Multiplexé fluorescent puce à ADN pour salivaire humaine analyse des protéines en utilisant un polymère microsphères et faisceaux de fibres optiques
October 10th, 2013
Nous décrivons une procédure pour le profilage de protéines salivaires utilisant multiplexés puces à anticorps à base de microsphères. Les anticorps monoclonaux ont été liés par covalence à 4,5 um microsphères de polymère de colorants fluorescents codé en utilisant la chimie du carbodiimide. Les microsphères modifiées ont été déposés dans des micropuits à fibres optiques pour mesurer les niveaux de protéine dans la salive en utilisant des dosages immunologiques par fluorescence en sandwich.
L’objectif global de cette procédure est d’analyser plusieurs protéines dans des échantillons de salive humaine à l’aide de réseaux fluorescents à base de microsphères. Tout d’abord, encodez les microsphères avec différentes quantités de deux colorants fluorescents. Couplez les anticorps de capture de différentes protéines sur les microsphères codées.
Ensuite, assemblez la micropuce à protéines multiplexée sur le faisceau de fibres optiques à l’aide des immunodosages sandwich sur les microréseaux assemblés pour le test de protéines multiples dans les échantillons de salive testés. En fin de compte, l’analyse par microscopie à fluorescence peut mesurer les réponses signaux de différentes protéines dans les échantillons de salive. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme celle d’Eliza est qu’elle permet l’analyse simultanée de plusieurs protéines dans des biofluides complexes.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’analyse de la salive humaine, elle peut également être appliquée à d’autres biogrippes telles que l’urine sérique et les expectorations. Pesez l’opium TTA dans un flacon en verre ambré et préparez une solution mère de 200 millimolaires dans de la tétra-hydro-furine. Mélangez doucement par pipetage et vérifiez visuellement que le colorant est complètement dissous.
De même, préparez une solution mère de 12 millimolaires de Coumarine 30 mélangée doucement par pipetage. Visuellement. Vérifiez que le D est complètement dissous dans une suspension de vortex à microsphère, puis transférez 60 microlitres dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Pour laver les microsphères, ajoutez 600 microlitres de PBS mélangés par pipetage 20 fois et centrifugez à 10 000 tr/min pendant trois minutes.
Après trois lavages avec une solution de tétra-hydrofurine, retirez le surnageant, remettez le palais en suspension dans 600 microlitres de solution de travail et transférez le mélange dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Fermez le tube de micro-centrifugeuse avec un film para et placez-le sur un agitateur. Protégez-le de la lumière en le recouvrant de papier d’aluminium.
Ajoutez 200 microlitres de suspension de microsphères codées dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre à verrou de sécurité. Ajoutez 150 microlitres de solution EDC fraîchement préparée. Ajoutez immédiatement 150 microlitres de solution NHS de sulfamides. Bien mélanger par pipetage et vérifier que la suspension est homogène.
Boucher le tube, le sceller avec du paraform et le placer sur un shaker. Protégez-le de la lumière en le recouvrant de papier d’aluminium. Après trois lavages de tampon P-B-S-S-D-S, suspendre le granulé dans 200 microlitres de mélanges tampons P-B-S-S-D-S.
Ensuite, transférez la solution dans 300 microlitres de tampon P-B-S-S-D-S contenant 60 microgrammes d’anticorps de capture. Mélangez 50 microlitres de chaque type de microsphères de capture de protéines dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse d’autoclave. Centrifugez le bassin de microsphères à 7 000 tr/min pendant trois minutes et retirez tous les microlitres de surnageant, sauf 100
.Maintenant, coupez à la main des faisceaux de fibres optiques d’environ cinq centimètres de longueur, polissez séquentiellement les deux extrémités à l’aide de films de rodage diamantés. Ensuite, sonicez le faisceau poli dans de l’eau déminéralisée pendant deux minutes. Pour éliminer toutes les particules, placez une petite barre d’agitation magnétique dans un microtube à centrifuger de 0,5 millilitre.
Ajoutez 400 microlitres de tampon PBS sans protéines et remuez sur une plaque d’agitation magnétique pendant 30 minutes. Pour éliminer les bulles d’air, gravez une extrémité du faisceau de fibres polies dans une solution normale de chlorure d’hydrogène 0,025 pendant 150 secondes. Immergez immédiatement et sonifiez l’azote gravé dans de l’eau déminéralisée pendant une minute.
Ensuite, séchez les faisceaux de fibres avec de l’air comprimé, montez le faisceau de fibres sur un support de fibre et bloquez l’extrémité gravée dans le tampon PBS sans protéines sans bulles pendant une heure, déposez un quad ALI d’un microlitre de la suspension de microsphère stockée sur l’extrémité gravée du faisceau de fibres optiques. Protégez l’installation de la lumière avec une boîte enveloppée de papier d’aluminium. Après 15 minutes, le volume de la suspension diminuera par évaporation et forcera les microsphères dans les micro-puits gravés.
Utilisez un écouvillon saturé de solution d’échantillon pour éliminer les microsphères qui ne sont pas piégées dans les micro-puits. Pour que la puce à protéines soit prête à l’emploi, ajoutez 200 microlitres de solution d’échantillon dans un tube de micro-centrifugeuse autoclave de 0,5 millilitre. Trempez la puce à protéines chargée sur la fibre dans la solution et placez-la sur un agitateur.
Protégez-vous de la lumière en recouvrant de papier d’aluminium. Ensuite, trempez la puce à protéines dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse d’autoclave contenant 200 microlitres de tampon de lavage et secouez à 600 tr/min pendant deux minutes. Maintenant, incubez la puce dans une solution de 100 microlitres d’un cocktail d’anticorps de détection contenant des anticorps de détection biotinylés et un tampon bloquant le PBS pendant 30 minutes.
À température ambiante dans l’obscurité, nettoyez l’extrémité distale du faisceau de fibres avec un écouvillon saturé d’éthanol absolu. Ensuite, séchez les deux extrémités de la fibre avec de l’air comprimé, montez la fibre sur un microscope épi-fluorescent et imagez à travers l’extrémité distale de la fibre, acquérez les images de microsphères correspondant aux intensités d’émissions fluorescentes de l’opium, TTAC 30 et SAP. Les images d’encodage de sept types de microsphères sont présentées ici.
Deux niveaux d’intensité sont observés dans l’image d’encodage UTTA, qui représentent des microsphères encodées avec différentes quantités de matrice UTTA. Des résultats similaires sont observés dans l’image d’encodage C 30. L’analyse d’images MATLAB permet de calculer les intensités de fluorescence de différentes microsphères dans l’image du signal. Les résultats du décodage sont illustrés à la figure 2D sept.
Différentes microsphères sont décodées avec succès. Les microsphères ne montrent aucune réponse lorsqu’elles sont incubées avec un tampon de dosage. Lorsqu’il est incubé avec des échantillons de salive humaine, des réponses fluorescentes significatives sont observées.
Pour une meilleure comparaison, les contrastes de ces deux figures ont été ajustés au même niveau. Une fois maîtrisée, cette méthode permet d’analyser de manière reproductible différentes protéines dans les échantillons de salive humaine. Les résultats de trois détections indépendantes sur le même échantillon sont présentés.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’une microradiographie protéique multiplex basée sur une microsphère et de son utilisation pour l’analyse complexe de biofluides. En suivant cette procédure. D’autres biomarqueurs protéiques dans différents biofluides complexes peuvent également être analysés.
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Aperçu
Cet article décrit une procédure pour le profilage des protéines salivaires en utilisant des réseaux d'anticorps multiplexés basés sur des microsphères. La méthode permet l'analyse simultanée de plusieurs protéines dans des échantillons de salive humaine, améliorant les capacités des tests traditionnels.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Biotechnologie
- Protéomique
Contexte
- La salive contient une variété de protéines qui peuvent fournir des informations sur la santé et la maladie.
- Les méthodes traditionnelles comme l'ELISA sont limitées à l'analyse d'une protéine à la fois.
- Les tests multiplexés peuvent améliorer l'efficacité et la richesse des données.
- La technologie des microsphères fluorescentes offre une approche nouvelle pour la détection des protéines.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour analyser plusieurs protéines dans la salive simultanément.
- Améliorer la sensibilité et la spécificité de la détection des protéines dans les biofluides complexes.
- Fournir une alternative plus efficace aux tests à analyte unique existants.
Méthodes utilisées
- Codage des microsphères avec des colorants fluorescents.
- Liaison covalente d'anticorps de capture aux microsphères.
- Assemblage de réseaux de protéines multiplexés sur des faisceaux de fibres optiques.
- Utilisation de dosages immunologiques sandwich fluorescents pour détecter les protéines dans les échantillons de salive.
Résultats principaux
- La méthode a réussi à détecter plusieurs protéines dans les échantillons de salive.
- La microscopie à fluorescence a fourni des réponses de signal claires pour différentes protéines.
- La technique a démontré des avantages par rapport aux méthodes ELISA traditionnelles.
- Les résultats indiquent des applications potentielles dans le diagnostic clinique.
Conclusions
- Cette approche multiplexée permet une analyse efficace des protéines salivaires.
- La méthode pourrait faciliter une meilleure compréhension de diverses conditions de santé.
- Des études futures pourraient étendre l'application de cette technique à d'autres biofluides.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
