Name: Dithranol en tant que matrice pour Matrix Assisted Laser Désorption / Ionisation imagerie sur une transformée de Fourier Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T19:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez l'imagerie MALDI avec dithranol pour localiser les lipides endogènes dans le tissu oculaire bovin. Cette méthode de spectrométrie de masse préserve l'information spatiale des lipides.

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Les auteurs tiennent à remercier Génome Canada et Génome Colombie-Britannique pour le financement de la plate-forme, et de soutien. Nous remercions également le Dr Carol E. Parker pour un examen critique du manuscrit et l&#39;édition assistance. CHL remercie également le Britannique protéomique réseau britannique de soutien.

Une. sectionnement des tissus <ol><li> Flash geler les spécimens d&#39;émission, une fois récoltés, en utilisant de l&#39;azote liquide, les expédier sur de la glace sèche (si l&#39;expédition est requise), et de les stocker à -80 ° C jusqu&#39;à ce que le sectionnement de tissu. (Si les échantillons commerciaux sont utilisés, veiller à ce que les échantillons sont préparés de cette manière.) </li><li> Couper les organes à une taille gérable pour s&#39;adapter à la cible MALDI. Coupez les parties non désirées de l&#39;organe. Pour cette étude décrit ici, les lentilles de veau bovins ont été décapsulés en utilisant une procédure décrite précédemment 35 avant découpe de tissu. </li><li> Retirer des organes entiers de -80 ° C congélateur et fixez-les sur une scène de coupe de tissu cryogénique. Pour fixer un objectif de veau, placer une ou deux gouttes d&#39;eau sur la scène d&#39;un cryostat tissu coupe. Placez rapidement la lentille dans l&#39;eau avant qu&#39;elle se solidifie. Sinon, la température de coupe optimale (OCT) composés peuvent également être utilisés pour fixer un tissu sur la scène de coupe. Si les composés de l&#39;OPO se servir, un minimal quantité d&#39;octobre doit être appliqué et il faut prendre soin de s&#39;assurer que les sections de tissu coupées ne sont pas contaminés par des composés octobre qui peut interférer avec l&#39;ionisation et la détection des analytes 5,36,37. </li><li> Laisser la température à l&#39;intérieur du cryostat à s&#39;équilibrer à 18 ° C. Les températures plus froides ou plus chaudes peuvent être utilisés pour les tissus plus doux ou plus durs, respectivement. Ensuite, couper le tissu équatoriale en 20 um tranches épaisses. Utilisez 10-15 um tranches épaisses pour la plupart des tissus, mais, en raison de la nature fragile du tissu de verre de bovins, 20 um tranches épaisses ont été utilisés. Pour le tissu de verre de bovin, jeter les premières sections de tissus et de n&#39;utiliser que des tranches qui sont proches ou au plan équatorial. </li><li> Si un tissu lentille oculaire est imagé, utiliser 1,5 ul d&#39;acide formique (98% de pureté, LC-MS grade) à pré-imbibé la surface d&#39;un oxyde d&#39;indium-étain (ITO) revêtu lame de verre. </li><li> Transférer délicatement les coupes de tissus à la surface de l&#39;ITO-coverre ATED lame de microscope à l&#39;intérieur du cryostat. La coupe de tissu se décongeler rapidement et deviendra hermétiquement fixé à la surface de glissement. Habituellement, des coupes de tissus multiples peuvent être montés sur une même lame d&#39;ITO revêtue de cette façon. </li><li> Lyophiliser la lame pendant 15 min avant l&#39;application de la matrice MALDI. </li><li> Pour le test de la matrice, dissoudre les matrices individuelles dans des solvants appropriés. Repérer manuellement 1 ul de chaque solution de matrice sur la coupe de tissu. De plus, repérer un standard d&#39;étalonnage de petite molécule sur le tissu pour la vérification de la sensibilité MALDI. </li><li> Ajouter trois points d&#39;enseignement de la lame de verre revêtue d&#39;ITO par écrit sur la surface non conductrice de la lame de verre revêtue d&#39;ITO avec un stylo correction fluide. Prendre une image optique de la lame de tissu à l&#39;aide d&#39;un scanner à plat et l&#39;enregistrer dans un format approprié comme tiff ou jpg. </li></ol> 2. Revêtement Matrix 2.1. Matrice revêtement automatisé <ol><li> Apsolutions de matrice de nappe, qui contiennent de l&#39;acétonitrile ou un mélange acétonitrile / eau comme solvant mixte, automatiquement à la surface des coupes de tissu en utilisant un Bruker ImagePrep ou une matrice électronique pulvérisateur similaire. </li><li> Couvrir les bords de la surface avant de la lame de verre revêtu d&#39;ITO avec un ruban de telle sorte que la matrice ne pas recouvrir les bords de la diapositive. Cela garantit que les marques d&#39;enseignement sur la surface opposée peuvent être utilisées pour l&#39;alignement de glissement des tissus. Ne pas recouvrir les bords de la glissière avec la matrice car ils sont utilisés en tant que points de contact pour maintenir la conductivité électrique de la lame revêtu d&#39;ITO. </li><li> Manteau de la lame de verre à l&#39;aide d&#39;une vingtaine de cycles de matrice revêtement (2-sec pulvérisation, 30 sec d&#39;incubation, et 60 secondes de temps de séchage pour chaque cycle). </li></ol> 2.2. Manuel Matrice revêtement <ol><li> Si des solvants organiques (par exemple le chloroforme et l&#39;acétate d&#39;éthyle) qui sont incompatibles avec les matériaux de fabrication de la matrice pulvérisateur électronique sont exirouge, utiliser un aérographe pulvérisateur pneumatique assisté à appliquer la matrice. Ajouter la solution de matrice préparée dans le réservoir de solvant de l&#39;aérographe et appliquer un léger flux d&#39;azote gazeux sous pression pour amorcer la pulvérisation. </li><li> Couvrir les bords de la surface avant des lames de verre ITO revêtus avec de la bande de sorte que la matrice ne pas recouvrir les bords de la diapositive. Cela garantit que les marques d&#39;enseignement sur la surface opposée peuvent être utilisées pour l&#39;alignement de glissement des tissus. Ne pas recouvrir les bords de la glissière avec la matrice car ils sont utilisés en tant que points de contact pour maintenir la conductivité électrique de la lame revêtu d&#39;ITO. </li><li> Après sprays stables et fines ont été observées, pulvériser manuellement la matrice de sorte qu&#39;il enrobe complètement la section de tissu. Appliquer le montant minimum de la solution de matrice nécessaire pour à peine mouiller la surface lors de chaque cycle pour éviter tout risque de délocalisation de l&#39;analyte. En général, utiliser environ 10 cycles de matrice pulvérisation pour enduire une section de tissu, le nombre de cycles esten fonction du type de tissu et la composition de la matrice. </li></ol> 3. MALDI MS <ol><li> Préparer une solution d&#39;étalonnage de masse par dilution de la &quot;Tuning ES Mix&quot; solution standard d&#39;un facteur 1:200 dans 60:40 isopropanol: eau (contenant de l&#39;acide formique à 0,1% dans le mélange final). </li><li> Introduire 2 ul / min de la solution diluée &quot;Tuning ES Mix&quot; dans le bi-mode ionisation électrospray (ESI) de source / MALDI d&#39;ions sur le spectromètre de masse FTICR, à partir du côté ESI. </li><li> Utilisez l&#39;instrument FTICR en mode ESI positif-ion, avec détection à large bande et une taille d&#39;acquisition de données de 1024 kb / s. Paramètres ESI typiques sont tension électrospray capillaire, 3900 V; pulvériser tension de bouclier, 3600 V, le gaz de nébulisation (N 2) flux, 2 L / min; gaz sec (N 2) débit et de température, 4 L / min et 200 ° C; skimmer 1 tension, 15 V, le temps de vol (TOF), 0.009 sec; gaz de collision (Ar) flux, 0,4 L / s; la source d&#39;ions temps d&#39;accumulation, 0,1 sec;et cellule de collision ion temps d&#39;accumulation, 0,2 sec. Régler les paramètres de fonctionnement FTICR afin de maximiser la sensibilité analytique sur la gamme de masse de m / z 200 à 1400, tout en maintenant le bon moment domaine d&#39;induction libre décroissance des signaux (FID). En règle générale, les paramètres de fonctionnement de l&#39;IC sont tension acolyte, 8 V; Sidekick tension de décalage, 8 V; excitation amplification de 10; excitation temps d&#39;impulsion, de 0,01 à 0,015 sec; avant tension de plaque de piège, de 1,5 V; dos piège tension de plaque, 1,6 V et analyseur tension d&#39;entrée, -4 V. Après un ensemble de paramètres de fonctionnement FTICR a été déterminé, d&#39;acquérir les spectres de masse ESI et calibrer l&#39;appareil en utilisant les masses des composés standards de référence dans la solution &quot;ES Tuning Mix&quot;. </li><li> Pour accorder l&#39;instrument pour un fonctionnement MALDI, dissoudre plusieurs fractions de 1 ul d&#39;une terfénadine mixte et la solution étalon de réserpine dans la solution de matrice à une concentration de 1 uM chacun, et repérer ces solutions directement sur l&#39;un des tissudes sections de e (c&#39;est à dire une section de tissu d&#39;essai) qui a été monté sur un coulisseau revêtu d&#39;ITO. Placer la lame revêtu d&#39;ITO dans un adaptateur de lame de tissu (c&#39;est à dire une cible MALDI spéciale) et de charger l&#39;adaptateur du côté MALDI dans la source d&#39;ions double ESI / MALDI. Optimiser les paramètres de fonctionnement MALDI appropriées pour la puissance du laser et le nombre de tirs laser pour MALDI accumulation de signal pour chaque balayage de masse, etc paramètres de fonctionnement MALDI typiques sont: des tirs laser, 50, et une tension de plaque MALDI de 300 V. </li><li> Après réglage, l&#39;étalonnage et l&#39;optimisation de l&#39;instrument pour des expériences MALDI-MSI, aligner l&#39;emplacement physique d&#39;une section de tissu à imager avec son image optique enregistrée dans le logiciel d&#39;imagerie. Utiliser les trois marques &quot;de correction&quot;-fluide, qui avaient été précédemment mis sur le côté opposé de la surface de glissement revêtue d&#39;ITO (étape 1.9), pour cet alignement en utilisant une méthode de triangulation à trois points. </li><li> Effectuez une ESI et MAL simultanéeOpération DI sorte que chaque spectre de masse contient les pics de masse de référence de la solution &quot;ES Tuning Mix&quot; post-acquisition étalonnage de masse interne. Cela se traduira par la mesure de la masse la plus précise au cours de MALDI MS. Pour ce faire, la première atténuer le signal ESI en diminuant la tension capillaire jusqu&#39;à ce que les signaux dominent les spectres MALDI tandis que les signaux de calibrant ESI sont encore suffisamment élevée pour l&#39;étalonnage de masse interne. </li><li> Ensuite, mettre en place une méthode de tramage automatisé pour l&#39;irradiation laser. Définir les zones de tissu à imager et définir la taille de l&#39;étape de trame laser approprié. Notez que les tailles de pas plus petit raster fournissent des images de tissus de la résolution, mais nécessitent un temps significativement plus long du spectre de masse d&#39;acquisition et plus d&#39;espace de stockage de données. Le nombre de pixels de l&#39;image dépend de la taille de pas de trame de laser à mettre en place et de la taille des tissus. Pour une lentille bovine typique qui a une taille de 1 cm 2 de tissu, une image de tissu est typiquement composée de ca. </em&gt; 5000 pixels si une taille de pas de trame de laser de 200 um est utilisé sur un instrument FTICR. Utiliser une analyse «point aléatoire&quot;, car cela empêche la polarisation basé sur la localisation progressive en raison de l&#39;atténuation du signal pendant l&#39;expérience. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Calibrer les spectres de masse MALDI utilisant le calibrage interne pour la comparaison initiale et pour sélectionner pics pour MS / MS. De-isotope et sélectionnez les sommets monoisotopiques comme décrit précédemment, en utilisant un script VBA personnalisée 38. </li><li> Export de la liste résultant de pointe monoisotopiques et saisir les valeurs m / z mesurées dans le METLIN 39 et / ou les BDMH 40 bases de données métabolome pour la masse correspondant avec les entrées de la bibliothèque. Prenons l&#39;(M + H) +, (M + Na) +, et (M + K) + ions pendant les recherches de base de données, avec une erreur de masse admissible de ± 1 ppm. </li><li> Générer des images MALDI pour l&#39;ensemble des entités de lipides détectés à travers l&#39;ensemble de coupe de tissu en utilisant imagun logiciel de courrier analyse, avec une largeur de filtre de masse de 1 ppm au sommet du pic. </li><li> Une fois les images ont été générées pour toutes les valeurs m / z qui correspondent à des entrées de base de données, générer des images pour tous les autres sommets ainsi à rechercher des modèles de distribution uniques qui peuvent être étudiés plus tard. </li></ol> 5. Confirmation de l&#39;identité des lipides imagés <ol><li> Confirmer l&#39;identité des lipides d&#39;abondance élevée, qui ont des ions fragments caractéristiques qui peuvent être détectées en utilisant l&#39;instrument FTICR (par exemple 184,073 pour les phospholipides), par MALDI-MS/MS. Effectuer MALDI-MS/MS utilisant dissociation induite par collision (CID) directement sur le tissu. </li><li> Pour les espèces lipidiques qui ne peuvent être directement confirmée par MALDI-MS/MS, utiliser un système UPLC couplé à un spectromètre de masse Q-TOF 34. <ol><li> Disséquer manuellement aliquotes contenant ~ 10 mg de tissu dans la zone où l&#39;espèce d&#39;intérêt ont été localisés. Placez ces aliquotes de tissu en 2des tubes de centrifugation ml. </li><li> Homogénéiser chaque aliquote de tissu dans 250 ul d&#39;eau, en utilisant un broyeur mélangeur avec deux billes métalliques en acier inoxydable de 5 mm. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;une solution chloroforme-méthanol (1:3, v / v), et les tubes vortex. Ensuite, centrifuger les tubes à l&#39;aide d&#39;une microcentrifugeuse à 12 000 xg pendant 10 min. </li><li> Recueillir les surnageants et les sécher dans un concentrateur de vitesse rotatif sous vide. </li><li> Dissoudre les résidus dans 100 pi de 30:70 isopropanol: eau. Injecter une portion aliquote de 10 ul sur la colonne UPLC pour la séparation en utilisant un gradient d&#39;élution. </li><li> Utiliser les conditions chromatographiques en ligne pour LC-MS/MS lipidiques, qui ont été publiées antérieurement 34. </li><li> Générer un courant ionique extrait (XIC) chromatogrammes en utilisant les valeurs théoriques m / z, avec une fenêtre de ± 50 ppm environ les masses théoriques. </li><li> Si les composés authentiques de ces lipides sont disponibles, faites correspondre les temps de rétention des composés authentiques avec ceux du corpondant pics de XIC à partir des échantillons de tissus. Si les composés sont les mêmes, les durées de rétention et les spectres MS / MS doivent correspondre. </li></ol></li><li> Si un composé authentique n&#39;est pas disponible, utiliser le schéma de fragmentation du lipide détecté pour correspondre à un spectre standard MS / MS à partir d&#39;une base de données métabolome comme METLIN ou BDMH. Utilisez de novo interprétation des spectres de masse pour déterminer une structure possible pour le lipide. </li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les considérations les plus importants pour la réussite MALDI MSI sont: 1) la préparation des tissus, 2) le choix de la matrice; 3) l&#39;application de la matrice, et 4) l&#39;interprétation et l&#39;analyse des données. Lorsque l&#39;échantillon et la matrice sont préparées de manière appropriée, l&#39;acquisition des données est automatisée MS. L&#39;analyse des données de ce type d&#39;expérience est assez de main-d&#39;œuvre. Préparation de tissu approprié est crucial pour expériences r...

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est une technique d&#39;analyse pour déterminer la localisation et de distribution la répartition spatiale des composés sur la surface d&#39;une coupe de tissu 1,2. Laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI) MSI pour l&#39;analyse des peptides et des protéines a été utilisé pour plus d&#39;une décennie et il ya eu de grandes améliorations dans les méthodes de préparation des échantillons, la sensibilité de détection, la résolution spatiale, la reproductibilité et le traitement des données de 3,4. En combinant les informations des sections histologiques colorées et expériences MSI, les médecins sont en mesure de corréler les distributions de composés spécifiques avec des caractéristiques intéressantes sur le plan physiopathologique 5. Les modes de distribution de petites molécules, y compris les médicaments exogènes 6,7 et de leurs métabolites 8-10 ont également été interrogés par MALDI-MS imagerie des tissus 11. Les lipides sont peut-être le cla plus largement étudiéart de composés avec l&#39;imagerie MALDI, à la fois dans les MS 12-17 et MS / MS 18 modes. L&#39;utilisation de MALDI MSI pour l&#39;imagerie du petit molécule a été limitée par plusieurs facteurs: 1) des matrices MALDI sont eux-mêmes de petites molécules (typiquement m / z &lt;500), qui génèrent des signaux d&#39;ions abondantes. Ces signaux abondantes peuvent supprimer l&#39;ionisation des analytes à petites molécules et interférer avec leur 19,20 de détection. Sans solvant matrice revêtement 21, matrice sublimation 22, et de la matrice MALDI prérevêtue MS 23, entre autres, ont été développées pour améliorer MSI de petites molécules. Nouvelles matrices qui peuvent améliorer l&#39;analyse des composés de faible poids moléculaire sont d&#39;un grand intérêt dans une petite molécule MSI. Ces matrices doivent fournir des signaux accrus d&#39;analyte avec les signaux de la matrice diminué. Dans le mode ions positifs, le 2,5-dihydroxybenzoïque acide (DHB) et-4-hydroxycinnamique α-cyano acide (ACSSD) sont les deux matrices MALDI MS couramment utilisés pour MSI 24 </sup&gt;. L&#39;idéal serait de former une matrice de petits cristaux, de façon à préserver la localisation spatiale des analytes. DHB a tendance à former des cristaux plus grands, par conséquent, l&#39;application de la matrice à l&#39;aide de sublimation a été développé pour surmonter partiellement ce problème, et a permis l&#39;utilisation de cette matrice pour l&#39;imagerie sensible de phospholipides 22,25. 9-aminoacridine a été utilisé pour des analytes MSI protiques dans le mode ions positifs, et 26 pour les nucleotides et les phospholipides dans la négative, le mode ions 26 à 29. 2-mercaptobenzothiazole a été trouvée pour donner détection de MALDI efficace des lipides 30, et a été utilisée pour l&#39;imagerie du cerveau de souris 31 gangliosides. La très haute résolution de la transformée de Fourier ion résonance cyclotron (FTICR) spectromètres de masse peuvent quelque peu atténuer ce problème en réglant les signaux d&#39;analyte à partir des signaux de la matrice 32. Un autre avantage de l&#39;utilisation de MS-FTICR est que les intensités des pôles de la matrice sont métastables réductioned 33, ce qui réduit également ces interférences 27. L&#39;utilisation de dithranol (DT; la 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) sous forme de matrice MALDI pour l&#39;imagerie des tissus a été précédemment rapporté 34. Dans ce travail en cours, un protocole détaillé est fourni pour l&#39;utilisation de DT pour la MSI des lipides endogènes sur les surfaces des sections de tissu de lentille bovine, dans le mode ions positifs.

<table><tbody><tr><td>Foie de rat</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56023-2</td><td></td></tr><tr><td>Lentille de veau bovin</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>57114-2</td><td>L’échantillon doit être décapsulé29 avant utilisation</td></tr><tr><td>Dithranol (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10608</td><td>MALDI</td></tr> <tr><td>Matrix&alpha ;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70990</td><td>MALDI Matrix</td></tr><tr><td>Acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td>MALDI Matrice</td></tr><tr><td>Réserpine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td><td></td></tr><tr><td>Terfénadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9652</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>Formiate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14266</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>320145</tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34972</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Alcools commerciaux 95</td><td></td><td> %</td></tr><tr><td>ES Mélange de réglage</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2431A</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre à revêtement ITO</td><td>Hudson Surface Technology</td><td>PSI1207000</td><td>Assurez-vous que les échantillons sont placés du côté conducteur d’électricité</td></tr><tr><td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td><td>Bic</td><td>WOSQP11</td><td></td></tr><tr><td>Pulvérisateur aérographe</td><td>Iwata</td><td>Eclipse HP-CS</td><td></td></tr><tr><td>ImagePrep</td><td>Bruker</td><td>249500-LS</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur MALDI</td><td>Bruker</td><td>235380</td><td></td></tr></tbody></table>

dithranol en tant que matrice pour matrix assisted laser désorption / ionisation imagerie sur une transformée de fourier ion cyclotron resonance mass spectrometer

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) détermine la localisation et de la distribution spatiale des motifs de composés sur la surface d&#39;une coupe de tissu, en utilisant principalement MALDI (laser assistée par matrice de désorption / ionisation) à base de techniques analytiques. Nouvelles matrices pour petite molécule MSI, ce qui peut améliorer l&#39;analyse de bas poids moléculaire (MW) composés, sont nécessaires. Ces matrices doivent fournir des signaux accrus d&#39;analyte tout en diminuant les signaux de fond MALDI. En outre, l&#39;utilisation d&#39;instruments très haute résolution, telles que la transformée de Fourier à résonance cyclotronique ionique (FTICR) des spectromètres de masse, a la capacité de résoudre des signaux d&#39;analyte à partir des signaux de la matrice, ce qui peut partiellement surmonter de nombreux problèmes associés à l&#39;arrière-plan provenant de la MALDI matrice. La réduction de l&#39;intensité des métastables grappes de matrice par FTICR MS peut également aider à surmonter certains des interférences associées aux pics de la matrice sur d&#39;autres instruments. Haute résolutioninstruments tels que les spectromètres de masse FTICR sont avantageux car ils peuvent produire des modèles de distribution de nombreux composés simultanément tout en offrant la confiance dans les identifications chimiques. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) a déjà été rapporté comme une matrice MALDI pour l&#39;imagerie des tissus. Dans ce travail, un protocole pour l&#39;utilisation de MALDI DT pour l&#39;imagerie des lipides endogènes à partir des surfaces des sections de tissus de mammifères, par-ion positif MALDI-MS, sur un hybride quadripolaire à ultra-haute résolution FTICR instrument a été fournie.

<html> Des échantillons de tissus qui sont sectionnés et dégel monté sur les lames de verre recouvertes d&#39;ITO doivent être intacts, sans déchirure visible. Pour de nombreux tissus, dégel des tissus montage direct sur une lame de verre recouverte d&#39;ITO est acceptable. Pour certains tissus spécifiques comme objectif de bovin, vaste déchirure des tissus est souvent observé lorsque dégel montage direct est utilisé (figure 1a). Pré-revêtement de la lame de verre ITO avec de l&#39;éthanol ou de l&#39;a...

Dithranol (DT; la 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) a été précédemment rapporté comme une matrice MALDI pour l&#39;imagerie des tissus de petites molécules, des protocoles pour l&#39;utilisation de DT pour l&#39;imagerie MALDI des lipides endogènes sur l&#39; surface des coupes de tissus par ions positifs MALDI-MS sur un ultra-résolution quadripolaire FTICR instrument sont fournies ici.

Dithranol en tant que matrice pour Matrix Assisted Laser Désorption / Ionisation imagerie sur une transformée de Fourier Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Cette procédure localise spatialement plusieurs lipides endogènes au sein d'un cristallin de bovin. En utilisant la technique d’ionisation par désorption laser assistée par matrice, l’imagerie par spectrométrie de masse. Tout d'abord, préparez une mince coupe de tissu de cristallin de bovin et appliquez une matrice multiple, puis acquérez un jeu de données spectral de masse maldi.Traitez le jeu de données pour en obtenir une représentation visuelle des lipides détectés sur la section de tissu de lentille. Ces résultats permettent conjointement de déterminer la localisation et l'abondance relative des lipides au sein d'une lentille de bovin et de produire une représentation visuelle de cette distribution. Contrairement à d'autres méthodes telles que l'extraction des lipides suivie d'une analyse par LC-MS, l'imagerie par spectrométrie de masse MALDI permet de visualiser simultanément plusieurs lipides sans perdre leur localisation spatiale. Retirez les échantillons de tissu congelés à la volée du stockage à moins 80 degrés Celsius.Retirez la capsule de la surface de l'œil pour fixer une section complète de lentille de veau. Déposez une ou deux gouttes d'eau sur le plateau de coupe tissulaire d'un cryostat. Placez rapidement la lentille dans l'eau avant qu'elle ne se solidifie, une fois que le cryostat a atteint la température optimale.Découper le tissu en sections de 20 microns d'épaisseur selon un plan équatorial. Jeter les premières sections de tissu et n'utiliser que les tranches proches du plan équatorial ou l'intersectant pour l'imagerie du tissu du cristallin oculaire. Ajouter 1,5 microlitre d'acide formique pour humidifier préalablement la surface d'une lame en verre revêtue d'ITO.Transférez ensuite délicatement les sections de tissu sur la lame à l'intérieur du cryostat. Puis, lyophilisez les lames pendant 15 minutes avant l'application de la matrice MALDI. À l'aide d'un stylo correcteur, ajoutez trois marques de repérage sur la surface non conductrice de la lame en verre revêtue d'ITO.Prenez maintenant une image optique de la lame de tissu à l’aide d’un scanner à plat et enregistrez-la dans un format approprié tel que TIFF ou JPEG. Commencez par recouvrir les bords de la surface avant des lames en verre recouvertes d’ITO avec du ruban adhésif afin que la matrice n’imprègne pas les bords de la lame. Préparez la matrice à utiliser dans un solvant approprié.Appliquez ensuite des solutions de matrice sur les surfaces des coupes tissulaires. Recouvrez la lame de verre en effectuant 20 cycles d'application de la matrice. Alternativement, un pulvérisateur assisté par air comprimé peut être utilisé pour appliquer les matrices si un solvant est incompatible avec le pulvérisateur électronique de matrice.Pour la solution d'étalonnage de masse, diluez la solution standard du mélange d'étalonnage ES d'un facteur de un à 200 dans du 60 % d'isopropanol. Introduisez deux microlitres par minute de la solution diluée du mélange d'étalonnage ES dans la source d'ions électrospray en mode double sur l'appareil pour une spectrométrie de résonance cyclotronique à transformée de Fourier. Faites fonctionner l'appareil F-T-I-C-R en mode ions positifs ESI avec détection large bande et une taille d'acquisition de données de 1024 kilo-octets par seconde. Réglez généralement les paramètres ESI à 3 900 volts pour la tension électrospray du capillaire.Un voltage de protection du pulvérisateur de 3 600 volts, un débit de gaz azote nébuliseur de deux litres par minute. Débit de gaz azote sec de quatre litres par minute et température de 200 degrés Celsius. Réglez également le voltage du premier déflecteur à 15 volts.Durée de vol à 0,01 seconde, débit de gaz d’argon de collision à 0,4 litre par seconde, temps d’accumulation des ions à la source à 0,1 seconde et temps d’accumulation des ions dans la cellule de collision à 0,2 seconde. Réglez ensuite les paramètres de fonctionnement du F-T-I-C-R afin de maximiser la sensibilité analytique sur la gamme de masse de rapport masse/charge de 200 à 1400, tout en maintenant de bons signaux temporels de désintégration par induction libre. Ensuite, enregistrez les spectres de masse ESI et étalonnez l’appareil à l’aide des masses de référence des composés standards contenus dans la solution de réglage E es.Pour régler l'instrument en vue d'une utilisation en MALDI, dissolvez plusieurs aliquots d'un microlitre d'une solution étalon mixte de turine et d'INE dans la solution matrice à une concentration de un micromolaire chacun, puis déposez ces solutions directement sur l'une des sections d'échantillon de tissu. Placez la lame dans un adaptateur pour lame de tissu et insérez l'adaptateur par le côté MALDI dans la source ionique double ESI-MALDI. Ensuite, optimisez les paramètres de fonctionnement MALDI appropriés concernant la puissance du laser et le nombre d'impulsions laser nécessaires à l'accumulation du signal MALDI pour chaque balayage de masse.Après avoir réglé, étalonné et optimisé l'instrument pour les expériences de MSI MALDI, alignez la position physique d'une coupe de tissu à imager avec son image optique enregistrée dans le logiciel d'imagerie. Alignez les trois marques de correcteur en utilisant une méthode de triangulation à trois points. Ensuite, commencez une opération MALDI ESI simultanée afin que chaque spectre de masse contienne les pics de masse de référence de la solution d'étalonnage E ES pour l'étalonnage interne de la masse après l'acquisition.Atténuez d'abord le signal ESI en réduisant la tension du capillaire jusqu'à ce que les signaux MALDI dominent les spectres, tout en maintenant les signaux de calibration de masse ESI suffisamment élevés pour l'étalonnage interne. Ensuite, configurez une méthode automatisée de balayage du laser de radiation. Utilisez une analyse aléatoire par points.Définissez les régions tissulaires à imager et réglez la taille appropriée du pas RA du laser. Étalonner les spectres de masse MALDI à l’aide d’un étalonnage interne pour la comparaison initiale, sélectionnez les pics pour la désisotopisation en MS/MS et identifiez les pics monoisotopiques à l’aide d’un script VBA personnalisé, puis exportez les listes de pics monoisotopiques obtenues. Saisissez les valeurs mesurées des rapports masse/charge dans les bases de données métabolomiques Melin nine ou HMDB pour une correspondance de masse avec les entrées de la bibliothèque.Ensuite, générer des images MALDI pour toutes les entités lipidiques détectées sur toute la section tissulaire à l'aide d'un logiciel d'imagerie avec une largeur de filtre de masse de une partie par million au sommet du pic. Une fois les images générées pour toutes les valeurs du rapport masse/charge correspondant aux entrées de la base de données, générer également des images pour tous les autres pics afin de rechercher des profils de distribution uniques pouvant être étudiés ultérieurement pour certains tissus spécifiques, tels que le cristallin de bovin. Des déchirures importantes du tissu sont souvent observées lorsqu'un montage par décongélation directe est utilisé.Le prétraitement de la lame IT OAS avec de l'éthanol ou de l'acide formique contribue à préserver l'intégrité des coupes tissulaires pendant le montage du tissu. Le choix de la matrice et celui du solvant sont des facteurs importants influant sur la qualité des spectres MALDI. Ces exemples comparent un spectre obtenu avec un solvant de matrice efficace à un mauvais choix de solvant de matrice pour le diol.Une fois l'ensemble des spectres de masse provenant d'une expérience de MSI Maldi acquis, l'image de chacun des ions détectés peut être générée. Chaque pixel représente un point d'irradiation laser provenant de la surface d'une section de tissu. Les concentrations relatives des analytes peuvent être précisées dans les différentes parties de la section de tissu.Dans la plupart des expériences, les données sont normalisées par rapport au courant ionique total au sein de chaque spectre. En l'absence de cette normalisation, des zones présentant une meilleure matrice analyte, comme la cristallisation du COC, pourraient produire des signaux plus intenses pour les analytes, ce qui fausserait les données. La préparation des tissus peut également modifier considérablement l'image générée.Si l'échantillon est trop humide, les analytes vont se délocaliser sur le tissu et une grande partie de l'information spatiale sera perdue. Cette démonstration d'une expérience d'imagerie tissulaire sur le cristallin oculaire a utilisé le diol comme matrice multiple pour déterminer la distribution spatiale des lipides par SMCI-FT. L'imagerie des lipides dans différents types de tissus peut être réalisée à l'aide du diol ou d'une autre matrice de manière similaire.

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