence par l’isolement de la préparation du muscle longitudinal / plexus myentérique (LMMP) en décollant la couche musculaire externe du tractus gastro-intestinal. Cela réduit considérablement les problèmes de contamination qui surviennent lorsque la couche muqueuse est impliquée dans l’isolement. Par conséquent, ce processus est idéal pour l’étude du contrôle neuronal de la motilité plutôt que des actions sécrétoires du SNE.
La méthode présentée ici aboutit à une culture mixte de neurones entériques et de cellules gliales. Au moins deux types de neurones différents sont présents sur la base d’observations électrophysiologiques et immunocytochimiques antérieures 9. La présence de cellules gliales est très avantageuse, car elles sont non seulement un type de cellule important à étudier en soi, mais elles contribuent à la survie des neurones entériques 10 et maintiennent l’expression des récepteurs natifs à la surface des cellules neuronales 11. De plus, les déficiences de la glie entérique peuvent entraîner des états anormaux de motilité gastro-intestinale, appelés « neuro-gliopathies » 12. Par conséquent, la culture ENS présentée ici aboutit à plusieurs types de cellules qui sont mûrs pour l’étude.
Les avantages de cette méthodologie sont la facilité d’isolation, les outils peu coûteux requis et un court laps de temps pour maîtriser la technique par du personnel de laboratoire expérimenté. Les limites de la méthodologie comprennent un faible rendement cellulaire global dû à des volumes tissulaires élevés et l’exclusion des neurones ENS du plexi muqueux et sous-muqueux. Cette procédure sera très avantageuse pour les chercheurs spécialisés en électrophysiologie, en immunohistochimie, en PCR unicellulaire et d’autres méthodologies.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass pour verres de croissance (12 mm de diamètre)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 24 puits</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Peut être préparé en laboratoire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger stérile de 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger stérile de 50 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 média</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr>Qualité <td>du sérum fœtal bovin</td><td>Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Antibiotique/antimycosique 100x liquide</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Neurobasale A média</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>200 mM de L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF)</td><td>Neuromics</td><td>PR27022</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection à pointe acérée</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Pince à disséquer</td><td>les tissus Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Applicateurs à pointe de coton</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>250 ml Bécher en verre gradué</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>2 L Fiole Erlenmyer en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Tige en plastique (pinceau pour enfant)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5 % CO2</td></tr><tr><td>10 ml Seringue Leur-lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 po. Aiguille hypodermique</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>de collagénase de type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00440</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>2 ml Microcentrifugeuse Tubes Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 &micro ; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Ensemble de pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Pierre à aiguiser</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (hotte de culture cellulaire)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>10 L Bain d’eau agitant</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Peut utiliser une seule centrifugeuse plus grande avec des adaptateurs de taille</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Allegra série 6</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>HuluMixer Mélangeur d’échantillons</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Incubateur CO2 AutoFlow Water Jacket</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr></tbody></table>

une<em&gt; in-vitro</em&gt; préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du plexus myentérique de la souris adulte

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Le système nerveux entérique est un vaste réseau de neurones et de cellules gliales sur toute la longueur du tractus gastro-intestinal fonctionnel qui contrôle la motilité gastro-intestinale. Une procédure pour l&#39;isolement et la culture d&#39;une population mixte de neurones et de cellules gliales du plexus myentérique est décrite. Les cultures primaires peuvent être maintenus pendant plus de 7 jours, avec des connexions en développement parmi les neurones et les cellules gliales. La bande de muscle longitudinal avec le plexus myentérique joint est extrait du muscle circulaire sous-jacente de l&#39;iléon de la souris ou du côlon, et soumis à une digestion enzymatique. Dans des conditions stériles, la population neuronale et la glie isolées sont conservées au sein de la centrifugation suivant granulés et étalées sur des lamelles. 24-48 h, neurites se produit et les neurones peuvent être identifiés par des marqueurs pan-neuronales. Après deux jours de culture, les neurones isolés incendie potentiels d&#39;action comme observé par des études de patch-clamp. En outre, les cellules gliales entériques peut aussi être identifIED par GFAP coloration. Un réseau de neurones et de cellules gliales en étroite apposition forme au sein de 5-7 jours. Neurones entériques peuvent être individuellement et directement étudiée en utilisant des méthodes telles que l&#39;immunohistochimie, l&#39;électrophysiologie, imagerie calcique, et PCR unicellulaire. En outre, cette procédure peut être effectuée sur des animaux génétiquement modifiés. Cette méthode est simple à réaliser et peu coûteux. Dans l&#39;ensemble, ce protocole expose les éléments du système nerveux entérique d&#39;une manière facile à manipuler de sorte que nous puissions mieux découvrir les fonctionnalités de l&#39;ENS dans les états normaux et pathologiques.

Immédiatement après l'isolement des cellules issues de la couche musculaire musculaire profonde (LMMP), les neurones et les autres types cellulaires ne seront pas facilement visibles. Des cellules vivantes, rondes, au phénotype indistinct, sont observables ainsi que des débris tissulaires provenant de fragments tissulaires incomplètement digérés et du tissu conjonctif. Ce matériel est sans importance et sera en grande partie éliminé lors du premier changement de milieu dans deux jours. Ne pas essayer de nettoyer les lame...

Nous démontrons un protocole de culture cellulaire pour l’étude directe des composants neuronaux et gliaux du système nerveux entérique. Une culture mixte neurone/glie sur lamelles de recouvrement est préparée à partir du plexus myentérique de souris adulte, ce qui permet d’examiner la fonction individuelle des neurones et de la glie par électrophysiologie, immunohistochimie, etc.

Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des neurones fonctionnellement viables et des CLIA à partir du plexus myentérique de souris adulte. Cela est réalisé en premier lieu en recouvrant la surface stérile de culture cellulaire de polylysine et de laminine. La deuxième étape consiste à préparer les solutions et le site chirurgical pour l'isolement du plexus myentérique.Ensuite, retirez le tractus gastro-intestinal et isolez la section souhaitée afin de préparer le plexus myentérique du muscle longitudinal. La dernière étape consiste à digérer séquentiellement le LMMP dans la collagénase puis dans la trypsine, suivie de la mise en culture des cellules sur des surfaces précodées pour la culture cellulaire. Enfin, l'électrophysiologie, l'immunocytochimie et la PCR unique cellule peuvent être utilisées pour étudier les effets des neurones entériques, des cellules gliales ou de l'interaction entre ces deux types cellulaires.Le Dr Trisha Har Smith, chercheuse postdoctorale dans notre laboratoire, démontrera la procédure, assistée par Joy Gombe, doctorante dans notre laboratoire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait que les neurones et les cellules gliales proviennent de souris adultes. Cela permet d'obtenir des neurones et des cellules gliales pleinement fonctionnels, pouvant éventuellement provenir d'animaux génétiquement modifiés.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les propriétés électriques des neurones, elle peut également être appliquée à d'autres méthodologies telles que l'immunocytochimie, la PCR unique cellule et l'imagerie calcique en temps réel. Commencez cette procédure en plaçant une souris euthanasiée en décubitus dorsal sur la surface chirurgicale.Ensuite, nettoyez la peau abdominale avec de l'éthanol à 70 %. Puis, soulevez-la à l'aide d'une pince et ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux afin de découvrir les organes digestifs internes. Après cela, soulevez une section de l'iléon pour mettre en évidence le mésentère.Retirer le tractus gastro-intestinal et sectionner le mésentère avec des ciseaux. Ensuite, retirer délicatement et dérouler l'iléon et le côlon. Veiller à ne pas tirer sur le mésentère après avoir complètement déroulé l'intestin sur toute sa longueur.Retirer l'iléon en coupant l'intestin en aval de l'estomac et en amont du cæcum. Cette procédure peut également être réalisée avec un tissu colique en retirant le côlon de l'extrémité distale du cæcum à l'extrémité proximale de l'anus. Ensuite, sectionner l'iléon en trois morceaux ou plus de grande taille.Frottez doucement la solution de Krebs à travers la section intestinale jusqu'à ce que toutes les matières fécales soient éliminées dans un récipient à déchets séparé. Placez la section propre dans le récipient de Krebs étiqueté propre et répétez les procédures jusqu'à ce que tout l'iléon soit nettoyé. Pour retirer le LMMP, coupez l'iléon en petits segments de deux à quatre centimètres.Ensuite, placer un segment d'iléon sur une tige en plastique ou en verre. L'iléon doit être bien ajusté, sans être lâche ni tendu. Empêcher le tube digestif de tourner autour de la tige en fixant délicatement le tube à la tige avec le pouce.Ensuite, retirez délicatement avec une pince les fragments de mésentère encore attachés au tube digestif. Puis, séparez la couche musculaire longitudinale de la couche musculaire circulaire sous-jacente, en frottant d'abord doucement le bord de la pince le long de toute la ligne d'insertion du mésentère, du haut vers le bas du segment.Ensuite, créez délicatement un espace dans le muscle longitudinal. Puis, écartez doucement le muscle longitudinal à l’aide d’un coton-tige imprégné de crêpes, en partant du sommet de l’espace, en effectuant le trait horizontal le plus léger possible tout en exerçant une pression très faible, jusqu’à ce que le muscle longitudinal commence tout juste à se séparer du muscle circulaire. Procédez ainsi sur toute la longueur de la bande le long du point d’insertion du mésentère.Ensuite, travaillez délicatement autour du tube digestif en allant du haut vers le bas et inversement, tout en séparant progressivement le muscle longitudinal du muscle circulaire tout autour du tube. Une fois l'opération terminée, la préparation LMMP se détachera naturellement du tube digestif restant.Ensuite, placer la bande mince résultante de muscle longitudinal dans le bécher étiqueté LMMP et répéter les procédures pour tous les segments dans cette procédure. Placer les segments de LMMP de rinçage dans la solution de digestion. Puis hacher les segments de LMMP en petits morceaux à l’aide de ciseaux.Ensuite, digérez-les pendant 60 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec un agitateur, en bullant doucement avec du carbogène. Une fois la digestion terminée, récupérez les cellules par centrifugation pendant huit minutes à 356 G dans une centrifugeuse refroidie à quatre degrés Celsius.Entre-temps, préparez une solution de trypsine à 0,05 % dans une hotte de culture cellulaire en ajoutant un millilitre de trypsine à 0,25 % préchauffée et quatre millilitres de HBSS préchauffé dans un tube stérile de 50 millilitres pour culture cellulaire. Après la centrifugation, éliminez soigneusement le surnageant, retirez le culot cellulaire et placez-le dans un tube propre contenant cinq millilitres de solution de trypsine à 0,05 %. Ensuite, effectuez la digestion des cellules dans la solution de trypsine à 0,05 % dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec agitation pendant sept minutes, puis neutralisez la trypsine à l’aide de 10 millilitres de milieu de rinçage froid.Après sept minutes de traitement par la tripsine, centrifuger les cellules pendant huit minutes à 356 ×g. Entre-temps, placer un morceau de maille TX stérilisé en équilibre sur un tube de culture cellulaire stérile de 15 millilitres. Après la centrifugation, éliminer le surnageant puis resuspendre délicatement le mélange cellulaire en l'agitant dans trois millilitres.Milieu neuronal complet. Toutes les modifications doivent être effectuées très délicatement afin d'éviter la formation de bulles d'air, puis filtrer la solution cellulaire à travers un tamis NYX dans un tube de culture cellulaire propre de 15 millilitres. Rassembler les cellules par centrifugation pendant huit minutes à 356 ×g.Ensuite, retirez et jetez le surnageant. Resuspendez les cellules dans 1200 microlitres de milieu neuronal complet. Puis, homogénéisez délicatement les cellules à l’aide d’une pipette en plastique de un millilitre.Veillez à ne pas générer de bulles d'air ; pipetez lentement et délicatement jusqu'à ce que la plupart des morceaux soient dissociés et que les cellules soient en suspension dans le liquide. Ajoutez ensuite 750 microlitres de milieu complet dans chacun des 12 puits contenant un couvre-objet en verre pré-codé. Puis ajoutez 100 microlitres de la solution cellulaire dosée.Incuber les neurones dans une étuve de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Renouveler la moitié du milieu cellulaire tous les deux jours. Les neurones sont prêts pour les enregistrements électrophysiologiques après un à deux jours de culture.Voici la caractérisation immunohistochimique des neurones entériques. Lea isolé de la souris. La microscopie confocale du muscle longitudinal a révélé une coloration spécifique des neurones pour la bêta-tubuline III dans une préparation whole mount du muscle longitudinal iléal provenant de la souris.Et ce sont les cellules isolées des préparations de LMMP, qui contiennent les neurones ayant présenté une coloration positive pour la calbindine et les cellules gliales de rétine. Les cellules gliales illustrées ici ont été visualisées à l’aide du marqueur spécifique des cellules gliales, la GFAP. Toutefois, aucune coloration n’a été observée en l’absence d’anticorps primaire. Voici les neurones et les cellules gliales isolés du muscle longitudinal de souris, en cours de croissance en étroite proximité les uns par rapport aux autres.Les images de microscopie confocale montrent les neurones verts et le ggl rouge qui poussent facilement côte à côte et semblent interagir in vitro. Cette figure présente l'électrophysiologie des neurones entériques cultivés et du CLIA en mode de maintien du courant. Tous les neurones ont présenté des potentiels d'action lors de l'injection de courant.Les neurones ILCA ne présentent pas de potentiels d'action, mais affichent de grands potentiels électrotoniques en réponse à une injection de courant. Les neurones cultivés à partir de l'iléon de souris constituent une population hétérogène sur le plan électrophysiologique. En mode courant imposé, une injection de courant de 0,09 nanoampère dans les neurones provoque des potentiels d'action.Les neurones sans AHP reviennent immédiatement au potentiel de membrane au repos après une stimulation. Alors que les neurones avec AHP présentent un AHP après la stimulation, au cours duquel le potentiel de membrane au repos descend en dessous de la ligne de base avant de revenir lentement à sa valeur initiale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder les verreries et les instruments chirurgicaux aussi propres que possible. Il faut également effectuer des itérations et agiter doucement les cellules, puis changer la moitié du milieu de culture cellulaire tous les deux jours après cette procédure. Des méthodes telles que l'électrophysiologie et l'immunocytochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont les canaux ioniques de l'intestin réagissent à un traitement médicamenteux, d'étudier l'expression des protéines dans les neurones et les cellules gliales, et de comprendre comment l'interaction entre ces deux types cellulaires est modifiée par divers traitements après leur développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer les fonctions fondamentales des neuropathies et des neuropathies du système nerveux entérique chez des animaux génétiquement modifiés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les neurones et les cellules gliales du plexus TER du système nerveux entérique de la souris adulte.

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