Entérique invasion bactérienne des cellules épithéliales intestinales

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser le modèle de chambre de diffusion verticale, ou modèle CDV, pour étudier les interactions bactériennes lors d'une invasion de cellules épithéliales intestinales. Cette approche consiste d'abord à utiliser un filtre spécial sur lequel est cultivée une monocouche polarisée de cellules épithéliales intestinales Caco-2 afin de créer dans la CDV des compartiments séparés, apical et latéral basal. Dans une deuxième étape, l'inoculum bactérien d'intérêt est ajouté au compartiment apical.

Dans des conditions micro-aérobies et de culture cellulaire, le milieu est ajouté au compartiment basolatéral dans des conditions aérobies, puis aux moments souhaités au cours de la co-culture, le filtre est retiré et le nombre de bactéries interagissantes ou intracellulaires est déterminé. En fin de compte, une augmentation du nombre de bactéries interagissantes et intracellulaires peut être observée à l’aide du modèle VDC par rapport aux conditions standard de culture aérobie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests classiques d’adhésion et d’internalisation en culture tissulaire, réside dans le fait que, grâce à cette méthode, la co-culture de bactéries et de cellules épithéliales intestinales est réalisée dans des conditions in vitro qui imitent plus étroitement les conditions in vivo de l’intestin humain.

La démonstration de la procédure sera effectuée par N Vida nas, doctorante dans mon laboratoire, et Dominic Mills, post-doctorant ayant mis au point le modèle de chambre de diffusion verticale dans le cadre de son doctorat réalisé dans mon laboratoire. Commencez par ensemencer quatre fois dix puissance cinq cellules épithéliales intestinales Caco-2 par filtre de 0,4 micron dans du milieu de culture, puis cultivez les cellules jusqu'à leur polarisation pendant 21 jours, en changeant le milieu toutes les deux à trois journées afin de confirmer l'état de polarisation de la monocouche. Utilisez un volt-ohmmètre pour mesurer la résistance électrique transepithéliale.

24 heures avant de commencer le test de co-culture en VDC, ensemencer jejuni sur une plaque fraîche d'agar au sang et incuber dans des conditions microaérophiles dans un incubateur à atmosphère variable. En même temps, pré-incuber 30 millilitres de bouillon Bruce dans les mêmes conditions le jour de l'expérience, immerger les demi-chambres VDC ainsi que les joints toriques et les bouchons dans une solution de stérilisation. Ensuite, utiliser une seringue stérile de 20 millilitres pour faire circuler la solution à travers les entrées de gaz des deux demi-chambres. Après une heure, rincer les composants VDC avec de l'eau stérile fraîche à l’aide d’une autre seringue stérile de 20 millilitres pour rincer les entrées de gaz.

Ensuite, récolter la moitié de la culture sur gélose au sang CJ dans un millilitre de bouillon barella pré-incubé afin d'obtenir environ 10 à la puissance 10 UFC par millilitre. Mesurer la densité optique de la suspension bactérienne à 600 nanomètres pour quantifier de façon semi-quantitative les unités formant colonies bactériennes ou UFC, puis ajuster la suspension bactérienne au niveau d'inoculum souhaité dans un volume total de quatre millilitres de bouillon Bruce pré-incubé. Réaliser une dilution en série à partir de cette suspension bactérienne finale, puis ensemencer la dilution appropriée sur des géloses au sang en triple exemplaire et incuber les géloses dans une enceinte à atmosphère variable pendant 48 heures.

Maintenant, placez la moitié inférieure de la chambre du VDC à plat sur la paillasse et insérez un joint torique dessus. Ensuite, détachez un filtre portant les cellules épithéliales intestinales du porte-filtre et rincez-le trois fois avec 400 microlitres de PBS stérile. Placez le filtre sur la moitié inférieure de la chambre en veillant à ce que le joint torique reste en place, puis abaissez délicatement la moitié supérieure de la chambre en position.

Une fois les deux chambres demi-circulaires assemblées, serrez-les ensemble à l'aide des pinces annulaires et placez le VDC horizontalement sur le plan de travail, les deux ouvertures orientées vers le haut. Ajoutez l'inoculum bactérien dans la chambre apicale, puis ajoutez quatre millilitres de milieu de culture cellulaire dans la chambre basolatérale. Insérez les embouts dans les ouvertures des deux demi-chambres, puis placez le VDC dans l'incubateur à atmosphère variable.

À proximité immédiate du collecteur de gaz, ouvrez le détendeur de la source de gaz raccordé au collect游戏副本

Ensuite, ouvrez très lentement l'écoulement du gaz sur le collecteur de gaz afin d'éviter une pression excessive et d'obtenir un débit gazeux d'une bulle toutes les deux à cinq secondes après la période de co-culture appropriée. Fermez le régulateur d'alimentation en gaz raccordé au collecteur de gaz. Ensuite, purgez le flux de gaz dans le VDC au niveau du collecteur, puis déconnectez l'entrée de gaz, la sortie de gaz et le bouchon du VDC.

Ensuite, retirez le VDC de l'incubateur à atmosphère variable. Puis, retirez les surnageants apicaux et basolatéraux et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pour une analyse ultérieure. Retirez les pinces à collier et démontez délicatement le VDC.

Retirer le filtre de la demi-chambre et le transférer dans une plaque de culture cellulaire stérile à six puits. Ensuite, laver le VDC avec de l'eau stérile et le conserver pour le prochain cycle d'expériences destiné au dénombrement du nombre total de bactéries interagissantes. Laver les cellules épithéliales intestinales trois à cinq fois avec 400 microlitres de PBS stérile, puis les lyser dans 400 microlitres de PBS stérile contenant du Triton X 100 pendant 20 minutes à température ambiante. Réaliser une dilution en série à partir du lysat cellulaire, puis ensemencer les dilutions appropriées sur des boîtes de gélose au sang en triplicata.

Incubez ensuite les plaques à 37 degrés Celsius dans un incubateur à atmosphère variable pendant 48 heures afin de procéder au dénombrement du nombre total de bactéries envahissantes. Incubez les cellules épithéliales intestinales avec 400 microlitres de milieu de culture cellulaire contenant 150 microgrammes par millilitre de gentamicine pendant deux heures dans un incubateur standard de culture tissulaire afin d'éliminer les bactéries extracellulaires. Quantifiez ensuite les unités formant des colonies après lyse cellulaire, dilution en série et culture, comme vient d'être illustré.

Les données suivantes illustrent une comparaison entre le nombre de CJ jui interagissant avec ou envahissant les cellules Caco-2 après trois, six ou 24 heures de co-culture dans des conditions standard de test en culture cellulaire et en utilisant le modèle VDC. Après 24 heures de co-culture, par exemple, moins de 10⁷ UFC de CJ Juna peuvent être observées en interaction avec les cellules Caco-2 dans des conditions standard de culture cellulaire. Toutefois, après 24 heures de co-culture dans le modèle VDC, environ 10⁸ UFC de CJ jui peuvent être observées en interaction avec les cellules Caco-2, soit une augmentation d’environ dix fois des interactions CJ jui-IEC.

Lors de la comparaison du nombre de CJ jui envahissant dans des conditions de culture standard par rapport à celles du modèle VDC, environ 10 à la puissance de cinq UFC intracellulaires de CGE jui peuvent être isolées à partir des cellules CACO-2 après 24 heures dans des conditions de culture cellulaire standard. En revanche, après 24 heures de co-culture dans le modèle VDC, environ 10 à la puissance de sept UFC intracellulaires peuvent être isolées à partir des cellules CACO-2, soit une augmentation intracellulaire de CGE d'environ 100 fois. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller le débit de gaz dans la chambre basolatérale après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la pathogenèse des abuc à étudier à la fois la base génétique de l'interaction bactérienne avec les cellules épithéliales intestinales, ainsi que la réponse immunitaire innée de l'hôte face à une infection bactérienne. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser le modèle de chambre de diffusion verticale pour étudier les interactions d'autres bactéries entériques avec les cellules épithéliales intestinales et les conditions qui représentent plus fidèlement celles présentes dans l'intestin humain.