Isolation de microvasculaire endothéliale des artères de résistance Tubes souris

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des tubes de cellules endothéliales de l'artère épigastrique supérieure de la souris, ou SEA, afin d'étudier la dynamique des signaux intracellulaires et intercellulaires au sein d'un endothélium microvasculaire natif intact. Cette isolation est réalisée en premier lieu en extrayant la SEA de la paroi musculaire squelettique abdominale de la souris. Dans une deuxième étape, le vaisseau est digéré délicatement et de manière somatique, puis soigneusement traité par TAT afin de dissocier les cellules musculaires lisses et l'adventice du tube de cellules endothéliales.

Dans la dernière étape, le tube est fixé dans une chambre d'écoulement et perfusé avec une solution saline physiologique. En fin de compte, l'imagerie confocale peut être utilisée pour visualiser la signalisation calcique dans le tube endothélial microvasculaire intact et natif. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la culture de cellules endothéliales, est que les cellules endothéliales constituant le tube conservent leur morphologie native, leur expression protéique et leur réactivité. L'endothélium joue un rôle essentiel dans le contrôle du débit sanguin dans tout l'organisme.

L'application de cette technique nous permet d'étudier les événements de signalisation cellule à cellule qui régulent le contrôle du débit sanguin, ainsi que la manière dont ils peuvent être perturbés lors d'un dysfonctionnement vasculaire. Pour isoler d'abord l'artère épigastrique superficielle (SEA), réalisez une petite incision à travers la peau juste au-dessus de la région pubienne d'une souris anesthésiée, étendez l'incision latéralement dans chaque direction jusqu'aux membres postérieurs respectifs, puis poursuivez l'incision de façon rostrale le long de la ligne médiane ventrale jusqu'au sommet de la cage thoracique, en étendant davantage l'incision latéralement dans chaque direction jusqu'aux quatre membres respectifs. Soulevez maintenant délicatement la peau et sectionnez le tissu conjonctif qui la relie au muscle sous-jacent, exposant ainsi toute la surface de la musculature abdominale.

Irriquer le muscle exposé avec une solution saline à température ambiante. Ensuite, sous un microscope stéréo, soulever le bourrelet adipeux situé à la base du sternum. Pratiquer une incision à travers le bourrelet adipeux et le long de la dernière côte.

L'ASE doit maintenant être visible ; veillez à ne pas endommager l'artère, et rincez le tissu exposé avec une solution saline à température ambiante. Une fois la couche superficielle du muscle squelettique rétractée, observez la longueur de l'ASE, puis excisez soigneusement la fine couche musculaire située sous l'artère. Ensuite, utilisez une pince angulée pour passer un brin de suture en soie six/0 sous l'ASC.

Ensuite, ligaturer l'artère et la veine adjacente afin de maintenir la pression et de conserver le sang à l'intérieur de la lumière du vaisseau. Après avoir ligaturé l'ASC du côté controlatéral, pratiquer une incision le long de la ligne médiane des muscles abdominaux pour séparer les côtés respectifs, puis prolonger l'incision latéralement dans chaque direction, comme effectué pour la peau. Poursuivre l'incision verticalement le long du bord externe afin de séparer complètement le muscle abdominal du corps.

Ensuite, coupez l'ASE au-dessus de la ligature pour préserver l'étanchéité, puis placez le muscle isolé et l'artère dans un bécher de 50 millilitres contenant 10 millilitres de tampon de dissection à quatre degrés Celsius. Après avoir isolé le muscle de l'autre côté de l'abdomen, incubez les tissus dans le tampon de dissection pendant 10 minutes. Placez maintenant le muscle abdominal contenant l'ASE dans une boîte de Pétri à quatre degrés Celsius recouverte d'une couche de cire de protection et contenant du tampon de dissection. Utilisez des épingles d'insecte de 0,15 millimètre pour étirer l'ASE et le muscle à leurs longueurs in vivo approximatives préalablement notées.

Fixez l'artère épiploïque supérieure (SEA) au garde-cylindre en orientant le muscle de manière à ce que la couche mince tournée vers le péritoine se trouve en haut. Ensuite, en partant du site ligature en amont vers l'extrémité en aval, dégagez environ un à deux centimètres de l'artère épiploïque supérieure de sa veine jumelée et des tissus environnants jusqu'au premier site de branche principale. Sectionnez l'artère épiploïque supérieure juste au-dessus du site de branchement et juste en dessous de la ligature.

Ensuite, utilisez un morceau de tube élastique pour fixer l'extrémité arrière d'une pipette à une seringue de cinq millilitres contenant du tampon de dissection glacé. Fixez la pointe de la pipette de canulation dans la chambre de dissection et canulez l'ASE. Puis, une fois tous les érythrocytes évacués, retirez l'ASE de la pipette de canulation et retirez la pipette de la boîte de dissection afin d'isoler les tubes endothéliaux.

Remplissez d'abord un tube de culture en verre de 12 sur 75 millimètres à moitié avec du tampon de dissection glacé. Ensuite, après avoir découpé l'artère sous-endothéliale en morceaux de un à trois millimètres, utilisez une pince angulée pour transférer les fragments artériels dans le tube de culture et placez le tube sur de la glace. Puis, mélangez les enzymes de digestion avec le tampon de dissociation jusqu'à un volume final d'un millilitre dans un autre tube de culture de 12 sur 75 millimètres et préchauffez la solution enzymatique à 37 degrés Celsius à l'aide d'un bloc chauffant.

Retirer le tube de culture contenant les fragments artériels de quatre degrés Celsius et le placer à température ambiante pour le réchauffer, pendant que la solution enzymatique atteint 37 degrés Celsius. Aspirer soigneusement le tampon de dissection, désormais à température ambiante, du tube de culture, en laissant un petit volume contenant les segments vasculaires. Ajouter ensuite lentement du tampon de dissociation sans enzymes à température ambiante aux segments vasculaires, de sorte que les fragments artériels restent au fond du tube de culture, afin d'éliminer tout tampon de dissection résiduel.

Une fois que la solution enzymatique a atteint 37 degrés Celsius, aspirez le tampon de dissociation du tube de culture contenant les segments vasculaires, en laissant un petit volume contenant les segments vasculaires. Transférez maintenant la solution enzymatique à 37 degrés dans le tube de culture et incubez le tube de culture dans le bloc chauffant pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pendant l'incubation, préparez une micropipette de litrage remplie d'huile minérale, marquez la micropipette, effectuez une cassure nette, cassez la micropipette à l'aide de pinces chauffées, polites-en l'extrémité et fixez-la à une microsyringe montée sur un micromanipulateur.

Ensuite, retirez lentement le piston de la microseringue pour remplir la pipette avec deux nanolitres de tampon de dissociation et positionnez la pointe de la pipette au-dessus de la chambre d'écoulement à la fin de l'incubation. Après avoir aspiré soigneusement le tampon comme vient de l'être démontré, lavez les segments artériels avec quatre millilitres de tampon de dissociation à température ambiante. Puis, aspirez délicatement un segment de vaisseau à l’aide d’une micropipette de un millilitre et placez le vaisseau dans une chambre d’écoulement contenant un millilitre de tampon de dissociation.

Positionnez la pointe de la pipette de rotation près d'une extrémité du segment de vaisseau, puis aspirez le segment de vaisseau dans la pipette de rotation à environ 225 nanolitres par seconde, afin de ne pas exercer de contrainte mécanique sur les cellules endothéliales ; expulsez ensuite le vaisseau dans la chambre. Si la digestion a été réussie, les cellules musculaires lisses et l'aventice seront dissociées du tube endothélial. Éloignez rapidement l'aventice du tube endothélial pour éviter qu'elle ne s'emmêle avec le tube, puis répétez la rotation comme vient de l'être démontré jusqu'à ce que toutes les cellules musculaires lisses soient dissociées.

Après la dernière itération, ASEE a placé le tube endothélial isolé au centre de la chambre d'écoulement, aligné selon la direction du flux, puis a retiré la pipette de déclenchement. Fixer les pipettes de fixation dans des micromanipulateurs montés à chaque extrémité de la chambre d'écoulement, puis positionner leurs embouts aux extrémités respectives du tube endothélial. Abaisser les pipettes de fixation, une à la fois, aux extrémités opposées du tube, en appuyant le tube contre le fond de la chambre, à environ 50 micromètres de chaque extrémité du tube.

Au moment où la pipette de fixation touche le tube, retirez-la lentement le long de l'axe du tube, en l'étirant jusqu'à sa longueur approximative in vivo. Appuyez la pipette contre le fond de la chambre pour fixer le tube, puis commencez l'écoulement de la solution de superfusion à l'aide d'une pompe péristaltique afin de maintenir un débit constant de la solution de superfusion à travers le tube endothélial. Sur cette image en contraste interférentiel différentiel, on observe un tube endothélial isolé provenant d'une SEA après une superfusion d'une heure avec un tampon de superfusion à trois millilitres par minute à température ambiante.

Ce film montre les réponses calciques d'un tube de cellules endothéliales chargé au fluo-4 en réponse à une stimulation par l'acétylcholine à une micromolaire. Ces images de fluorescence représentatives ont été obtenues à différents moments après la stimulation du tube endothélial par l'acétylcholine. Observez comment le calcium intracellulaire oscille au fil du temps.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'éviter tout dommage mécanique au tube endothélial pendant le positionnement et l'immobilisation, car les cellules endothéliales sont extrêmement fragiles et facilement endommagées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière d'isoler des tubes endothéliaux de l'artère épigastrique supérieure de la souris, et ainsi d'étudier l'endothélium microvasculaire natif intact.