Dithranol en tant que matrice pour Matrix Assisted Laser Désorption / Ionisation imagerie sur une transformée de Fourier Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Cette procédure localise spatialement plusieurs lipides endogènes dans un cristallin bovin. Utilisation de la technique de DESORPTION ionisation laser assistée par matrice, imagerie spectrométrique de masse. Tout d’abord, préparez une coupe mince de tissu du cristallin bovin et appliquez un multi matrixx, puis acquérez un ensemble de données spectrales de masse maldi.

Transformez l’ensemble de données en une représentation visuelle des lipides détectés sur la coupe du tissu du cristallin. Ensemble, ces résultats peuvent déterminer l’emplacement et l’abondance relative des lipides dans un cristallin bovin et produire une représentation visuelle de cette distribution. Par rapport à d’autres méthodes telles que l’extraction des lipides suivie d’une analyse LCMS, l’imagerie par spectrométrie de masse maldi permet de visualiser plusieurs lipides simultanément sans perdre leur localisation spatiale. Retirez les échantillons de tissu congelés de l’entreposage à moins 80 degrés Celsius.

Retirez la capsule de la surface du cristallin pour fixer une section entière de lentille de veau bovin. Placez une ou deux gouttes d’eau sur l’étage de coupe des tissus d’un cryostat. Placez rapidement la lentille dans l’eau avant qu’elle ne se solidifie lorsque le cryostat s’est équilibré à la température optimale.

Coupez le tissu équatorial en sections de 20 microns d’épaisseur. Jetez les premières sections de tissu et n’utilisez que des tranches proches du plan équatorial ou ajoutant le plan équatorial pour l’imagerie du tissu du cristallin oculaire. Ajoutez 1,5 microlitre d’acide formique pour pré-mouiller la surface d’une lame de verre revêtue d’ITO.

Transférez ensuite soigneusement les sections de tissu sur la lame à l’intérieur du cryostat. Ensuite, lyophilisez les lames pendant 15 minutes avant l’application de la matrice maldi. À l’aide d’un stylo correcteur, ajoutez trois marques d’apprentissage sur la surface non conductrice de la lame de verre à revêtement ITO.

Prenez maintenant une image optique de la lame de tissu à l’aide d’un scanner à plat et enregistrez-la dans un format approprié tel que TIFF ou jpeg. Tout d’abord, couvrez les bords de la surface avant des lames de verre revêtues d’ITO avec du ruban adhésif afin que la matrice ne recouvre pas les bords de la diapositive. Préparez la matrice à utiliser dans un solvant approprié.

Appliquez ensuite des solutions matricielles sur les surfaces des sections de tissus. Enduisez la lame de verre en utilisant 20 cycles de revêtement matriciel. Alternativement, un pulvérisateur à aérographe à assistance pneumatique peut être utilisé pour appliquer les matrices si un solvant est incompatible avec le pulvérisateur à matrice électronique.

Pour la solution d’étalonnage de masse, diluer la solution étalon de mélange d’accord ES d’un facteur de un à 200 dans 60 % d’isopropanol introduit deux microlitres par minute de la solution de mélange d’étalonnage ES diluée dans la source d’ions d’ionisation par électropulvérisation bimode sur l’instrument pendant quatre résonance cyclotron à ions transformés ms. Utiliser l’instrument F-T-I-C-R en mode ESI à ions positifs avec détection à large bande et une taille d’acquisition de données de 1024 kilo-octets par seconde. Réglez généralement les paramètres ESI de 3 900 volts de tension d’électropulvérisation capillaire

Une tension de bouclier de pulvérisation de 3 600 volts nébuliseur d’azote gazeux s’écoule à deux litres par minute. Débit d’azote gazeux sec à quatre litres par minute et température de 200 degrés Celsius. Réglez également le skimmer sur une tension de 15 volts.

Temps de vol à 0,01 seconde Débit de gaz argon de collision à 0,4 litre par seconde, temps d’accumulation d’ions source à 0,1 seconde et temps d’accumulation d’ions de cellule de collision à 0,2 seconde. Réglez maintenant les paramètres de fonctionnement F-T-I-C-R afin de maximiser la sensibilité analytique sur la plage de masse allant du rapport masse/charge 200 à 1400 tout en maintenant de bons signaux de décroissance d’induction sans domaine temporel. Ensuite, acquérez les spectres de masse ESI et étalonnez l’instrument à l’aide des masses de référence des composés standard dans la solution de mélange d’accord E es.

Pour régler l’instrument pour le fonctionnement de MALDI, dissolvez plusieurs aliquotes d’un microlitre d’une solution étalon mixte de turine et d’INE dans la solution matricielle à une concentration d’une micromolaire chacune et repérez ces solutions directement sur l’une des sections de tissu de l’échantillon. Placez la glissière dans un adaptateur de lame en tissu et chargez l’adaptateur du côté MALDI dans la double source d’ions maldi ESI. Ensuite, optimisez les paramètres de fonctionnement MALDI appropriés pour la puissance laser et le nombre de tirs laser pour l’accumulation du signal MALDI pour chaque balayage de masse.

Après avoir réglé, calibré et optimisé l’instrument pour les expériences MSI maldi, alignez l’emplacement physique d’une section de tissu à imager avec son image optique enregistrée dans le logiciel d’imagerie. Alignez les trois marquages du fluide correcteur à l’aide d’une méthode de triangulation en trois points. Lancez ensuite une opération ESI MALDI simultanée afin que chaque spectre de masse contienne les pics de masse de référence de la solution de mixage de réglage E ES pour l’étalonnage de masse interne après l’acquisition.

Atténuez d’abord le signal ESI en diminuant la tension capillaire jusqu’à ce que les signaux MALDI dominent les spectres, tandis que les signaux de calibre ESI sont encore suffisamment élevés pour l’étalonnage de la masse interne. Ensuite, mettez en place une méthode de rasage automatisée pour le laser de rayonnement. À l’aide d’une analyse aléatoire des taches.

Définissez les régions tissulaires à imager et définissez la taille de pas de RA laser appropriée. Étalonnez les spectres de masse MALDI à l’aide d’un étalonnage interne pour la comparaison initiale, et pour sélectionner les pics pour l’isotope MSMS et sélectionnez les pics mono-isotopiques à l’aide d’un script VBA personnalisé et exportez les listes de pics mono-isotopiques résultantes. Entrez les valeurs mesurées du rapport masse/charge dans les bases de données de métabolome Melin neuf et/ou HMDB pour la correspondance de masse avec les entrées de bibliothèque.

Ensuite, générez des images maldi pour toutes les entités lipidiques détectées sur l’ensemble de la section tissulaire à l’aide d’un logiciel d’imagerie avec une largeur de filtre de masse d’une partie par million au sommet du pic. Une fois que les images ont été générées pour toutes les valeurs du rapport masse/charge qui correspondent aux entrées de la base de données, générez des images pour tous les autres pics et recherchez des modèles de distribution uniques qui peuvent être étudiés plus tard pour certains tissus spécifiques, tels que le cristallin bovin. Une déchirure importante du tissu est souvent observée lors de l’utilisation d’un montage direct par décongélation.

La préco de la lame IT OAS avec de l’éthanol ou de l’acide formique aide à maintenir l’intégrité des sections de tissus pendant le montage des tissus. Le choix de la matrice et le choix du solvant sont tous deux des facteurs importants qui influencent la qualité des spectres MALDI. Ces exemples comparent un spectre produit avec un solvant matriciel efficace avec un mauvais choix de solvant matriciel pour le diol.

Une fois que l’ensemble des spectres de masse d’une expérience MSI de Maldi a été acquis, l’image de chacun des ions détectés peut être générée. Chaque pixel représentant un point d’irradiation laser à partir de la surface d’une section de tissu. Les concentrations relatives des analytes peuvent être détaillées dans les différentes parties de la coupe de tissu.

Dans la plupart des expériences, les données sont normalisées en fonction du courant ionique total dans chaque spectre. Sans ces zones de normalisation avec une meilleure matrice d’analytes, la cristallisation du COC pourrait provoquer des signaux plus forts pour les analytes, ce qui fausserait les données. La préparation des tissus peut également changer radicalement l’image générée.

Si l’échantillon est trop humide, les analytes se délocaliseront sur le tissu et une grande partie de l’information spatiale sera perdue. Cette démonstration d’une expérience d’imagerie tissulaire sur lentille oculaire a utilisé le diol comme un multi Matrixx pour déterminer la distribution spatiale des lipides par F-T-I-C-R-M-S. L’imagerie des lipides dans différents types de tissus peut être réalisée à l’aide de diol ou d’une autre matrice de la même manière.