Name: Résolution tomographie optique de cerveaux de souris entières avec Feuille confocale microscopie optique Micron-échelle de (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez la reconstruction d'un cerveau de souris entier à l'échelle du micron par tomographie optique et microscopie à feuille de lumière confocale. Cette méthode permet d'étudier la distribution neuronale avec une résolution fine.

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Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du financement du septième programme-cadre de l&#39;Union européenne (FP7/2007-2013) en vertu de conventions de subvention n. 228334 et 241526. Ce projet de recherche a également été soutenu par la subvention de recherche Human Frontier Science Program (RGP0027/2009), et par le ministère italien de l&#39;éducation, Université et de la Recherche dans le cadre du projet phare Nanomax et par le ministère italien de la Santé dans le cadre de la &quot;Les cellules souches Appel à propositions&quot;. Cette recherche a été réalisée dans le cadre des activités de recherche de la fondation de ICON soutenus par &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot;.

Une. Préparation de tissus et de stockage <ol><li> Fixer cerveau de souris à travers perfusion transcardial norme 13 avec 20 ml de 0,01 M de tampon phosphate salin (PBS), suivi par 100 ml de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS 0,01 M. Ajuster soigneusement le pH des deux solutions à 7,6: des valeurs légèrement inférieures du pH peuvent étancher la fluorescence de l&#39;EGFP. </li><li> Post-fixer les cerveaux excisées pendant la nuit dans du paraformaldéhyde 4% à 4 ° C. </li><li> Rincer deux fois (30 min chacun) dans du PBS 0,01 M et de stocker dans du PBS 0,01 M à 4 ° C. </li></ol> 2. La déshydratation et la compensation Remarque: le protocole de déshydratation et de compensation suit de près celui décrit par Becker et al 10. <ol><li> Pour éliminer le solvant à partir des peroxydes de déshydratation (de tétrahydrofuranne, THF), qui trempe fortement XFP fluorescence, filtre THF activé basique avec de l&#39;oxyde d&#39;aluminium (degré d&#39;activité Brockman I, environ 250 g / L de THF) en utilisant un chromaTO colonne. Éviter la fissuration de la colonne, ce qui réduirait l&#39;élimination de peroxyde. </li><li> Ajouter un stabilisateur (hydroxytoluène butylé, de 250 mg / L) à la solution finale, même si le THF a été déjà stabilisé avant la filtration. Stabilisateur est en fait retenu par l&#39;oxyde d&#39;aluminium: THF sans stabilisateur peut développer de grandes quantités de peroxydes et peut être explosive et dangereuse. </li><li> Déshydrater l&#39;ensemble du cerveau de la souris dans une série graduée de THF dans de l&#39;eau pure: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, une heure chaque, puis 100% pendant une nuit. Placez le flacon de l&#39;échantillon sur une roue tournante. Pour éviter l&#39;exposition de lumière, envelopper les flacons avec une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Filtrage du solvant de compensation (éther de dibenzyle, DBE) avec de l&#39;oxyde d&#39;aluminium (activé basique, activité de qualité I Brockman, environ 250 g / L de DBE) en utilisant un entonnoir de filtration. </li><li> Désactivez l&#39;échantillon dans 100% DBE. Changer la solution après 3 et 6 heures. </li></ol> 3. Spécimen de montage <ol><li> Quand le cerveau semble transparent à l&#39;oeil (généralement 1 heure après le deuxième changement de DBE), monter sur la plaque d&#39;imagerie à bout par l&#39;une des méthodes suivantes: </li><li><ol><li> Montage direct - plonger délicatement l&#39;échantillon sur une des pointes (Figure 3a). </li><li> Disque agarose - Plongez un disque en gel d&#39;agarose de 6% sur les pointes. Fixer doucement l&#39;échantillon sur le disque d&#39;agarose avec de la colle acrylique (Figure 3b). Attendez environ 1 minute pour le durcissement. </li><li> Bécher agarose - Plongez un bécher en gel d&#39;agarose à 3% sur les pointes. Placer délicatement l&#39;échantillon sur le fond du bécher (figure 3c). </li></ol></li></ol> Remarque 1: Montage dans le bécher agarose doit être préféré quand il est important d&#39;imagerie de l&#39;échantillon dans son intégralité, mais le gel d&#39;agarose entourant l&#39;échantillon donne lieu à diffusion de la lumière supplémentaire qui pourrait être préjudiciable à la qualité de l&#39;image. Si une petite partie de l&#39;échantillon pourrait être exclu de l&#39;imagerie, il est préférable de monter le specImen sur disque agarose ou directement sur la pointe. La première méthode est la mieux placée pour maintenir le cerveau horizontal (à l&#39;exclusion de l&#39;imagerie d&#39;une partie ventrale ou dorsale du cerveau), le dernier à garder le cerveau verticale (à l&#39;exclusion de l&#39;image d&#39;une partie de bulbes olfactifs ou de la moelle épinière). Note 2: le gel d&#39;agarose doit être préparé dans l&#39;eau, puis déshydratée avec du THF (50% et 100% de 4 heures chacun) et effacé dans DBE 100% pendant 4 heures ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il ressemble clairement transparent. <ol start="3"><li> Après le montage de l&#39;échantillon suivant l&#39;une des méthodes précédentes, positionner la plaque de formation d&#39;image à l&#39;intérieur de la chambre à échantillon en utilisant une pince à épiler. Remplir la chambre avec une solution de compensation. </li></ol> 4. Tomographie Préparation <ol><li> Retirer la fente de recueillir autant que possible fluorescence. </li><li> Éclairer l&#39;échantillon avec une puissance faible de laser pour éviter photoblanchiment. </li><li> Déplacer l&#39;échantillon dans les trois directions en utilisant le micro-positionnement syste entraînée par logicielm. Identifier, pour chaque direction des coordonnées minimales et maximales pour laquelle l&#39;échantillon est éclairé et est dans le champ de vision de la caméra (figure 4a). </li><li> Insérez les coordonnées ci-dessus en tant que paramètres pour le sous-programme «Pré-tomographie. Spécifiez également la distance entre les piles adjacentes à être utilisé dans la tomographie, et l&#39;étape d&#39;échantillonnage pré-tomographie direction z. </li><li> Lancer la pré-tomographie, qui recueille les images dans chaque pile avec le z échantillonnage déterminé à (4.4). </li></ol> Remarque: Les images recueillies sont utilisées par un logiciel de préparer une carte approximative de la forme de l&#39;échantillon et la position (4b figure), qui permet de restreindre l&#39;acquisition de tomographie seulement pour le volume réellement occupé par l&#39;échantillon, en réduisant le temps d&#39;imagerie et ainsi photoblanchiment. 5. Tomographie acquisition <ol><li> Déplacer l&#39;échantillon à l&#39;extérieur de la nappe de lumière à l&#39;aide du système de micropositionnement. </li><li> Incla puissance du laser rease et arrêter le mouvement de tous les systèmes de balayage, afin d&#39;illuminer seulement une ligne fixe au centre du champ de vue. </li><li> Monter la fente et l&#39;aligner en utilisant le signal d&#39;autofluorescence de la solution de compensation. Vous devriez voir clairement la ligne de fente au centre du champ de vision. </li><li> Ré-activer le système de balayage, de réduire la puissance du laser et déplacer l&#39;échantillon à l&#39;intérieur de la nappe de lumière à l&#39;aide du système de micropositionnement. A noter que la puissance du laser utilisé avec la fente sera plus élevée que celle qui est utilisée sans elle, depuis les blocs de filtres spatiaux d&#39;une fraction non négligeable de la lumière. </li><li> Réglez l&#39;amplitude et le décalage des systèmes de balayage et de-balayage avec le logiciel de contrôle, jusqu&#39;à ce que les images sont claires et lumineuses. </li><li> Lancez le logiciel d&#39;acquisition de tomographie, après l&#39;étape de la mise en z approprié pour l&#39;expérience. Le volume sera reproduite dans de nombreux parallèles, partiellement piles qui se chevauchent (figure 5a), et les images seront enregistrées dansune structure hiérarchique de dossiers. </li></ol> 6. Couture et visualisation <ol><li> Compléter le volume acquis avec des images noires synthétiques (c.-à-images du même type et les dimensions des recueillies ceux-, mais avec une intensité nulle) en utilisant un logiciel automatisé (figure 4c). Cette étape est obligatoire pour que le logiciel d&#39;assemblage pour faire face à un volume cubique complète. </li><li> logiciel de Vaa3D de lancement (téléchargeable gratuitement à partir de <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) avec les plugins TeraStitcher et TeraManager installés. </li><li> Charger le plugin TeraStitcher. Sélectionnez le répertoire contenant le volume imagé, indiquer les orientations relatives des axes (par rapport à une référence droitier système de coordonnées) et la taille de voxel. </li><li> Lancez la première partie de la couture. Le logiciel calcule le déplacement relatif entre les couples de piles, et de trouver un déplacem optimale globaleent pour toutes les piles ensemble (figure 5b). </li><li> Sélectionnez pour enregistrer le volume cousu dans une seule résolution ou en format multi-résolution. Ce dernier permet de multi-résolution de visualisation avec le plugin TeraManager. Dans les deux cas, si l&#39;image haute résolution est plus grande que quelques giga-octets, sélectionnez également le multi-pile de sauvegarde modalité et spécifier la taille de sous-champs individuels. Ceci permettra un accès efficace aux données stockées. </li><li> Lancer la deuxième partie de la couture. Le logiciel va fusionner les piles alignées, et de les enregistrer en mode mono-ou multi-pile (figures 5c et 5d). A la fin fermer le plugin TeraStitcher. </li><li> Charger le plugin TeraManager. Sélectionnez le dossier avec le volume empilées multiples multi-résolution, et indiquer la taille de voxel et axes orientations. Le volume sera chargé à la résolution minimale. </li><li> Pour zoomer sur une résolution plus élevée, sélectionnez un point de repère à l&#39;aide du clic droit modality de Vaa3D, puis zoomer en utilisant défilement de la souris. Sinon, vous pouvez sélectionner directement le retour sur investissement pour l&#39;agrandir avec un clic droit, ou spécifier les coordonnées du volume d&#39;intérêt. </li><li> Pour faire un zoom avant à basse résolution, il suffit d&#39;utiliser la molette de la souris. </li></ol>

<ol><li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+and+the+small%3A+challenges+of+imaging+the+brain%27s+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

CLSM couplé avec compensation chimique représentent un outil puissant pour étudier la neuroanatomie de cerveaux de souris entières marquées avec des sondes fluorescentes, des protéines ou des colorants synthétiques. Depuis la lumière émise en dehors du plan focal est bloqué par un filtre spatial physique, l&#39;imagerie à haut contraste est également possible de spécimens épais, tout en maintenant le taux de rafraîchissement élevés typiques de l&#39;architecture de nappe de lumière. Le principal problème à régler lors de l&#39;utilisation des méthodes décrites est la maximisation du contraste. En fait, le signal disponible est réduite à la fois par des facteurs chimiques et optiques. Du point de vue chimique, les procédures de compensation sur la base de solvant organique peuvent étancher émission de protéines fluorescentes et autres colorants fluorescents 7. La filtration du solvant pour éliminer les peroxydes, comme décrit par Becker et al. 10, permet de maintenir un bon niveau de fluorescence aussi dans les tissus de solvant dégagé. Publiered méthodes de compensation à base d&#39;eau 14 ne réduisent pas l&#39;efficacité de la fluorescence, mais se traduisent par moins bonne transparence lorsqu&#39;il s&#39;agit de cerveaux entiers de souris, au moins avec les techniques optiques linéaires. D&#39;autre part, pour le moment il n&#39;ya pas d&#39;objectifs commerciaux à longue distance de travail corrigées de l&#39;indice de réfraction élevé (n ≈ 1,56) dégager des solutions utilisées. Ainsi, la non-concordance d&#39;indice de réfraction entre le milieu dans lequel l&#39;échantillon est immergé et la conception de l&#39;objectif une donne lieu à de fortes aberrations sphériques. Outre la réduction de la résolution du microscope, telles aberrations se traduisent par une baisse de l&#39;intensité de l&#39;image et le contraste, car la lumière est répartie sur une zone plus grande. Solutions possibles à ce problème comprennent l&#39;utilisation de l&#39;optique adaptative 15 et / ou des correcteurs asphériques statiques. Toute amélioration de contraste de l&#39;image et de l&#39;intensité affecte également la vitesse facilement imagerie, depuis une plus courtetemps intégration par image peut être choisi. En ce moment, CLSM peut se permettre une vitesse de formation d&#39;image d&#39;environ 10 um 6 3 / sec, avec un temps d&#39;exposition de la caméra de 100 msec 9. A cette vitesse il faut de 1-3 jours à l&#39;image d&#39;un cerveau de souris ensemble, en fonction de la taille de l&#39;échantillon. Même si aucune dégradation significative de la qualité de l&#39;image est observée tout au long de cette longue séance d&#39;imagerie, principalement en raison de la faible photoblanchiment intrinsèque de la feuille éclairage lumière 6, le temps nécessaire à l&#39;image d&#39;un cerveau de souris unique pourrait aboutir à réduire l&#39;applicabilité de CLSM. Une augmentation de 10 fois de l&#39;efficacité du système, couplé avec l&#39;utilisation d&#39;une caméra à haute vitesse pour la détection, serait de réduire le temps d&#39;imagerie à plusieurs heures, ce qui permet une utilisation de routine du protocole décrit. Malgré toutes les limites ci-dessus, CLSM imagerie couplé à la compensation chimique des tissus permet de reconstruire des cerveaux de souris entières avec une résolution micrométrique en moins d&#39;unesemaines. D&#39;autres méthodes optiques pour l&#39;imagerie du cerveau entier offrent une résolution plus élevée que CLSM, mais au prix d&#39;une préparation plus longue et / ou le temps d&#39;imagerie 2-4, ou d&#39;un z clairsemée échantillonnage 5. Les méthodes décrites dans cet article peuvent être utilisés en combinaison avec des stratégies différentes pour le marquage fluorescent: animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans certains sous-ensembles de neurones, la transfection virale, l&#39;injection de colorant intraparenchymateuse, etc Dans la pratique, toutes les stratégies de coloration précédentes sacrifices d&#39;animaux sont compatibles avec CLSM . En fait, post-mortem étiquetage fluorescent de cerveaux de souris entières n&#39;a pas été démontré jusqu&#39;à présent, de toute façon, si un tel genre de coloration serait possible dans un proche avenir, le nombre de spécimens qui pourraient être reconstruites avec CLSM deviendra beaucoup plus grande, peuvent éventuellement inclure des tissus cérébraux humains. En conclusion, la microscopie confocale à nappe de lumière utilisé en combinaison avec tissue de compensation et de gestion des données multi-résolution peuvent permettre aux chercheurs de reconstituer et d&#39;analyser des échantillons macroscopiques de la résolution dans l&#39;échelle du micron, avec des efforts technologiques qui sont bien de la main de la plupart des laboratoires. Les applications potentielles de CLSM sont bien sûr pas limitée aux neurosciences, mais s&#39;étend à tous les domaines de recherche dans lesquels la feuille de microscopie optique a déjà été utilisé, comme l&#39;embryogenèse 16,17 et l&#39;anatomie des petits animaux 18.

Par rapport à notre compréhension de la fonction cérébrale sous-jacente des mécanismes moléculaires et cellulaires, notre connaissance de l&#39;amende neuroanatomie ressemble encore à ses balbutiements 1. En fait, il nous manque encore des cartes détaillées de la position du corps cellulaire des neurones ou des projections à long terme dans le cerveau. En fait, de nombreux efforts technologiques sont consacrées à reconstruire le cerveau de la souris à la résolution microscopique. Méthodes optiques basés sur des coupes sériées des échantillons de résine intégré, comme couteau microscopie à balayage (KESM) 2, tomographie sectionnement Micro-optique (MOST) 3 et la fluorescence-MOST (IME) 4, peut fournir sub-micronique résolution en trois dimensions imagerie de cerveaux de souris entières. Toutefois, le temps total nécessaire pour la préparation et l&#39;imagerie d&#39;un seul échantillon est de l&#39;ordre de plusieurs semaines, limitant l&#39;application pratique de ces méthodes. Une autre technique basée sur des coupes sériées (mais sans enrobage de résine), de série à deuxTomographie (STP) 5, permet une résolution en trois dimensions de haute imagerie. Cependant, cette technique a été démontrée dans le cerveau entier de souris seulement avec un échantillonnage très clairsemée, la collecte de 1 article tous les 50 um 5, et à notre connaissance STP n&#39;ont pas encore produit une reconstruction complète d&#39;échantillonnage d&#39;un cerveau de souris. Une méthode optique de pointe pour reconstruire spécimens entiers en trois dimensions à haute vitesse est la microscopie de nappe de lumière 6. Dans ce schéma optique de l&#39;échantillon est éclairé par une feuille mince de la lumière et de l&#39;émission de fluorescence est collectée selon un axe perpendiculaire au plan d&#39;illumination. De cette façon seulement fluorophores en-focus sont excités et il est possible de réaliser le sectionnement optique en configuration grand champ, garantissant des cadences élevées. Lorsqu&#39;il est couplé à la compensation des protocoles basés sur la substitution de l&#39;eau avec un liquide de réfraction d&#39;adaptation d&#39;indice 7, la microscopie à lumière feuille a été appliquée àspécimens macroscopiques, comme les cerveaux de souris entiers 8. Cependant, l&#39;échantillon induite par diffusion de la lumière, ce qui affecte spécimens encore défrichées, dégrade la nappe de lumière menant à l&#39;excitation des fluorophores hors-focus qui ajoute un ensemble flou sur les images acquises. Pour collecter sélectivement seulement photons dans-focus, nous avons récemment couplé éclairage de plaque d&#39;éclairage à un système de détection confocale 9. En microscopie confocale nappe de lumière (CLSM), out-of-focus et photons diffusés sont rejetés par un filtre spatial linéaire (fente) avant la détection (figure 1). Pour obtenir un fonctionnement à foyer commun dans une architecture de nappe de lumière, l&#39;éclairage est produit au moyen d&#39;une ligne de balayage, et un système de balayage dans le chemin de détection crée une image statique de la ligne de balayage d&#39;excitation à l&#39;emplacement de la fente. Un troisième système de balayage reconstitue une image en deux dimensions sur le capteur de la caméra. CLSM offre une amélioration du contraste de 100% chez la souris dégagécerveau par rapport à la microscopie conventionnelle feuille de lumière, tout en maintenant un taux de 10 Hz cadre. Avec CLSM il est possible de reconstruire les cerveaux de souris entières avec une résolution de 2 um en XY et Z 9 um, et avec un contraste suffisant pour discerner les neurones marqués par fluorescence unique. Dans le présent article, nous décrivons la conduite expérimentale de reconstruire un cerveau de souris avec CLSM. cerveaux de souris aldéhyde fixe sont déshydratés dans une série graduée de tétrahydrofuranne sans peroxyde et ensuite autorisé dans dibenzyléther sans peroxyde (figure 2), suivant le protocole développé par Becker et al. 10 Le spécimen dégagé est ensuite monté avec soin sur un tipped plaque et positionné dans la chambre de l&#39;imagerie confocale d&#39;une feuille microscope optique sur-mesure. L&#39;échantillon peut être monté directement en le plongeant sur ​​une extrémité de la plaque (figure 3a), ou alternativement, il peut être collé sur un disque de gel d&#39;agarose autorisé (Figure3b) ou placé dans la cavité d&#39;un bêcher en gel d&#39;agarose dégagé (figure 3c). Une tomographie optique de l&#39;ensemble du cerveau est alors effectué, autant de piles adjacentes parallèles sont acquises afin de couvrir la totalité du volume du cerveau (figure 4). Un échantillon de pré-tomographie, qui produit une carte approximative de la position de l&#39;échantillon et de la forme, qui garantit la formation d&#39;image est exécutée uniquement dans le volume occupé par l&#39;échantillon. Les piles de tomographie sont ensuite cousues ensemble avec un logiciel sur mesure et enregistrées dans un système multi-résolution hiérarchique 11. Cerveau de souris peuvent éventuellement être explorées avec le logiciel multi-résolution visualisation Google Maps comme prototypique. Ces deux instruments logiciels sont intégrés en tant que plugins dans la plate-forme open-source Vaa3D 12. Nous montrons enfin des images représentatives de cerveaux de souris pour démontrer les capacités du gazoduc expérimental décrit dans l&#39;étude amende neuroanatom muriny.

<table><tbody><tr><td>Comprimés salins tamponnés au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417_100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Sans peroxyde Tétrahydrofurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde d’aluminium activé, basique, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Éther dibenzylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxytoluène butylé</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W218405</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Type III-A, High EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Colle acrylique</td><td>Bostik</td><td>D2498</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Vaa3D</td><td>open source</td><td></td> librement <td>téléchargeable sur <a href="http://www.vaa3d.org/ » target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td></tr></tbody></table>

résolution tomographie optique de cerveaux de souris entières avec feuille confocale microscopie optique micron-échelle de

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Comprendre l&#39;architecture du cerveau des mammifères à seule cellule de résolution est l&#39;un des principaux enjeux des neurosciences. Cependant, la cartographie de soma et projections neuronales tout au long de l&#39;ensemble du cerveau est encore difficile pour les technologies d&#39;imagerie et de gestion de données. En effet, les volumes macroscopiques doivent être reconstruits avec une haute résolution et un contraste dans un délai raisonnable, la production de jeux de données dans le domaine de TeraByte. Nous avons récemment démontré une méthode optique (microscopie confocale lumière de la feuille, CLSM) capable d&#39;obtenir la reconstruction micrométrique de cerveaux de souris entières marquées par une meilleure protéine fluorescente verte (EGFP). La combinaison de l&#39;éclairage de plaque d&#39;éclairage et de détection confocale, CLSM permet l&#39;imagerie profondément à l&#39;intérieur des échantillons compensés macroscopiques avec un contraste élevé et la vitesse. Nous décrivons ici le pipeline expérimental complet pour obtenir des images complètes et lisibles de cerveaux de souris entières marquées par des protéines fluorescentes. La compensation et le montage pes procédures sont décrites, ainsi que les étapes à effectuer une tomographie optique sur l&#39;ensemble de son volume par l&#39;acquisition de plusieurs piles adjacentes parallèles. Nous avons montré l&#39;utilisation d&#39;outils logiciels sur mesure open-source permettant coutures des piles multiples et la navigation de données multi-résolution. Enfin, nous avons illustré quelques exemples de cartes cérébrales: le cervelet à partir d&#39;une souris L7-GFP transgénique, dans laquelle toutes les cellules de Purkinje sont marqués de manière sélective, et l&#39;ensemble du cerveau à partir d&#39;un Thy1-GFP-M de souris, caractérisé par un marquage neuronal clairsemée aléatoire.

Le protocole décrit peut être utilisé pour reconstituer à la résolution soit des cerveaux de souris entières échelle du micron ou de parties excisées, sans avoir besoin de sectionnement physique. Comme un résultat représentatif, dans la figure 6 l&#39;ensemble cervelet d&#39;une souris L7-GFP (jour postnatal 10) est affiché. Dans cet animal toutes les cellules de Purkinje sont étiquetés avec EGFP. Si on fait un zoom, la structure lamellaire typique du cortex cérébelleux peut être vu (figure 7). Zoom plus en permet distinguant clairement chaque cellule soma Purkinje (figure 8). Le protocole décrit peut donc être utilisé pour cribler l&#39;organisation spatiale de neurones dans diverses études du développement neurologique. Dans un deuxième résultat représentatif, nous présentons des images du cerveau non scié d&#39;un Thy1-GFP-M souris adulte. Dans cet animal transgénique EGFP est exprimé dans un sous-ensemble de neurones épars aléatoire. La moitié droite du cerveau est représentée à la figure 9. Comme nous l&#39;avonsZoom-in de plus en plus (Figures 10 et 11), des processus neuronaux deviennent distinguables. Ce résultat démontre que le protocole décrit permet la résolution d&#39;imagerie micron-échelle dans le cerveau de souris adultes entiers, ouvrant la possibilité d&#39;étudier l&#39;ensemble du cerveau anatomie à la résolution cellulaire dans des modèles murins de la maladie neurodégénérative. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figure 1. Système optique de la microscopie confocale à feuille de lumière (CLSM). (A) Vue de dessus de l&#39;appareil, montrant la voie d&#39;excitation. L&#39;émission laser à partir d&#39;un état solide (SSAD) de laser pompé par diode à 488 nm, après l&#39;expansion et la collimation par un premier télescope, entre dans un filtre acousto-optique accordable (AOTF) qui régule l&#39;intensité du faisceau. Ensuite, un second télescope élargit encore la poutre. Un miroir de galvanomètre verticalement (selon y) scanne le être<html> h, qui est focalisée par une lentille à l&#39;intérieur de la chambre à échantillons. (b) vue latérale de l&#39;appareil, montrant la voie de détection. Lumière collectée par l&#39;objectif de détection est non balayée verticalement par un miroir de galvanomètre et focalisé par une lentille, à produire une image fixe de la ligne d&#39;excitation en mouvement. A la position de l&#39;image fixe d&#39;un filtre spatial linéaire (fente) est placé. Après la fente, un miroir de galvanomètre placé à l&#39;intérieur d&#39;un système de lentilles de 4f reconstruit une image 2-dimensionnel sur la puce d&#39;un dispositif à couplage de charge d&#39;électrons de multiplication (EM-CCD). Un filtre passe-bande de fluorescence supprimer toute lumière parasite excitation avant la détection. Rayons représentatifs de l&#39;excitation, de détection et de détection de la lumière de filtré passe-bande sont représentés par des rayons bleus et bleu-vert, lumière, respectivement. Les distances focales de tous les objectifs réellement utilisées dans le microscope sont indiqués. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Figure 2. Compensation spécimen. Des cerveaux de souris fixés au formaldehyde, qui sont stockés dans du PBS 0,1 M à 4 ° C (a), sont déshydratés dans une série graduée de tétrahydrofuranne (THF, b) et ensuite autorisé dans l&#39;éther de dibenzyle, de 100% (DBE , c). L&#39;étape de déshydratation provoque également un certain rétrécissement de tissu. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figure 3. Exemplaire de montage pour l&#39;imagerie par CLSM. Dégagé Le cerveau peut être plongé directement sur ​​la plaque de montage inclinée (a), collé sur un disque d&#39;agarose dégagé (b), ou inséré dans un bêcher agarose dégagé (c). Figure 4. acquisition de tomographie. Les pré-tomographie échantillons de routine d&#39;un parallélépipède contenant le cerveau (a) de définir le nombre et la durée des piles adjacentes parallèles nécessaires à l&#39;image tout l&#39;échantillon (b). Après tomographie, des images en noir sont générés pour compléter le volume acquis virtuel à un parallélépipède (c). <img alt="Figure 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figure 5. Volume couture. L&#39;image recueillie piles se chevauchent partiellement entre eux (un), permettant leur alignement précis avec le plugin TeraStitcher (b). Le plugin fusionne ensuite les piles alignées en soit un seul stack (c) ou multi-stationcked (d) la représentation multi-résolution. <img alt="Figure 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figure 6. Tout le cervelet de souris GFP L7-P10, dans laquelle toutes les cellules de Purkinje sont marquées avec EGFP. Barre d&#39;échelle, 1 mm. <img alt="Figure 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figure 7. Zoom avant d&#39;une partie du cervelet montre la figure 6, montrant la structure lamellaire typique du cortex cérébelleux. Barres d&#39;échelle, 500 um. <img alt="Figure 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figure 8. En outre zoom-in d&#39;une partie du cervelet montre la figure 6. Purkinje cellules soma peut être clairement distinguered. La barre d&#39;échelle, 200 um. <img alt="Figure 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> Figure 9. La moitié droite du cerveau d&#39;un Thy1-GFP-M souris adulte, caractérisée par une rare non spécifique neuronale étiquetage EGFP. Barre de l&#39;échelle, 1 mm. <img alt="Figure 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figure 10. Zoom-in d&#39;une partie de la moitié d&#39;un cerveau de la figure 9, montrant une partie de l&#39;hippocampe et du cortex. Echelle, 200 um. <img alt="Figure 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figure 11. En outre zoom-in d&#39;une partie de la moitié d&#39;un cerveau de la figure 9. Plusieurs axones du cortex peuvent être clairement distingués. La barre d&#39;échelle, 50 um.

Dans cet article, nous décrivons la procédure expérimentale complète de reconstruire, avec une haute résolution, le cerveau anatomie amende de cerveaux de souris marqués par fluorescence. Le protocole décrit comprend la préparation de l&#39;échantillon et de la compensation, spécimen de montage pour l&#39;imagerie, les données de post-traitement et de visualisation multi-échelle.

Résolution tomographie optique de cerveaux de souris entières avec Feuille confocale microscopie optique Micron-échelle de

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

L'objectif général de cette procédure est de reconstruire et de visualiser intégralement un cerveau de souris avec une résolution à l'échelle micrométrique. Cela est réalisé en premier lieu en déshydratant un cerveau de souris fixé selon une série tétraédrique intégrée. La deuxième étape consiste à rendre l'échantillon transparent dans l'éther benzylique.Ensuite, le cerveau est imagé à l'aide d'un microscope confocal à feuillet lumineux. La dernière étape consiste à utiliser un logiciel pour aligner et assembler les piles d'images acquises. Enfin, un outil de visualisation à résolution multiple peut être utilisé pour parcourir le volume d'image reconstruit.Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes comme la microscopie confocale ou la microscopie photo est que le volume complet d'un cerveau de souris peut être imagé en seulement quelques jours. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la répartition des différents types de neurones dans tout le cerveau. Ce capot métallique fournit-il des informations sur l'autonomie fine du cerveau ?Il peut également être appliqué à des embryons de souris ou à des mouches du pied, démontrant que la procédure sera réinitialisée. Un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer ce protocole, effectuez une fixation standard des cerveaux de souris par perfusion transcardiale, puis une post-fixation pendant la nuit, avant de procéder à la déshydratation et à la clarification.Ensuite, comme le solvant de déshydratation, le THF, éteint fortement la fluorescence des XFP, effectuez une filtration pour éliminer les peroxydes à l’aide d’oxyde d’aluminium activé basique en utilisant une colonne de chromatographie, en évitant toute fissuration de la colonne, ce qui réduirait l’élimination des peroxydes avant l’ajout d’un stabilisant à la solution finale. Même si le THF avait déjà été stabilisé avant la filtration, le stabilisant sera retenu par l’oxyde d’aluminium. Notez que le THF sans stabilisant peut former de grandes quantités de peroxydes et peut être explosif et dangereux.Ensuite, déshydratez l'ensemble du cerveau de souris selon une série intégrée de THF dans de l'eau pure. Puis, placez le flacon contenant l'échantillon sur une roue rotative afin d'éviter toute exposition à la lumière. Enveloppez le flacon dans du papier d'aluminium.Enfin, filtrez le solvant de clarification à l'aide d'oxyde d'aluminium en utilisant une ampoule de filtration. Ensuite, clarifiez l'échantillon dans du DBE à 100 %, en changeant la solution après trois et six heures, lorsque le cerveau apparaît transparent. Habituellement une heure après le deuxième changement de DBE, montez-le sur une plaque d'imagerie inclinée selon l'une des méthodes présentées ici.Montage direct via disque agros ou montage via un haut-parleur agro pour un montage direct : plongez délicatement l'échantillon sur l'une des pointes afin d'utiliser le plongeon avec le disque aros. Un disque constitué de gel aros à 6 % est placé sur les pointes. Fixez ensuite doucement l'échantillon sur le disque agros avec de la colle acrylique et attendez environ une minute pour que la polymérisation s'effectue avant le montage.À l'aide du plongeon en bécher Agros, appliquer un bécher composé de 3 % de gel Agros sur les embouts. Placer ensuite délicatement l'échantillon au fond du bécher. Après avoir monté l'échantillon selon l'une de ces méthodes, positionner la plaque d'imagerie à l'intérieur de la chambre d'échantillonnage à l'aide de pinces.Ensuite, remplissez la chambre avec la solution de clarification. Préparez-vous ensuite à la tomographie. Retirez d'abord la fente afin de collecter le maximum de fluorescence, puis éclairez l'échantillon avec une faible puissance laser.Pour éviter le photoblanchiment, déplacez l'échantillon dans les trois directions x, y et Z à l'aide du système motorisé de micro-positionnement contrôlé par logiciel. Pour chaque direction, identifiez les coordonnées minimales et maximales pour lesquelles l'échantillon est éclairé tout en restant dans le champ de vue de la caméra. Insérez ensuite les coordonnées déterminées comme paramètres pour la sous-routine de pré-tomographie.Spécifiez également la distance entre les empilements adjacents à utiliser en tomographie et lors de l'étape d'échantillonnage préalable à la tomographie dans la direction Z. Enfin, lancez la tomographie préalable, qui acquerra les images dans chaque empilement selon les paramètres d'échantillonnage Z définis à l'étape précédente. Pour commencer l'acquisition, déplacez d'abord l'échantillon hors du plan lumineux à l'aide du système de micro-positionnement.Ensuite, augmentez la puissance du laser et arrêtez le mouvement de tous les systèmes de balayage afin d'éclairer uniquement une ligne fixe au centre du champ de vision. Puis, montez la fente et alignez-la à l'aide du signal d'autofluorescence provenant de la solution de clarification. Vous devez maintenant voir clairement la ligne de la fente au centre du champ de vision.Réactivez maintenant le système de balayage. Réduisez la puissance du laser et déplacez l'échantillon à l'intérieur de la feuille de lumière à l'aide du système de micro-positionnement. Notez que la puissance laser utilisée avec la fente sera supérieure à celle utilisée sans celle-ci.Étant donné que le filtre spatial bloque une fraction non négligeable de lumière, ajustez l'amplitude et le décalage des systèmes de balayage et de balayage d à l'aide du logiciel de contrôle jusqu'à ce que les images apparaissent nettes et lumineuses. Réglez ensuite le pas Z approprié pour l'expérience et lancez le logiciel d'acquisition de tomographie. Le volume sera imagé en de nombreuses séries parallèles partiellement superposées, et les images seront enregistrées dans une structure de dossiers hiérarchique.Pour permettre au logiciel de fusion de fonctionner avec un volume cubique complet, complétez le volume acquis par des images noires synthétiques, c’est-à-dire des images du même type et des mêmes dimensions que celles collectées, mais avec une intensité nulle, à l’aide d’un logiciel automatisé. Ensuite, lancez le logiciel VA A 3D avec les modules complémentaires Terra, Stitcher et Tarly installés, puis chargez le module complémentaire Terra Stitcher. Sélectionnez le répertoire contenant le volume image et indiquez les orientations relatives des axes par rapport à un système de coordonnées trirectangulaire de référence, ainsi que la taille des voxels.Lancez maintenant la première partie de l'assemblage. Le logiciel calculera le déplacement relatif entre les paires de piles et déterminera un positionnement optimal global pour l'ensemble des piles. Choisissez d'enregistrer le volume assemblé en résolution simple ou en format multi-résolution. L'échelle permet une visualisation multi-résolution avec le greffon tarly.Dans les deux cas, si l'image de résolution supérieure dépasse quelques gigaoctets, sélectionnez également le mode d'enregistrement multi-pile et spécifiez la taille des sous-piles individuelles. Cela permettra un accès efficace aux données stockées. Lancez maintenant la deuxième partie du regroupement.Le logiciel fusionnera les piles alignées et les enregistrera en mode monopile ou multipile. Une fois l'opération terminée, fermez le plugin Terra Stitcher. Ensuite, chargez le plugin terra fly.Sélectionnez le dossier contenant le volume multicanal et multi-résolution, puis indiquez la taille du terrier et les orientations des axes. Le volume sera chargé à la résolution minimale. Pour passer à une résolution plus élevée, utilisez simplement la molette de la souris.Alternativement, on peut double-cliquer sur un point précis de l'image, choisir de faire un zoom autour d'un repère existant ou spécifier directement les coordonnées du volume d'intérêt. Pour revenir à une résolution inférieure, il suffit d'utiliser la molette de la souris. Le protocole décrit peut être utilisé pour reconstruire, avec une résolution à l'échelle du micron, soit des cerveaux entiers de souris, soit des parties excisées, sans nécessiter de sectionnement physique.Chez cet animal, le cervelet entier d'une souris L7 GFP de 10 jours postnataux est présenté ici comme résultat représentatif. Tous les neurones du gène Perkin sont marqués avec l'EGFP. Après un agrandissement, la structure lamellaire typique du cortex cérébelleux devient visible ; un agrandissement supplémentaire permet de distinguer clairement chaque corps cellulaire de neurone burkini.Le protocole décrit peut donc être utilisé pour analyser l'organisation spatiale neuronale dans diverses études de neurodéveloppement. Comme second résultat représentatif, nous pouvons ici observer des images de la section du cerveau UN d'une cuisse adulte, provenant d'une souris GFPM. Chez cet animal transgénique, l'EGFP est exprimée dans un sous-ensemble neuronal aléatoire et dispersé.La moitié droite du cerveau est montrée ici. En zoomant de plus en plus, les processus neuronaux deviennent distinguables. Ce résultat démontre que le protocole décrit permet une imagerie à résolution micrométrique dans l'ensemble du cerveau de souris adulte, ouvrant ainsi la possibilité d'étudier l'anatomie complète du cerveau à une résolution cellulaire.Dans les modèles murins de maladies neurodégénératives, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre jours si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien se rappeler de filtrer correctement la solution de déshydratation et de nettoyage afin de préserver la fluorescence de la GFP. L'outil de visualisation multi-résolution présenté ici peut également être utilisé pour explorer de très grands ensembles de données obtenus avec d'autres techniques telles que la micro-section optique en tomographie.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment dater, évaluer et rendre transparent un cerveau de souris fixé. L’imagerie est réalisée par microscopie à feuillet confocal et la visualisation du volume reconstruit s’effectue en 3D en réalité virtuelle à l’aide du plugin Tely.

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