Résolution tomographie optique de cerveaux de souris entières avec Feuille confocale microscopie optique Micron-échelle de

L'objectif général de cette procédure est de reconstruire et de visualiser intégralement un cerveau de souris avec une résolution à l'échelle micrométrique. Cela est réalisé en premier lieu en déshydratant un cerveau de souris fixé selon une série tétraédrique intégrée. La deuxième étape consiste à rendre l'échantillon transparent dans l'éther benzylique.

Ensuite, le cerveau est imagé à l'aide d'un microscope confocal à feuillet lumineux. La dernière étape consiste à utiliser un logiciel pour aligner et assembler les piles d'images acquises. Enfin, un outil de visualisation à résolution multiple peut être utilisé pour parcourir le volume d'image reconstruit.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes comme la microscopie confocale ou la microscopie photo est que le volume complet d'un cerveau de souris peut être imagé en seulement quelques jours. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la répartition des différents types de neurones dans tout le cerveau. Ce capot métallique fournit-il des informations sur l'autonomie fine du cerveau ?

Il peut également être appliqué à des embryons de souris ou à des mouches du pied, démontrant que la procédure sera réinitialisée. Un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer ce protocole, effectuez une fixation standard des cerveaux de souris par perfusion transcardiale, puis une post-fixation pendant la nuit, avant de procéder à la déshydratation et à la clarification.

Ensuite, comme le solvant de déshydratation, le THF, éteint fortement la fluorescence des XFP, effectuez une filtration pour éliminer les peroxydes à l’aide d’oxyde d’aluminium activé basique en utilisant une colonne de chromatographie, en évitant toute fissuration de la colonne, ce qui réduirait l’élimination des peroxydes avant l’ajout d’un stabilisant à la solution finale. Même si le THF avait déjà été stabilisé avant la filtration, le stabilisant sera retenu par l’oxyde d’aluminium. Notez que le THF sans stabilisant peut former de grandes quantités de peroxydes et peut être explosif et dangereux.

Ensuite, déshydratez l'ensemble du cerveau de souris selon une série intégrée de THF dans de l'eau pure. Puis, placez le flacon contenant l'échantillon sur une roue rotative afin d'éviter toute exposition à la lumière. Enveloppez le flacon dans du papier d'aluminium.

Enfin, filtrez le solvant de clarification à l'aide d'oxyde d'aluminium en utilisant une ampoule de filtration. Ensuite, clarifiez l'échantillon dans du DBE à 100 %, en changeant la solution après trois et six heures, lorsque le cerveau apparaît transparent. Habituellement une heure après le deuxième changement de DBE, montez-le sur une plaque d'imagerie inclinée selon l'une des méthodes présentées ici.

Montage direct via disque agros ou montage via un haut-parleur agro pour un montage direct : plongez délicatement l'échantillon sur l'une des pointes afin d'utiliser le plongeon avec le disque aros. Un disque constitué de gel aros à 6 % est placé sur les pointes. Fixez ensuite doucement l'échantillon sur le disque agros avec de la colle acrylique et attendez environ une minute pour que la polymérisation s'effectue avant le montage.

À l'aide du plongeon en bécher Agros, appliquer un bécher composé de 3 % de gel Agros sur les embouts. Placer ensuite délicatement l'échantillon au fond du bécher. Après avoir monté l'échantillon selon l'une de ces méthodes, positionner la plaque d'imagerie à l'intérieur de la chambre d'échantillonnage à l'aide de pinces.

Ensuite, remplissez la chambre avec la solution de clarification. Préparez-vous ensuite à la tomographie. Retirez d'abord la fente afin de collecter le maximum de fluorescence, puis éclairez l'échantillon avec une faible puissance laser.

Pour éviter le photoblanchiment, déplacez l'échantillon dans les trois directions x, y et Z à l'aide du système motorisé de micro-positionnement contrôlé par logiciel. Pour chaque direction, identifiez les coordonnées minimales et maximales pour lesquelles l'échantillon est éclairé tout en restant dans le champ de vue de la caméra. Insérez ensuite les coordonnées déterminées comme paramètres pour la sous-routine de pré-tomographie.

Spécifiez également la distance entre les empilements adjacents à utiliser en tomographie et lors de l'étape d'échantillonnage préalable à la tomographie dans la direction Z. Enfin, lancez la tomographie préalable, qui acquerra les images dans chaque empilement selon les paramètres d'échantillonnage Z définis à l'étape précédente. Pour commencer l'acquisition, déplacez d'abord l'échantillon hors du plan lumineux à l'aide du système de micro-positionnement.

Ensuite, augmentez la puissance du laser et arrêtez le mouvement de tous les systèmes de balayage afin d'éclairer uniquement une ligne fixe au centre du champ de vision. Puis, montez la fente et alignez-la à l'aide du signal d'autofluorescence provenant de la solution de clarification. Vous devez maintenant voir clairement la ligne de la fente au centre du champ de vision.

Réactivez maintenant le système de balayage. Réduisez la puissance du laser et déplacez l'échantillon à l'intérieur de la feuille de lumière à l'aide du système de micro-positionnement. Notez que la puissance laser utilisée avec la fente sera supérieure à celle utilisée sans celle-ci.

Étant donné que le filtre spatial bloque une fraction non négligeable de lumière, ajustez l'amplitude et le décalage des systèmes de balayage et de balayage d à l'aide du logiciel de contrôle jusqu'à ce que les images apparaissent nettes et lumineuses. Réglez ensuite le pas Z approprié pour l'expérience et lancez le logiciel d'acquisition de tomographie. Le volume sera imagé en de nombreuses séries parallèles partiellement superposées, et les images seront enregistrées dans une structure de dossiers hiérarchique.

Pour permettre au logiciel de fusion de fonctionner avec un volume cubique complet, complétez le volume acquis par des images noires synthétiques, c’est-à-dire des images du même type et des mêmes dimensions que celles collectées, mais avec une intensité nulle, à l’aide d’un logiciel automatisé. Ensuite, lancez le logiciel VA A 3D avec les modules complémentaires Terra, Stitcher et Tarly installés, puis chargez le module complémentaire Terra Stitcher. Sélectionnez le répertoire contenant le volume image et indiquez les orientations relatives des axes par rapport à un système de coordonnées trirectangulaire de référence, ainsi que la taille des voxels.

Lancez maintenant la première partie de l'assemblage. Le logiciel calculera le déplacement relatif entre les paires de piles et déterminera un positionnement optimal global pour l'ensemble des piles. Choisissez d'enregistrer le volume assemblé en résolution simple ou en format multi-résolution. L'échelle permet une visualisation multi-résolution avec le greffon tarly.

Dans les deux cas, si l'image de résolution supérieure dépasse quelques gigaoctets, sélectionnez également le mode d'enregistrement multi-pile et spécifiez la taille des sous-piles individuelles. Cela permettra un accès efficace aux données stockées. Lancez maintenant la deuxième partie du regroupement.

Le logiciel fusionnera les piles alignées et les enregistrera en mode monopile ou multipile. Une fois l'opération terminée, fermez le plugin Terra Stitcher. Ensuite, chargez le plugin terra fly.

Sélectionnez le dossier contenant le volume multicanal et multi-résolution, puis indiquez la taille du terrier et les orientations des axes. Le volume sera chargé à la résolution minimale. Pour passer à une résolution plus élevée, utilisez simplement la molette de la souris.

Alternativement, on peut double-cliquer sur un point précis de l'image, choisir de faire un zoom autour d'un repère existant ou spécifier directement les coordonnées du volume d'intérêt. Pour revenir à une résolution inférieure, il suffit d'utiliser la molette de la souris. Le protocole décrit peut être utilisé pour reconstruire, avec une résolution à l'échelle du micron, soit des cerveaux entiers de souris, soit des parties excisées, sans nécessiter de sectionnement physique.

Chez cet animal, le cervelet entier d'une souris L7 GFP de 10 jours postnataux est présenté ici comme résultat représentatif. Tous les neurones du gène Perkin sont marqués avec l'EGFP. Après un agrandissement, la structure lamellaire typique du cortex cérébelleux devient visible ; un agrandissement supplémentaire permet de distinguer clairement chaque corps cellulaire de neurone burkini.

Le protocole décrit peut donc être utilisé pour analyser l'organisation spatiale neuronale dans diverses études de neurodéveloppement. Comme second résultat représentatif, nous pouvons ici observer des images de la section du cerveau UN d'une cuisse adulte, provenant d'une souris GFPM. Chez cet animal transgénique, l'EGFP est exprimée dans un sous-ensemble neuronal aléatoire et dispersé.

La moitié droite du cerveau est montrée ici. En zoomant de plus en plus, les processus neuronaux deviennent distinguables. Ce résultat démontre que le protocole décrit permet une imagerie à résolution micrométrique dans l'ensemble du cerveau de souris adulte, ouvrant ainsi la possibilité d'étudier l'anatomie complète du cerveau à une résolution cellulaire.

Dans les modèles murins de maladies neurodégénératives, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre jours si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien se rappeler de filtrer correctement la solution de déshydratation et de nettoyage afin de préserver la fluorescence de la GFP. L'outil de visualisation multi-résolution présenté ici peut également être utilisé pour explorer de très grands ensembles de données obtenus avec d'autres techniques telles que la micro-section optique en tomographie.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment dater, évaluer et rendre transparent un cerveau de souris fixé. L’imagerie est réalisée par microscopie à feuillet confocal et la visualisation du volume reconstruit s’effectue en 3D en réalité virtuelle à l’aide du plugin Tely.