Dithranol en tant que matrice pour Matrix Assisted Laser Désorption / Ionisation imagerie sur une transformée de Fourier Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Cette procédure localise spatialement plusieurs lipides endogènes au sein d'un cristallin de bovin. En utilisant la technique d’ionisation par désorption laser assistée par matrice, l’imagerie par spectrométrie de masse. Tout d'abord, préparez une mince coupe de tissu de cristallin de bovin et appliquez une matrice multiple, puis acquérez un jeu de données spectral de masse maldi.

Traitez le jeu de données pour en obtenir une représentation visuelle des lipides détectés sur la section de tissu de lentille. Ces résultats permettent conjointement de déterminer la localisation et l'abondance relative des lipides au sein d'une lentille de bovin et de produire une représentation visuelle de cette distribution. Contrairement à d'autres méthodes telles que l'extraction des lipides suivie d'une analyse par LC-MS, l'imagerie par spectrométrie de masse MALDI permet de visualiser simultanément plusieurs lipides sans perdre leur localisation spatiale. Retirez les échantillons de tissu congelés à la volée du stockage à moins 80 degrés Celsius.

Retirez la capsule de la surface de l'œil pour fixer une section complète de lentille de veau. Déposez une ou deux gouttes d'eau sur le plateau de coupe tissulaire d'un cryostat. Placez rapidement la lentille dans l'eau avant qu'elle ne se solidifie, une fois que le cryostat a atteint la température optimale.

Découper le tissu en sections de 20 microns d'épaisseur selon un plan équatorial. Jeter les premières sections de tissu et n'utiliser que les tranches proches du plan équatorial ou l'intersectant pour l'imagerie du tissu du cristallin oculaire. Ajouter 1,5 microlitre d'acide formique pour humidifier préalablement la surface d'une lame en verre revêtue d'ITO.

Transférez ensuite délicatement les sections de tissu sur la lame à l'intérieur du cryostat. Puis, lyophilisez les lames pendant 15 minutes avant l'application de la matrice MALDI. À l'aide d'un stylo correcteur, ajoutez trois marques de repérage sur la surface non conductrice de la lame en verre revêtue d'ITO.

Prenez maintenant une image optique de la lame de tissu à l’aide d’un scanner à plat et enregistrez-la dans un format approprié tel que TIFF ou JPEG. Commencez par recouvrir les bords de la surface avant des lames en verre recouvertes d’ITO avec du ruban adhésif afin que la matrice n’imprègne pas les bords de la lame. Préparez la matrice à utiliser dans un solvant approprié.

Appliquez ensuite des solutions de matrice sur les surfaces des coupes tissulaires. Recouvrez la lame de verre en effectuant 20 cycles d'application de la matrice. Alternativement, un pulvérisateur assisté par air comprimé peut être utilisé pour appliquer les matrices si un solvant est incompatible avec le pulvérisateur électronique de matrice.

Pour la solution d'étalonnage de masse, diluez la solution standard du mélange d'étalonnage ES d'un facteur de un à 200 dans du 60 % d'isopropanol. Introduisez deux microlitres par minute de la solution diluée du mélange d'étalonnage ES dans la source d'ions électrospray en mode double sur l'appareil pour une spectrométrie de résonance cyclotronique à transformée de Fourier. Faites fonctionner l'appareil F-T-I-C-R en mode ions positifs ESI avec détection large bande et une taille d'acquisition de données de 1024 kilo-octets par seconde. Réglez généralement les paramètres ESI à 3 900 volts pour la tension électrospray du capillaire.

Un voltage de protection du pulvérisateur de 3 600 volts, un débit de gaz azote nébuliseur de deux litres par minute. Débit de gaz azote sec de quatre litres par minute et température de 200 degrés Celsius. Réglez également le voltage du premier déflecteur à 15 volts.

Durée de vol à 0,01 seconde, débit de gaz d’argon de collision à 0,4 litre par seconde, temps d’accumulation des ions à la source à 0,1 seconde et temps d’accumulation des ions dans la cellule de collision à 0,2 seconde. Réglez ensuite les paramètres de fonctionnement du F-T-I-C-R afin de maximiser la sensibilité analytique sur la gamme de masse de rapport masse/charge de 200 à 1400, tout en maintenant de bons signaux temporels de désintégration par induction libre. Ensuite, enregistrez les spectres de masse ESI et étalonnez l’appareil à l’aide des masses de référence des composés standards contenus dans la solution de réglage E es.

Pour régler l'instrument en vue d'une utilisation en MALDI, dissolvez plusieurs aliquots d'un microlitre d'une solution étalon mixte de turine et d'INE dans la solution matrice à une concentration de un micromolaire chacun, puis déposez ces solutions directement sur l'une des sections d'échantillon de tissu. Placez la lame dans un adaptateur pour lame de tissu et insérez l'adaptateur par le côté MALDI dans la source ionique double ESI-MALDI. Ensuite, optimisez les paramètres de fonctionnement MALDI appropriés concernant la puissance du laser et le nombre d'impulsions laser nécessaires à l'accumulation du signal MALDI pour chaque balayage de masse.

Après avoir réglé, étalonné et optimisé l'instrument pour les expériences de MSI MALDI, alignez la position physique d'une coupe de tissu à imager avec son image optique enregistrée dans le logiciel d'imagerie. Alignez les trois marques de correcteur en utilisant une méthode de triangulation à trois points. Ensuite, commencez une opération MALDI ESI simultanée afin que chaque spectre de masse contienne les pics de masse de référence de la solution d'étalonnage E ES pour l'étalonnage interne de la masse après l'acquisition.

Atténuez d'abord le signal ESI en réduisant la tension du capillaire jusqu'à ce que les signaux MALDI dominent les spectres, tout en maintenant les signaux de calibration de masse ESI suffisamment élevés pour l'étalonnage interne. Ensuite, configurez une méthode automatisée de balayage du laser de radiation. Utilisez une analyse aléatoire par points.

Définissez les régions tissulaires à imager et réglez la taille appropriée du pas RA du laser. Étalonner les spectres de masse MALDI à l’aide d’un étalonnage interne pour la comparaison initiale, sélectionnez les pics pour la désisotopisation en MS/MS et identifiez les pics monoisotopiques à l’aide d’un script VBA personnalisé, puis exportez les listes de pics monoisotopiques obtenues. Saisissez les valeurs mesurées des rapports masse/charge dans les bases de données métabolomiques Melin nine ou HMDB pour une correspondance de masse avec les entrées de la bibliothèque.

Ensuite, générer des images MALDI pour toutes les entités lipidiques détectées sur toute la section tissulaire à l'aide d'un logiciel d'imagerie avec une largeur de filtre de masse de une partie par million au sommet du pic. Une fois les images générées pour toutes les valeurs du rapport masse/charge correspondant aux entrées de la base de données, générer également des images pour tous les autres pics afin de rechercher des profils de distribution uniques pouvant être étudiés ultérieurement pour certains tissus spécifiques, tels que le cristallin de bovin. Des déchirures importantes du tissu sont souvent observées lorsqu'un montage par décongélation directe est utilisé.

Le prétraitement de la lame IT OAS avec de l'éthanol ou de l'acide formique contribue à préserver l'intégrité des coupes tissulaires pendant le montage du tissu. Le choix de la matrice et celui du solvant sont des facteurs importants influant sur la qualité des spectres MALDI. Ces exemples comparent un spectre obtenu avec un solvant de matrice efficace à un mauvais choix de solvant de matrice pour le diol.

Une fois l'ensemble des spectres de masse provenant d'une expérience de MSI Maldi acquis, l'image de chacun des ions détectés peut être générée. Chaque pixel représente un point d'irradiation laser provenant de la surface d'une section de tissu. Les concentrations relatives des analytes peuvent être précisées dans les différentes parties de la section de tissu.

Dans la plupart des expériences, les données sont normalisées par rapport au courant ionique total au sein de chaque spectre. En l'absence de cette normalisation, des zones présentant une meilleure matrice analyte, comme la cristallisation du COC, pourraient produire des signaux plus intenses pour les analytes, ce qui fausserait les données. La préparation des tissus peut également modifier considérablement l'image générée.

Si l'échantillon est trop humide, les analytes vont se délocaliser sur le tissu et une grande partie de l'information spatiale sera perdue. Cette démonstration d'une expérience d'imagerie tissulaire sur le cristallin oculaire a utilisé le diol comme matrice multiple pour déterminer la distribution spatiale des lipides par SMCI-FT. L'imagerie des lipides dans différents types de tissus peut être réalisée à l'aide du diol ou d'une autre matrice de manière similaire.