Un modèle in vitro pour étudier les réponses immunitaires des cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’infection par le virus respiratoire syncytial humain

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la réponse des cellules immunitaires humaines à une infection par le virus respiratoire syncytial, ou VRS. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant une souche infectieuse de VRS sur des cellules HELo. Dans une deuxième étape, la souche de VRS cultivée est purifiée par ultracentrifugation.

Ensuite, les cellules immunitaires sanguines primaires humaines sont isolées par centrifugation de densité. Dans la dernière étape, les cellules immunitaires isolées sont stimulées avec le virus. En définitive, la réponse immunitaire cellulaire à l'infection par le VRS peut être évaluée par ELISA, QPCR ou cytométrie en flux.

Cette technique constitue un ajout précieux à l'étude des infections virales respiratoires sur place. Le VRS est hautement adapté aux humains. Il est donc important d'utiliser des cellules immunitaires humaines pour étudier les voies inflammatoires impliquées dans la pathogenèse du virus.

Bien que le virus utilisé dans cette vidéo soit le VRS, cette méthode peut également être facilement adaptée à l'étude d'autres virus, tels que le virus de la grippe ou le rhinovirus. Commencez par réchauffer un flacon de stock de VRS humain dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius. Une fois le virus décongelé, diluez le stock en aliquots de quatre millilitres de milieu d'infection par flacon.

En maintenant le MOI à 0,1 ou moins, ajoutez le virus aux cellules Heli avec un volume total aussi faible que possible sans provoquer le dessèchement des cellules. Incubez ensuite les cultures pendant deux à quatre heures à 37 degrés Celsius et 5 % CO2, en agitant doucement le flacon toutes les 15 minutes pour redistribuer le milieu. Ensuite, retirez l'inoculum et lavez les cellules une fois avec du PBS.

Ensuite, ajoutez 15 millilitres de milieu de culture dans les flacons et incubez-les pendant trois à cinq jours dans les mêmes conditions de culture. Observez les cellules une fois par jour, chaque jour, en microscopie optique classique, à la recherche de modifications cytopathologiques induites par le virus. Lorsque ces modifications sont observées, grattez les cellules pour récolter le VRS, puis recueillez la suspension dans un tube stérile de 50 millilitres, mettez les cellules en vortex, puis centrifugez-les pendant 10 minutes à 1800 G et à température ambiante afin de former un culot de débris cellulaires.

Le VRS ne forme pas de culot à cette vitesse, et par conséquent, le surnageant peut être conservé à moins 80 degrés Celsius comme stock de semence en aliquots d'un millilitre. Pour une utilisation ultérieure, congeler toujours rapidement le VRS dans de l'azote liquide afin d'éviter la perte de particules virales infectieuses. Pour purifier le VRS, commencer par placer un tube à centrifuger stérile dans chaque godet d'une ultracentrifugeuse.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de solution de saccharose filtrée et stérilisée, fraîchement préparée, au fond de chaque tube. Puis, très lentement, ajoutez 30 millilitres de la solution de VRS par-dessus la solution de saccharose, en prenant soin de ne pas perturber la solution de saccharose et de maintenir les couches bien distinctes. Ensuite, dans un cabinet de flux laminaire afin de préserver la stérilité, équilibrez soigneusement les six godets d'ultracentrifugation avec du PBS stérile à ± 0,1 gramme près les uns par rapport aux autres, bouchons inclus. Faites centrifuger le virus pendant 1,5 heure à 20 000 RCF et à quatre degrés Celsius.

Ensuite, une fois la centrifugation terminée, utilisez une pince stérile pour retirer soigneusement les tubes de centrifugation des godets. Les particules virales auront traversé la couche de saccharose pour former un culot. Versez les tubes de centrifugation dans un flacon de déchets viraux et laissez-les s’égoutter à l’envers sur une surface stérile.

Ne laissez pas le culot s'assécher complètement. Ensuite, faites couler soigneusement un millilitre de HPSS sur le culot et inclinez à nouveau le tube de centrifugation pour éliminer le HPSS. Puis retournez le tube à l'envers à nouveau, en prenant soin de ne pas laisser le culot s'assécher.

Maintenant, resuspendre le culot 40 fois dans un autre millilitre de HBSS en prenant soin d'éviter la formation de bulles, car cela peut détruire le virus. Ensuite, congeler rapidement des aliquotes du virus dans de l'azote liquide. Conserver le virus à moins 80 degrés Celsius jusqu'à sa quantification et son utilisation ultérieure. Après avoir prélevé du sang dans des tubes EDTA de 10 millilitres auprès de volontaires sains, diluer le sang avec du PBS à température ambiante jusqu'à deux fois, pour un volume maximal de 35 millilitres de sang dilué dans un tube de 50 millilitres.

Ensuite, fixez une aiguille stérile à verrouillage sur une seringue stérile de 50 millilitres, puis aspirez le milieu de gradient de densité dans la seringue. Placez l'aiguille au fond du tube contenant le sang dilué et pipetez soigneusement 15 millilitres de milieu de gradient de densité sous le sang, en maintenant une démarcation nette entre le gradient de densité et le sang. Séparez maintenant les cellules pendant 20 minutes à 800 ×g, à température ambiante, avec une accélération maximale et le frein désactivé. Après la séparation, les érythrocytes se trouvent dans le culot au fond du tube, avec une couche argentée de neutrophiles au-dessus.

La couche claire située au-dessus du culot contient le milieu de gradient de densité, et la fine couche située entre ce milieu et la couche de plasma sanguin supérieure contient les PBMC. Utilisez une pipette Pasteur pour prélever soigneusement les PBMC, puis transférez les cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres placé sur de la glace. Ajoutez du PBS glacé jusqu'à un volume de 50 millilitres et centrifugez pour obtenir un culot cellulaire une fois la rotation terminée.

Aspirez le surnageant et lavez le culot avec 50 millilitres de PBS glacé deux fois ; après le deuxième lavage, ajoutez un millilitre de milieu glacé au culot, comptez les cellules et ajustez la concentration cellulaire à cinq fois 10 à la puissance six PBMC par millilitre. Pour stimuler les PBMC avec le VRS vivant, ajoutez d'abord 100 microlitres de PBMC dans chaque puits d'une plaque de 96 puits à fond rond. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de deux stimuli fraîchement dilués à chaque puits.

Incubez correctement la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 %CO2, puis centrifugez la plaque et récupérez le surnageant pour une analyse ultérieure par Eliza. Les PBMC stimulés présents dans le culot peuvent être analysés par QPCR ou colorés pour la cytométrie en flux. Lors de l'expérimentation de stimulation A-P-B-M-C, la méthode de fractionnement des stimuli est recommandée avec cette approche.

Les conditions sont divisées en conditions de stimuli standards telles que le RPMI ou le VRS humain, et en conditions de fractions testées telles que le mial, le dipeptide ou le LPS. Il est important d'inclure systématiquement un contrôle négatif, tel que le RPMI seul, et un contrôle positif, tel que le LPS, dans chaque expérience. Après 24 heures de stimulation avec le VRS, différentes populations de PBMC présentent un taux d'infection dépendant de la dose ainsi qu'une différence dans l'efficacité d'infection par le VRS. Après 24 heures de stimulation avec le virus, une analyse par qPCR du niveau d'expression de la TNF alpha ou de l'interféron gamma dans les PBMC montre que le VRS induit une surexpression marquée de la transcription de ces deux cytokines inflammatoires. En revanche, la stimulation avec le mial, le dipeptide ou le LPS entraîne uniquement une faible expression d'ARNm.

Lorsque les PBMC sont stimulés conjointement par le VSR et le dipeptide MIAL, on observe une forte régulation positive synergique. Les PBMC stimulés ont également été analysés pour leur production de TNF-alpha ou d'interféron gamma par ELISA. Contrairement aux observations au niveau transcriptionnel, le VSR est un faible inducteur de la sécrétion protéique de TNF-alpha et d'interféron gamma ; la stimulation des PBMC par le dipeptide MIAM entraîne la production de faibles quantités de TNF-alpha et d'aucun interféron gamma.

À l'instar des analyses transcriptionnelles, à la fois le TNF alpha et l'interféron gamma présentent une uprégulation synergétique lors d'une co-stimulation avec le VRS et le dipeptide MIAM, utilisé comme témoin afin de déterminer si l'induction des cytokines dépend de la réplication du VRS. Les PBMC ont été stimulés par le VRS vivant ou inactivé par la bêta-propiolactone, comme illustré dans les graphiques ; à la fois le VRS vivant et le VRS inactivé induisent la production de cytokines pro-inflammatoires. N'oubliez pas que les expériences impliquant le VRS doivent être réalisées dans une hotte de sécurité biologique, en laboratoire de niveau de biosécurité 2.

De plus, lors de la mise en œuvre de cette méthode, il est essentiel de se rappeler d'utiliser des réactifs et des matériaux exempts d'endotoxines tout au long de l'ensemble du protocole. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de stimuler les PBMC humains avec le VRS et de plusieurs tests pouvant être utilisés pour analyser la réponse immunitaire.