Name: Un Exonuclease analyse basée sur la fluorescence pour caractériser DmWRNexo, orthologue humain progéroïde WRN Exonuclease, et son application à dautres nucléases (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Découvrez un test d'exonuclease basé sur la fluorescence pour caractériser l'activité enzymatique de DmWRNexo et étudier la stabilité du génome. Cette méthode reproduisible offre une alternative sûre aux techniques radioactives.

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Nous remercions le programme inter-conseils New Dynamics of Ageing pour le financement de ce travail [ES/G037086/1] et le professeur Dave Sherratt (Département de biochimie, Université d’Oxford) pour l’accès au Fuji FLA-3000.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
<li>Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+Werner%27s+syndrome+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the Werner's syndrome gene.</a> Science. 272, 258-262 (1996).</li>
<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
<li>Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+exonuclease+structure+and+molecular+mechanism+imply+an+editing+role+in+DNA+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).</li>
<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
<li>Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Drosophila+ortholog+of+WRN+exonuclease+that+is+required+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity.</a> Aging Cell. 7, 418-425 (2008).</li>
<li>Cox, L. S., Boubriak, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Instability+in+Premature+Aging%2C+in+DNA+Damage+Repair%2C+Repair+Mechanisms+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Thomas%2C+A.E.%2C+Eds.+Nova+Science+Publishers%22%5BJournal%5D)">DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging.</a> Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).</li>
<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La détermination de l’activité exonucléase des protéines purifiées nécessite l’analyse des produits de clivage de l’ADN. Le clivage séquentiel de l’ADN par les exonucléases peut être visualisé par séparation des produits de clivage marqués sur des gels d’acrylamide. Historiquement, cela impliquait le marquage final du substrat d’ADN avec un radiomarqueur (par exemple 32P ou 35S), mais avec les inconvénients inhérents à l’utilisation du radiomarqueur (coût, problèmes de sécurité et instabili...

Les nucléases jouent un rôle essentiel dans les cellules en éliminant l’ADN endommagé, en résolvant les structures non duplex telles que les jonctions de Holliday et en fournissant une capacité de relecture lors de la réplication de l’ADN, à la fois intrinsèques aux ADN polymérases et extrinsèques à celles-ci1. Les nucléases peuvent agir soit en dégradant séquentiellement l’ADN des extrémités libres (exonucléases), soit en clivant les liaisons phosphodiester internes au sein d’une molécule d’ADN plus longue (endonucléases). La perte d’activité des nucléases peut entraîner des phénotypes d’instabilité du génome très spécifiques. Alors que la mutation du membre de la famille des hélicases RecQ BLM entraîne des taux excessivement élevés d’échange de chromatides sœurs et des taux de cancer globalement élevés (examiné par Payne et Hickson2), la mutation de la protéine WRN hautement apparentée conduit à un vieillissement prématuré3 ; la différence significative majeure entre ces deux membres de la famille est la présence d'un domaine d'exonucléase 3'-5' avec dans WRN4. Les preuves d’un rôle critique de l’exonucléase WRN dans le maintien de la stabilité du génome se sont accumulées à partir de l’analyse des génotypes chez les patients atteints de WS5, ainsi que des études de mutation ponctuelle et de délétion dans des cellules humaines, étayées par des études cristallographiques du domaine isolé de l’exonucléase6. Cependant, la coopération et l'interaction entre l'activité exonucléase de WRN et son activité hélicase centrale7 rendent difficile de démêler la fonctionnalité de chacun et leurs contributions relatives à la stabilité du génome. Chez les plantes et les animaux à métazoaires inférieurs, l’activité de l’exonucléase WRN est présente sur un seul polypeptide dépourvu d’activité hélicase8-10 (examiné dans Cox et Boubriak11) ; il a été démontré biochimiquement chez Arabidopsis que cette exonucléase agit de manière coordonnée avec l’hélicase WRN apparentée, reconstituant efficacement les activités enzymatiques combinées observées chez les vertébrés WRN9. Nous avons étudié l’exonucléase WRN chez la drosophile car les excellents outils génétiques permettent d’analyser l’impact de la mutation de l’exonucléase (sans impact sur l’hélicase apparentée présumée) au niveau de l’organisme entier et tout au long du développement10,12. De plus, nous avons cloné, exprimé et purifié l’exonucléase recombinante de Drosophila WRN (DmWRNexo) permettant une analyse biochimique complète de ses propriétés enzymatiques13,14.
L’analyse in vitro des nucléotides a traditionnellement été réalisée à l’aide d’oligonucléotides radiomarqués, évaluant la dégradation en recherchant une échelonnement des produits sur des gels d’acrylamide4,8,15. Bien que sensibles, ces tests ne sont pas quantitativement reproductibles au jour le jour en raison de la désintégration radioactive des substrats marqués. De plus, la manipulation et l’élimination des réactifs radioactifs posent d’importants problèmes environnementaux et sanitaires. L’approvisionnement en radiolabel devient également de plus en plus problématique. Une autre méthode récente consiste à évaluer la quantité de produit final de dégradation par spectrométrie de masse16. Cependant, cela prend du temps (cela prend plusieurs jours), nécessite un équipement spécialisé, et la lecture est la quantité de produit final (nucléotide unique) et ne convient donc pas à la mesure sensible d’aspects tels que la processivité enzymatique ou pour déterminer si certains nucléotides, séquences ou modifications entraînent une pause ou un arrêt des nucléases. Pour surmonter ces problèmes, nous avons adapté les tests traditionnels à base de gel pour une utilisation avec des substrats d’oligonucléotides fluorescents, générant des substrats marqués de manière stable qui peuvent être utilisés de manière reproductible sur de longues périodes de temps et permettent ainsi une comparaison directe des activités des nucléases dans différentes conditions.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>Réactif/Matériel</fort></td></tr><tr><td>Oligonucléotides personnalisés</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Il est nécessaire d’obtenir ces derniers à haute pureté par exemple avec purification PAGE.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluorescéine-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>bulle</td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td> % 19:1 Solution d’acrylamide</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>ATTENTION : neurotoxine puissante, il faut donc porter des gants en tout temps</td></tr><tr><td>Colonnes His-Trap (1 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Tous les autres réactifs</td><td>de tout fournisseur</td><td></td> réputé <td>Une qualité de biologie moléculaire est nécessaire (sans DNase) ; de même, les tubes à microfuge doivent être exempts de DNase et de RNase</td></tr><td colspan="4">EquipmentHoefer SE400 appareil de gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (phosphore et fluorescence <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> imageur)</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Reader V2.02</td><td>Jauge</td> d’image FujiFilm <td></td><td></td></tr><tr><td>V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un exonuclease analyse basée sur la fluorescence pour caractériser dmwrnexo, orthologue humain progéroïde wrn exonuclease, et son application à d&#39;autres nucléases

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN L’exonucléase est impliquée dans la résolution des dommages à l’ADN qui se produisent soit lors de la réplication de l’ADN, soit à la suite d’une exposition à des génotoxines endogènes ou exogènes. Il est probable qu’il jouera un rôle dans la prévention de l’accumulation d’intermédiaires recombinogènes qui s’accumuleraient autrement au niveau des fourches de réplication transitoirement bloquées, ce qui correspond à un phénotype hyper-recombinant de cellules dépourvues de WRN. Chez l’homme, le domaine de l’exonucléase comprend une partie N-terminale d’une protéine beaucoup plus grande qui possède également une activité hélicase, ainsi que des sites supplémentaires importants pour l’interaction entre l’ADN et les protéines. En revanche, chez la drosophile, l’activité exonucléase de WRN (DmWRNexo) est codée par un locus génétique distinct de l’hélicase présumée, permettant une dissection biochimique (et génétique) du rôle de l’activité de l’exonucléase dans les mécanismes de stabilité du génome. Ici, nous démontrons une méthode fluorescente pour déterminer l’activité des exonucléases WRN à l’aide de DmWRNexo recombinant purifié et d’oligonucléotides fluorescents marqués en bout. Ce système permet une plus grande reproductibilité que les tests radioactifs, car les oligonucléotides du substrat restent stables pendant des mois, et fournit une méthode plus sûre et relativement rapide pour l’analyse détaillée de l’activité des nucléases, permettant de déterminer la polarité, la processivité et les préférences du substrat des nucléases.

L'analyse in vitro de l'activité exonucléase nécessite plusieurs étapes préparatoires en plus de l'analyse proprement dite. Un aperçu des procédures est présenté dans la Figure 1.
Avant de réaliser des dosages d'exonucléase basés sur la fluorescence, il est essentiel d'optimiser la détection de l'oligonucléotide marqué par fluorescence après séparation sur gel d'acrylamide-urée, à l'aide d'un système d'imagerie fluorescent approprié. Le choix du filtre est particulièr...

Les exonucléases jouent un rôle essentiel pour assurer la stabilité du génome. La perte de la fonction de l’exonucléase WRN entraîne un vieillissement prématuré. L’étude des substrats et d’autres exigences de la nucléase in vitro peut aider à élucider son rôle in vivo. Ici, nous démontrons un test rapide et reproductible basé sur la fluorescence pour mesurer son activité nucléase.

Un Exonuclease analyse basée sur la fluorescence pour caractériser DmWRNexo, orthologue humain progéroïde WRN Exonuclease, et son application à d&#39;autres nucléases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Cette expérience utilise un dosage reproductible et robuste basé sur la fluorescence afin de déterminer l'activité exonucléase. Incubez l'enzyme purifiée avec le substrat ADN marqué par fluorescence pour permettre à l'enzyme de dégrader l'ADN de manière séquentielle. Ensuite, séparez l'ADN sur un gel d'acrylamide urée afin de fractionner les produits de dégradation selon leur taille.Ensuite, utilisez l'imagerie par fluorescence pour identifier et quantifier l'ampleur de l'activité exonucléase. Les résultats analysés permettent de déterminer les conditions de réaction préférentielles du substrat, ainsi que l'activité processive et globale de l'enzyme. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes basées sur la radioactivité réside dans la stabilité prolongée des substrats d'ADN, ce qui permet une excellente reproductibilité, une réduction des coûts et une sécurité accrue.Commencez par ajuster le lysat bactérien à 20 millimolaire en ole, en utilisant un volume approprié d'une solution mère d'ole à deux molaire. Ajustez ensuite le volume à au moins un millilitre à l'aide de la solution de lavage à 20 millimolaire en ole, une colonne hist trap d'un millilitre avec 10 millilitres d'eau milli Q. Équilibrez ensuite la colonne avec 10 millilitres de solution à 20 millimolaire en ole.Ensuite, chargez le lysat sur la colonne. Lors du chargement du lysat sur la colonne, une pression arrière importante peut être observée. Ceci est tout à fait normal. N'essayez pas d'appliquer une force excessive à la seringue et maintenez une pression constante et régulière.Il est courant d'observer une légère modification de couleur lorsque le lysat pénètre dans la colonne. Recueillir l'écoulement dans un flacon stérile de type bijou d'une capacité de sept millilitres et le conserver sur de la glace. Ensuite, laver la colonne avec 10 millilitres d'émite ole à 20 millimolaire.Verse maintenant cinq millilitres de 40 millimolaire d’iole à travers la colonne. Surveille attentivement le piston de la seringue pour mesurer les fractions d’un millilitre recueillies dans chacun des tubes microfuge. De manière similaire et séquentielle, fais passer cinq millilitres de chaque concentration d’iole et recueille à chaque fois cinq fractions d’un millilitre.Analyser les fractions par immunotransfert en point et détection à l’aide d’un anticorps anti-his conjugué à la peroxydase. Identifier les fractions correspondant au pic. Maintenir tous les réactifs à quatre degrés Celsius, aliquoter le mélange maître dans des tubes microfuge stériles de 0,5 millilitre exempts d’ADN, et inclure également un témoin sans enzyme afin de visualiser le substrat initial.Réglez maintenant un bloc chauffant à la température appropriée pour l'activité enzymatique. Préparez un IDE contenant la solution d'arrêt et conservez-le à température ambiante. Organisez l'espace de travail près du bloc chauffant, y compris les réactifs finaux à ajouter à la réaction.Utilisez un pipeteur de un à dix microlitres avec des embouts, un minuteur, un support cryogénique ou un bac à glace, ainsi que la solution d’arrêt. Démarrez le minuteur dès l’ajout de l’enzyme dans le premier tube et placez ce tube dans le bloc chauffant. Continuez à ajouter l’enzyme dans les autres tubes à des intervalles de 15 secondes, en plaçant chaque tube dans le bloc chauffant au moment où le minuteur indique l’heure prévue.Ajouter 10 microlitres de solution d'arrêt au premier échantillon et mélanger par pipetage. Placer immédiatement sur de la glace. Continuer à interrompre les réactions aux intervalles de temps appropriés et dans le même ordre que celui dans lequel elles ont été initiées, afin que chaque réaction ait exactement le même temps d'incubation. Charger la moitié ou la totalité de chaque échantillon sur un gel d'acrylamide. Ajouter une fois la solution d'arrêt contenant un colorant dans une ou plusieurs pistes pour vérifier le bon fonctionnement du gel.Après l'électrophorèse, retirez les entretoises et une plaque de gel. Rincez et essuyez soigneusement la plaque de gel afin d'éliminer les traces d'urée précipitée. Placez la plaque, côté gel vers le bas, sur l'espace en verre du support de gel et insérez-la dans l'imager si nécessaire.Notez les coordonnées du gel sur la plaque de verre. Ouvrez le logiciel approprié et numérisez la région notée de la zone de numérisation en utilisant les conditions décrites dans le protocole. Recadrez l'image et compressez les données.Si nécessaire, enregistrez puis exportez sous forme de fichier pour l'analyse. La réalisation d'une analyse in vitro de l'activité exonucléase nécessite plusieurs étapes préparatoires. En complément de l'analyse proprement dite pour ces dosages exonucléase basés sur la fluorescence, il est essentiel d'optimiser la détection du système d'imagerie de fluorescence.Par exemple, un substrat oligonucléotidique marqué par la fluorescéine nécessite un filtre permettant une excitation à 470 nanomètres et une émission à 520 nanomètres. En utilisant ce filtre, il est possible d'augmenter la capacité de détection de faibles concentrations de substrat ou de produit en ajustant à la fois la sensibilité et la résolution de l'appareil d'imagerie. Notez qu'il existe une certaine tolérance en ce qui concerne la largeur de bande du filtre.Le fait d'utiliser un filtre sous-optimal permet tout de même une détection partielle du substrat, bien que la sensibilité soit alors nettement réduite. Une combinaison appropriée de la concentration en oligonucléotide marqué et des paramètres de l'appareil d'imagerie peut permettre une détection robuste du substrat. Ceci est important car les produits de dégradation, après incubation avec une exonucléase active, seront présents en quantités moindres dans chaque bande, le substrat ayant été fragmenté de manière séquentielle.Un dosage d'exonucléase réussi entraînera une dégradation du substrat de manière séquentielle en direction de la flore. Quatre, produisant un profil en échelle caractéristique de l'ADN sur le gel, représentatif de la dégradation par exonucléase. Une fois optimisé pour la détection, ce dosage peut être utilisé pour détecter des activités différentielles de façon qualitative aussi bien que quantitative.Par exemple, la présence ou l'absence d'activité peut être déterminée pour des mutants de nucléase par rapport à la protéine de type sauvage. Différents substrats peuvent également être testés quant à leur capacité à être dégradés par la nucléase. En cours d'étude.Cet essai in vitro peut être utilisé pour tester la spécificité du substrat et le mécanisme d'une nucléase d'intérêt.

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Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

Nous présentons des protocoles pour l’évaluation de la compétence de la voie de réparation des cassures double brin dans les cellules à l’aide d’une série de substrats rapporteurs extrachromosomiques basés sur la luminescence.

Évaluation de l’activité de réparation des cassures double brin de l’ADN à l’aide de dosages rapporteurs à haut débit et quantitatifs basés sur la luminescence

Cette étude présente un test FRET ratiométrique simple et convivial pour la détection et l’évaluation quantitative de l’activité de la DNase, et démontre son application dans l’analyse d’une nucléase faible.

Évaluation de l’activité de la DNase par transfert d’énergie de résonance de fluorescence ratiométrique

Ce protocole décrit un test biochimique par déplacement de gel pour mesurer l’activité de FEN1 (Flap Endonuclease 1) et le développement d’inhibiteurs.

Détection par fluorescence de l’activité des nucléases FEN1 et criblage d’inhibiteurs de petites molécules

Découvrez un test d'exonuclease basé sur la fluorescence pour caractériser l'activité enzymatique de DmWRNexo et étudier la stabilité du génome. Cette méthode reproduisible offre une alternative sûre aux techniques radioactives.

Un Exonuclease analyse basée sur la fluorescence pour caractériser DmWRNexo, orthologue humain progéroïde WRN Exonuclease, et son application à dautres nucléases (Vidéo) | JoVE Journal

Un Exonuclease analyse basée sur la fluorescence pour caractériser DmWRNexo, orthologue humain progéroïde WRN Exonuclease, et son application à d'autres nucléases

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