Multiplexé fluorescent puce à ADN pour salivaire humaine analyse des protéines en utilisant un polymère microsphères et faisceaux de fibres optiques

L'objectif général de cette procédure est d'analyser plusieurs protéines présentes dans des échantillons de salive humaine à l'aide de réseaux fluorescents basés sur des microsphères. Commencez par coder les microsphères avec différentes quantités de deux colorants fluorescents. Fixez ensuite les anticorps de capture spécifiques à différentes protéines sur les microsphères codées.

Ensuite, assemblez le puces protéiques multiplexées sur le faisceau de fibres optiques en utilisant les immunodosages sandwich sur les puces microstructurées assemblées afin de détecter plusieurs protéines dans les échantillons de salive testés. En fin de compte, l'analyse par microscopie de fluorescence peut mesurer les réponses de signal provenant de différentes protéines présentes dans les échantillons de salive. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le ELISA réside dans sa capacité à analyser simultanément plusieurs protéines dans des biofluides complexes.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'analyse de la salive humaine, elle peut également être appliquée à d'autres fluides biologiques tels que le sérum, l'urine et le crachat. Pesez la TTA d'opium dans un flacon en verre ambré et préparez une solution mère de 200 millimolaire dans du tétrahydrofuranne. Mélangez délicatement à l'aide d'une pipette et vérifiez visuellement que le colorant est complètement dissous.

De la même manière, préparez une solution mère à 12 millimolaire de Coumarin 30 en mélangeant délicatement à l’aide d’une pipette. Vérifiez visuellement que le D est complètement dissous, vortexez la suspension de microsphères, puis transférez 60 microlitres dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Pour laver les microsphères, ajoutez 600 microlitres de PBS et mélangez en pipetant 20 fois, puis centrifugez à 10 000 tr/min pendant trois minutes.

Après trois lavages avec une solution de tétrahydrofuranne, éliminer le surnageant, resuspendre le culot dans 600 microlitres de solution de travail, puis transférer le mélange dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Sceller le tube microcentrifuge avec du film parafilm et le placer sur un agitateur. Le protéger de la lumière en le recouvrant de papier d'aluminium.

Ajouter 200 microlitres de suspension de microsphères codées dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre avec bouchon de sécurité. Ajouter ensuite, goutte à goutte, 150 microlitres d'une solution EDC fraîchement préparée. Ajouter immédiatement 150 microlitres de solution sulfa NHS. Mélanger soigneusement par pipetage et vérifier que la suspension est homogène.

Fermez le tube, scellez-le avec du paraforme et placez-le sur un agitateur. Protégez-le de la lumière en le recouvrant de papier d’aluminium. Après trois lavages avec la réutilisation du tampon P-B-S-S-D-S, resuspendez le culot dans 200 microlitres de mélange tampon P-B-S-S-D-S.

Transférez ensuite la solution dans 300 microlitres de tampon P-B-S-S-D-S contenant 60 microgrammes d'anticorps de capture. Mélangez 50 microlitres de chaque type de microsphères de capture de protéines dans un nouveau tube microcentrifuge stérilisable à l'autoclave. Centrifugez le pool de microsphères stock à 7 000 tr/min pendant trois minutes et éliminez tout le surnageant sauf 100 microlitres.

À présent, découpez manuellement des faisceaux de fibres optiques à environ cinq centimètres de longueur, puis polites successivement les deux extrémités à l’aide de films de polissage au diamant. Ensuite, plongez le faisceau poli dans de l’eau déionisée pendant deux minutes en utilisant un bain ultrasonique. Pour éliminer toute particule, placez une petite barre d’agitation magnétique dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 millilitre.

Ajouter 400 microlitres de tampon PBS sans protéine et agiter sur une plaque agitatrice magnétique pendant 30 minutes. Pour éliminer les bulles d'air, attaquer une extrémité du faisceau de fibres poli dans une solution d'acide chlorhydrique 0,025 N pendant 150 secondes. Plonger immédiatement et sonifier le N gravé dans de l'eau déionisée pendant une minute.

Ensuite, séchez les faisceaux de fibres à l'air comprimé, montez le faisceau de fibres sur un support pour fibre et immergez l'extrémité gravée dans un tampon PBS exempt de bulles et de protéines pendant une heure. Déposez un volume d'un microlitre de la suspension de microsphères stockée sur l'extrémité gravée du faisceau de fibres optiques. Protégez le dispositif de la lumière à l'aide d'une boîte recouverte de papier d'aluminium. Après 15 minutes, le volume de la suspension diminue par évaporation, ce qui pousse les microsphères dans les microcavités gravées.

Utilisez un écouvillon saturé de solution échantillon pour éliminer les microsphères qui ne sont pas piégées dans les micropuits. Pour préparer le microréseau de protéines à l'emploi, ajoutez 200 microlitres de solution échantillon dans un tube de microcentrifugeuse stérilisable de 0,5 millilitre. Immergez le microréseau de protéines fixé sur la fibre dans la solution et placez-le sur un agitateur.

Protéger de la lumière en recouvrant d'une feuille d'aluminium. Ensuite, plonger la puces à protéines dans un nouveau tube microcentrifugeuse stérilisé contenant 200 microlitres de tampon de lavage et agiter à 600 tr/min pendant deux minutes. Incuber ensuite la puces à protéines dans une solution de 100 microlitres d'un cocktail d'anticorps de détection contenant des anticorps de détection biotinylés et un tampon de blocage PBS A pendant 30 minutes.

À température ambiante et à l'abri de la lumière, nettoyez l'extrémité distale du faisceau de fibres avec un coton-tige imbibé d'éthanol absolu. Ensuite, séchez les deux extrémités de la fibre à l'aide d'air comprimé, montez la fibre sur un microscope épifluorescent et imagez à travers l'extrémité distale de la fibre, puis acquérez les images des microsphères correspondant aux intensités d'émission fluorescente de l'opium TTAC 30 et du SAP. Les images de codage des sept types de microsphères sont présentées ici.

Deux niveaux d'intensité sont observés sur l'image de codage UTTA, qui représentent des microsphères marquées avec différentes quantités de colorant UTTA. Des résultats similaires sont observés sur l'image de codage C 30. L'analyse d'image avec MATLAB permet de calculer les intensités de fluorescence des différentes microsphères sur l'image du signal. Les résultats du décodage sont présentés à la figure 2D sept.

Différentes microsphères sont correctement décodées. Les microsphères ne montrent aucune réponse lorsqu'elles sont incubées avec un tampon de dosage. Lorsqu'elles sont incubées avec des échantillons de salive humaine, des réponses fluorescentes significatives sont observées.

Pour une meilleure comparaison, les contrastes de ces deux figures ont été ajustés au même niveau. Une fois maîtrisée, cette méthode permet une analyse reproductible de différentes protéines dans des échantillons de salive humaine. Les résultats de trois détections indépendantes sur le même échantillon sont présentés.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d'une puces multiplexe de protéines basée sur des microsphères et de son utilisation pour l'analyse de fluides biologiques complexes. En suivant cette procédure, d'autres biomarqueurs protéiques présents dans différents fluides biologiques complexes peuvent également être analysés.