Isolation de microvasculaire endothéliale des artères de résistance Tubes souris

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les tubes de cellules endothéliales de l’artère épigastrique supérieure de la souris ou SEA afin d’étudier la dynamique de signalisation intra et intercellulaire d’un endothélium microvasculaire intact natif. Ceci est accompli en isolant d’abord le SEA de la paroi musculaire squelettique abdominale de la souris. Dans la deuxième étape, le vaisseau est digéré doucement et somatiquement, puis soigneusement TATé pour dissocier les cellules musculaires lisses et adventices du tube de cellules endothéliales.

Dans la dernière étape, le tube est fixé dans une chambre d’écoulement et super fusionné avec une solution saline physiologique. En fin de compte, l’imagerie confocale peut être utilisée pour visualiser la signalisation calcique dans le tube endothélial microvasculaire intact natif. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la culture des cellules endothéliales, est que les cellules endothéliales qui composent le tube et conservent leur morphologie native, l’expression des protéines et la réactivité, L’endothélium fait partie intégrante du contrôle du flux sanguin dans tout le corps.

L’application de cette technique nous permet d’étudier les événements de signalisation intercellulaire qui interviennent dans le contrôle du flux sanguin et comment ils peuvent mal tourner lors d’un dysfonctionnement vasculaire. Pour isoler d’abord l’SEA, faites une petite incision à travers la peau juste au-dessus de la zone de la région pubienne d’une souris anesthésiée, étendez l’incision latéralement dans chaque direction jusqu’aux membres postérieurs respectifs, puis poursuivez l’incision le long de la ligne médiane ventrale jusqu’au sommet de la cage thoracique, en étendant encore l’incision latéralement dans chaque direction aux quatre membres respectifs. Maintenant, soulevez doucement la peau et sectionnez le tissu conjonctif qui maintient la peau au muscle sous-jacent, exposant toute la surface de la musculature abdominale.

Irriguez le muscle exposé avec une solution saline à température ambiante. Puis sous un stéréomicroscope, soulevez le coussinet adipeux situé au bas du sternum. Faites une incision à travers le coussinet adipeux et le long de la côte inférieure.

L’EES doit maintenant être visible, en prenant soin de ne pas endommager l’artère, d’irriguer les tissus exposés avec plus de solution saline à température ambiante. Une fois que la couche supérieure du muscle squelettique a été rétractée, notez la longueur de l’SEA, puis excisez soigneusement la fine couche musculaire sous l’artère. Ensuite, utilisez une pince coudée pour passer une longueur de six suture en soie sous l’ACS.

Ensuite, ligaturez l’artère et sa veine adjacente pour la maintenir sous pression et pour garder le sang retenu dans la lumière du vaisseau. Après avoir ligaturé l’ACS du côté controlatéral, faites une incision le long de la ligne médiane des muscles abdominaux pour séparer les côtés respectifs, puis étendez l’incision latéralement dans chaque direction comme cela a été fait pour la peau. Continuez l’incision verticalement le long du bord extérieur pour séparer complètement le muscle abdominal du corps.

Ensuite, coupez le SEA au-dessus de la ligature pour maintenir l’étanchéité et placez le muscle et l’artère isolés dans un bécher de 50 millilitres contenant 10 millilitres de tampon de dissection à quatre degrés Celsius. Après avoir isolé le muscle de l’autre côté de l’abdomen, incubez les tissus dans un tampon de dissection pendant 10 minutes. Maintenant, placez le muscle abdominal contenant le SEA dans une boîte de Pétri à quatre degrés Celsius recouverte d’une couche de cyl guard et contenant un tampon de dissection. Utilisez des épingles à insectes de 0,15 millimètre pour étirer le SEA et le muscle à leurs longueurs in vivo approximatives précédemment notées.

Fixez le SEA à la protection cyl en orientant le muscle de manière à ce que la fine couche faisant face au péritoine soit sur le dessus. Ensuite, en partant du site amont de la ligature vers l’extrémité aval, dégagez environ un à deux centimètres de la SEA de sa veine appariée et du tissu environnant jusqu’au premier site de branche majeur. Coupez le SEA juste au-dessus du site de la branche et juste en dessous de la ligature.

Ensuite, utilisez un morceau de tube élastique pour fixer l’extrémité arrière d’une pipette à une seringue de cinq millilitres contenant un tampon de dissection glacé. Fixez la pointe de la pipette de canulation dans la chambre de dissection et canulez le SEA. Ensuite, une fois que tous les érythrocytes ont été rincés, retirez le SEA de la pipette de canulation et retirez la pipette de la boîte de dissection pour isoler les tubes endothéliaux.

Tout d’abord, remplissez à moitié un tube de culture en verre de 12 x 75 millimètres avec un tampon de dissection glacé. Ensuite, après avoir coupé le SEA en morceaux d’un à trois millimètres, utilisez une pince coudée pour transférer les morceaux artériels dans le tube de culture et placez le tube sur de la glace. Ensuite, combinez les enzymes de digestion avec le tampon de dissociation jusqu’à un volume final d’un millilitre dans un tube de culture séparé de 12 x 75 millimètres et préchauffez la solution enzymatique à 37 degrés Celsius avec un bloc chauffant.

Retirez le tube de culture contenant les morceaux artériels de quatre degrés Celsius et placez-le à température ambiante pour le réchauffer pendant que la solution enzymatique se réchauffe à 37 degrés Celsius. Aspirez soigneusement le tampon de dissection à température ambiante du tube de culture, en laissant un petit volume contenant les segments du récipient. Ajoutez maintenant lentement à température ambiante, un tampon de dissociation sans enzymes aux segments du vaisseau de sorte que les morceaux artériels restent au fond du tube de culture pour éliminer tout tampon de dissection restant.

Une fois que la solution enzymatique a atteint 37 degrés Celsius, aspirez à nouveau le tampon de dissociation du tube de culture contenant les segments de vaisseaux, en laissant un petit volume contenant les segments de vaisseaux. Transférez maintenant la solution enzymatique à 37 degrés dans le tube de culture et incubez le tube de culture dans le bloc chauffant pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pendant l’incubation, préparez une pipette de littérature, remplissez-la d’huile minérale, marquez la pipette, faites une pause nette, cassez la pipette avec une pince à feu, polissez l’extrémité de la pipette et fixez-la sur une micro-seringue montée dans un micro-manipulateur.

Ensuite, rétractez le piston de la micro-seringue pour remplir la pipette de deux nanolitres de tampon de dissociation et positionnez la pointe de la pipette sur la chambre d’écoulement à la fin de l’incubation. Après avoir soigneusement aspiré le tampon comme nous venons de le démontrer, lavez les segments artériels avec quatre millilitres de tampon de dissociation à température ambiante. Ensuite, aspirez doucement un segment de récipient à l’aide d’une micropipette d’un millilitre et placez le récipient dans une chambre d’écoulement avec un millilitre de tampon de dissociation.

Positionnez la pointe de la pipette tation près d’une extrémité du segment vasculaire, puis aspirez le segment vasculaire dans la pipette tating à environ 225 nanolitres par seconde, afin de ne pas provoquer de contrainte mécanique sur les cellules endothéliales, éjectez le récipient dans la chambre. Si la digestion a réussi, les cellules musculaires lisses et les adventices seront dissociées du tube endothélial. Éloignez l’adventice du tube endothélial dès que possible pour l’empêcher de s’emmêler dans le tube, puis répétez la tation comme nous venons de le démontrer jusqu’à ce que toutes les cellules musculaires lisses soient dissociées.

Après l’itération finale, ASEE et placé le tube endothélial isolé au centre de la chambre d’écoulement, aligné le long de la direction de l’écoulement et retiré la pipette de déclenchement. Fixez les pipettes à goupille dans des micromanipulateurs montés à chaque extrémité de la chambre d’écoulement, puis positionnez leurs pointes aux extrémités respectives du tube endothélial. Abaissez les pipettes à goupiller, une à la fois, sur les extrémités opposées du tube, en pressant le tube contre le fond de la chambre, à environ 50 micromètres de chaque extrémité du tube.

Au moment où la pipette à épingler touche le tube, rétractez-la lentement le long de l’axe du tube, en l’étendant jusqu’à sa longueur in vivo approximative. Appuyez la pipette contre le fond de la chambre pour fixer le tube, puis commencez l’écoulement de la solution de superfusion à l’aide d’une pompe péristaltique pour maintenir un débit constant de la solution de superfusion à travers le tube endothélial. Dans cette image de contraste interférentiel différentiel, un tube de cellules endothéliales isolé d’une SEA suivant, une superfusion d’une heure avec un tampon de superfusion à trois millilitres par minute à température ambiante est montré.

Ce film démontre les réponses calciques d’un tube de cellules endothéliales chargé de la grippe en réponse à une stimulation micromolaire à l’acétylcholine. Ces images de fluorescence représentatives ont été collectées à divers moments après stimulation du tube endothélial avec de l’acétylcholine. Notez comment le calcium intracellulaire oscille au fil du temps.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter d’endommager mécaniquement le tube endothélial lors du tri-positionnement et de l’épinglage, car les cellules endothéliales sont extrêmement délicates et facilement endommagées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’isoler les tubes endothéliales de l’artère épigastrique supérieure de la souris, et ainsi d’étudier l’endothélium microvasculaire intact natif.