Name: Un modèle in vitro pour étudier les réponses immunitaires des cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’infection par le virus respiratoire syncytial humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez comment étudier les réponses immunitaires des cellules mononucléées du sang périphérique humain à l'infection par le virus respiratoire syncytial. Cette méthode permet d'analyser les voies inflammatoires activées par le virus.

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RSV A2 a été aimablement fourni par le Dr R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Pays-Bas). MV et GF sont soutenus par le consortium Virgo, financé par le projet du gouvernement néerlandais numéro FES0908, et par le projet de l’Initiative néerlandaise de génomique (NGI) numéro 050-060-452. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Remarque :
Les expériences avec le HRSV doivent être réalisées dans une hotte de sécurité biologique au sein d'un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2. Recueillir tous les déchets viraux et les matériaux ayant été en contact avec le virus afin de les éliminer correctement en raison des risques biologiques.
Des précautions particulières doivent être prises lors de l'utilisation de sang humain potentiellement infecté.
Il est essentiel d'utiliser des réactifs exempts de pyrogènes tout au long de tous les protocoles.
1. Culture du HRSV A2
<ol>
	<li>Cultiver les cellules HeLa ou HEp-2 en milieu DMEM + 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) + 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) dans un flacon de 175 cm²2 flacon de culture jusqu'à ce qu'elles atteignent environ 50 % de confluence.</li>
	<li>Laver les cellules trois fois avec du tampon salin phosphate à température ambiante (PBS).</li>
	<li>Dégeler un flacon contenant le stock viral de souche d'inoculum de HRSV à 37 °C dans un bain-marie. Diluez le stock de virus de manière à maintenir un MOI de 0,1 ou moins. Ceci permet d'éviter la formation de particules déficientes interférentes (DIP). Diluez le stock de virus dans 4 ml/flacon de milieu d'infection (DMEM + 1 % P/S) et ajoutez-le aux cellules HeLa ou HEp-2. Conservez ce volume aussi faible que possible sans provoquer le dessèchement des cellules. Plus le volume est faible, plus le taux d'infection sera élevé.</li>
	<li>Incuber 2 à 4 h à 37 °C, 5 % CO₂2. Agiter doucement le flacon toutes les 15 minutes pour redistribuer le milieu.</li>
	<li>Retirer l'inoculum et laver une fois avec du PBS.</li>
	<li>Ajouter 15 ml de milieu de culture (DMEM + 10 % FCS + 1 % P/S) et incuber pendant 3 à 5 jours à 37 °C, 5 % CO₂2Observer les cellules au microscope en champ clair classique pour détecter les modifications cytopathologiques induites par le virus, par exemple formation de syncyties et mort cellulaire et cellules en suspension.</li>
	<li>Lorsque des cytopathies apparaissent, récoltez le HRSV en raclant les cellules et recueillez la suspension virale dans un tube stérile de 50 ml. Vortexez la suspension cellulaire. Le raclage et le vortexage des cellules libèrent davantage de particules virales.</li>
	<li>Centrifuger la suspension virale pendant 10 min à température ambiante à 1 800 x g pour former un culot avec les débris cellulaires. Le VRSH présent dans le surnageant ne sédimente pas à cette vitesse et le surnageant peut être utilisé directement pour infecter plusieurs flacons de 175 cm2 flacons ou peuvent être conservés à -80 °C comme stock de semence en aliquots de 1 ml pour une utilisation ultérieure. Congelez toujours rapidement le HRSV dans de l'azote liquide afin d'éviter la perte de particules virales infectieuses.</li>
	<li>Comme indiqué ci-dessus, le lot d'inoculum préparé selon le protocole ci-dessus est utilisé pour infecter plusieurs flacons de 175 cm²2 flacons de culture. Répéter exactement le protocole pour produire davantage de virus destiné à la purification. Purifier jusqu'à 180 ml de suspension virale en un seul cycle d'ultracentrifugation.</li>
	<li>Lorsque des cytopathologies apparaissent, récoltez le HRSV en grattant les cellules et recueillez le surnageant. Vortexez la suspension virale. Centrifugez pendant 10 min à température ambiante à 1 800 x g pour former un culot des débris cellulaires. Le HRSV présent dans le surnageant ne sédimente pas à cette vitesse et le surnageant est aliquoté, 15 ml par tube de 50 ml. Congelez rapidement et stockez à -80 °C jusqu'à la purification.</li>
</ol>
2. Purification du HRSV
Remarque : Avant d'utiliser un ultracentrifugeuse, sachez qu'il s'agit d'un équipement potentiellement dangereux. Lisez attentivement les manuels et effectuez la première centrifugation en ultracentrifugation sous la supervision d'une personne expérimentée.
<ol>
	<li>Nettoyer les godets d'ultracentrifugation avec de l'éthanol à 70 % et les laisser sécher dans une hotte de sécurité biologique.</li>
	<li>Placer un tube de centrifugation stérile dans chaque godet.</li>
	<li>Préparer une solution de saccharose à 30 % (p/v) dans une solution PBS, filtrer et stériliser (filtre de 0,2 µm) puis ajouter 5 ml au fond de chaque tube de centrifugation. Pour un protocole plus rapide, les tubes contenant la solution de saccharose peuvent être congelés. Veiller à les maintenir stériles.</li>
	<li>Si la solution de saccharose n’a pas été congelée, ajouter très soigneusement 30 ml de solution de HRSV au-dessus de la solution de saccharose. Utiliser une pipette lentement afin de ne pas perturber la solution de saccharose. Maintenir une démarcation nette. Si les tubes ont été congelés, verser la suspension virale au-dessus de la solution de saccharose congelée, puis laisser décongeler.</li>
	<li>Équilibrer très soigneusement les six godets d'ultracentrifugation avec du PBS stérile. Placer la balance dans une hotte à flux laminaire afin de maintenir la stérilité. Remplir les tubes jusqu’à 3 à 5 mm en dessous du bord, sinon les tubes de centrifugation pourraient s’effondrer. Équilibrer les godets à 0,1 g près, en incluant le bouchon vissé, au cas où les bouchons ne seraient pas parfaitement identiques.</li>
	<li>Centrifuger dans l’ultracentrifugeuse pendant 1,5 heure à 4 °C à 20 000 rcf.</li>
	<li>Retirer délicatement le tube de centrifugation du godet à l’aide de pinces stériles. Les particules virales auront traversé la couche de saccharose et formeront un culot. En revanche, les facteurs solubles sécrétés par les cellules (par exemple les cytokines) resteront en solution. Incliner le tube de centrifugation pour éliminer tout le liquide. Le laisser à l’envers sur une surface stérile, par exemple une boîte de culture, pour le sécher, mais sans laisser le culot sécher complètement.</li>
	<li>Ajouter soigneusement 1 ml de solution saline tamponnée de Hank (HBSS) au culot et incliner le tube de centrifugation pour éliminer le HBSS. Laisser à nouveau sécher le tube à l’envers sur une surface stérile. Ne pas laisser le culot sécher complètement.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 1 ml de HBSS en pipetant 40 fois vers le haut et vers le bas. S’efforcer d’éviter la formation de bulles d’air, car cela pourrait détruire le virus.</li>
	<li>Aliquoter le virus, congeler rapidement dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C jusqu’à utilisation ultérieure. Utiliser un nouvel aliquot de virus pour chaque expérience, car des cycles répétés de congélation-décongélation réduiront le titre infectieux. Lors de la décongélation, faire toujours fondre le virus à 37 °C, car le HRSV est moins stable entre -20 et 15 °C.</li>
</ol>
3. Quantification du HRSV
Remarque : pour garantir des données reproductibles, répétez la quantification au moins trois fois en double.
3.1. Infection des cellules A549
<ol>
	<li>Incuber les cellules A549 dans une plaque 24 puits jusqu'à confluence.</li>
	<li>Laver les cellules A549 deux fois avec 1 ml de PBS à température ambiante.</li>
	<li>Préparer des dilutions sérielles 5 fois du HRSV dans du milieu à faible teneur en sérum. Ajouter 100 μl de virus dilué dans chaque puits. Réaliser au minimum 4 dilutions (par exemple 4, 20, 100 et 500 fois). Inclure deux puits supplémentaires infectés avec la dose la plus élevée de virus (utilisés pour le contrôle d'isotype) et inclure deux puits non infectés (témoins).</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 2 heures à 5 % de CO2 et 37 °C. Agiter doucement la plaque 24 puits toutes les 15 minutes pour éviter le dessèchement.</li>
	<li>Retirer la suspension virale et laver les cellules une fois avec 1 ml de PBS à température ambiante.</li>
	<li>Préparer de l'albumine sérique bovine (BSA) à 4 % (p/v) dans du milieu à faible teneur en sérum. Stériliser par filtration (filtre de 0,2 μm) et ajouter 500 μl dans chaque puits.</li>
	<li>Incuber à 5 % de CO2, 37 °C pendant 22 heures.</li>
</ol>
3.2. Préparation pour la cytométrie en flux
<ol>
	<li>Retirer le milieu et laver les cellules une fois avec 1 ml de PBS à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 200 μl de trypsine préchauffée (37 °C) dans chaque puits et incuber pendant 10 min à 37 °C, 5 % CO2.</li>
	<li>Observer les cellules au microscope pour vérifier leur détachement. Si les cellules sont détachées, ajouter 800 μl de DMEM + 10 % FCS + 1 % P/S pour neutraliser la trypsine. Resuspendre les cellules.</li>
	<li>Transférer les cellules dans une plaque 96 puits conique, non traitée pour la culture cellulaire. Centrifuger 5 min à 400 x g à température ambiante. Resuspendre les culots dans 200 μl de PBS froid.</li>
	<li>Centrifuger 5 min à 400 x g à 4 °C. Décanter le surnageant et resuspendre dans 200 μl de PBS froid.</li>
	<li>Centrifuger 5 min à 400 x g à 4 °C. Décanter le surnageant et resuspendre dans 150 μl d'acétone glacée à 80 %.</li>
	<li>Fixer les cellules à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Centrifuger 5 min à 400 x g à 4 °C. Décanter le surnageant et resuspendre dans 200 μl de PBS froid + 0,1 % BSA.</li>
	<li>Centrifuger 5 min à 400 x g à 4 °C. Décanter le surnageant et resuspendre dans 50 μl d'anticorps anti-NP-RSV-FITC (dilué à 1:50 dans du PBS + 1 % BSA) ou dans 50 μl d'IgG2 anti-souris-FITC (contrôle d'isotype ; utiliser donc la même concentration d'anticorps).</li>
	<li>Pour la suite du protocole, garder les tubes à l'abri de la lumière. Incuber au moins 1 heure à 4 °C, mais cette étape peut être prolongée jusqu'à une nuit complète.</li>
	<li>Ajouter 150 μl de PBS froid + 0,1 % BSA.</li>
	<li>Centrifuger 5 min à 400 x g à 4 °C. Décanter le surnageant et resuspendre dans 200 μl de PBS froid + 0,1 % BSA.</li>
	<li>Centrifuger 5 min à 400 x g à 4 °C. Décanter le surnageant et resuspendre dans 200 μl de PBS froid + 0,1 % BSA. Garder la plaque sur glace et à l'abri de la lumière jusqu'à l'analyse en cytométrie en flux.</li>
	<li>Analyser les cellules infectées sur un cytomètre en flux.</li>
</ol>
3.3. Calcul du FITC-50
<ol>
	<li>Utilisez un programme d'analyse par cytométrie en flux pour définir le seuil à l'aide du témoin négatif (contrôle d'isotype). Utilisez le type de graphique en pseudocouleurs. Tracez une grille en quadrants, où les cellules positives se trouvent dans le quadrant Q3. Le pourcentage de faux positifs doit être inférieur à 0,2 % dans les deux contrôles d'isotype.</li>
	<li>Exportez les données vers un tableur et préparez un tableau contenant le pourcentage de cellules FITC+ pour chaque dilution. Soustrayez la valeur moyenne des faux positifs (déterminée par le contrôle d'isotype) de chaque valeur, pour chaque expérience.</li>
	<li>Ouvrez un nouveau fichier (nuage de points XY, une colonne X et plusieurs colonnes Y) dans un logiciel de statistiques. Copiez les données dans ce programme : X = dilution, Y = % de cellules infectées, n = 3 ; utilisez la moyenne de deux mesures pour chaque dilution. Effectuez une régression non linéaire avec analyse statistique de décroissance exponentielle à une phase. Vérifiez si la courbe ajuste correctement les points de données ; sinon, choisissez une autre analyse statistique.</li>
	<li>Copiez l'équation de la courbe et les valeurs associées vers un tableur. Calculez la valeur de X pour Y = 50 %. Déterminez ainsi la valeur FITC-50 en calculant le nombre de particules infectieuses détectées par FITC par ml (FIP/ml) à la dilution correspondant à 50 % d'infection, à l'aide de l'équation suivante : 
	<img alt="Formule de calcul du FITC50 ; schéma illustrant l'équation de mesure de l'intensité de fluorescence." fo:src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Équation 1"> 
	A = nombre moyen de cellules A549 par puits 
	B = μl de virus par puits utilisés pour l'infection 
	C = dilution à laquelle on observe 50 % d'infection</li>
</ol>
4. Isolement de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de sang de donneurs sains
<ol>
	<li>Prélevez du sang veineux dans des tubes EDTA de 10 ml chez des volontaires sains après obtention d'un consentement éclairé. Un volume de 10 ml de sang permet d'obtenir environ 107 PBMC.</li>
	<li>À partir de maintenant, travaillez en conditions stériles dans une cabine à flux laminaire.</li>
	<li>Doublez le volume de sang avec du PBS à température ambiante dans un tube de 50 ml. Par tube de 50 ml, un volume total maximal de 35 ml de sang dilué peut être utilisé.</li>
	<li>Prenez une seringue stérile de 50 ml et fixez-y une aiguille stérile à emboîtement Luer. Aspirez du milieu de gradient de densité dans la seringue. Placez l'aiguille au fond d'un tube contenant le sang dilué et pipetez soigneusement 15 ml de milieu de gradient de densité sous le sang dilué. Veillez à maintenir une démarcation nette entre le milieu de gradient de densité et le sang.</li>
	<li>Effectuez une centrifugation à 800 x g pendant 20 min à température ambiante, avec une accélération réglée à 9 (maximum) et sans frein. Après utilisation, réglez la température de la centrifugeuse sur 4 °C.</li>
	<li>La centrifugation par gradient de densité donne lieu à plusieurs couches. En bas, un culot d'érythrocytes est présent, surmonté d'une couche argentée contenant les neutrophiles. La couche claire au-dessus de ce culot contient le milieu de gradient de densité. Une fine couche intermédiaire entre le milieu de gradient de densité et la couche de plasma sanguin supérieure contient les PBMC.</li>
	<li>Prélèvez soigneusement les PBMC à l’aide d’une pipette Pasteur et transférez les cellules dans un nouveau tube de 50 ml. À partir de maintenant, maintenez les PBMC sur glace et utilisez du PBS glacé. Ajoutez du PBS glacé jusqu'à un volume total de 50 ml et centrifugez à 400 x g pendant 10 min à 4 °C (avec le frein réglé à 9).</li>
	<li>Jetez le surnageant par aspiration, resuspendez le culot dans 50 ml de PBS glacé et centrifugez à 400 x g pendant 10 min à 4 °C ; répétez deux fois.</li>
	<li>Après élimination du surnageant, ajoutez 1 ml de milieu froid (RPMI + 1 % P/S) et comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage.</li>
	<li>Ajustez la concentration cellulaire à 5 x 106 PBMC/ml.</li>
</ol>
5. Stimulation des PBMC avec du HRSV vivant
<ol>
	<li>Préparer un montage de l'expérience ; inclure des réplicats expérimentaux pour chaque condition.</li>
	<li>Diluer tous les stimuli nécessaires dans le milieu (RPMI + 1 % P/S). Garder à l'esprit que le volume final par puits sera de 200 μl. Un volume de 50 μl de stimuli sera ajouté, donc préparer des stocks de stimulation concentrés 4 fois.</li>
	<li>Ajouter 100 μl de la suspension cellulaire mentionnée ci-dessus dans chaque puits d'une plaque 96 puits à fond rond (5 x 105 PBMC/puits).</li>
	<li>Ajouter 50 μl des stimuli dilués dans chaque puits. Il est possible d'ajouter deux stimuli différents, ce qui donne un volume total de 200 μl. Si un seul stimulus est nécessaire, ajuster le volume à 200 μl avec du milieu.</li>
	<li>Incuber la plaque 96 puits pendant la durée requise à 37 °C dans un incubateur avec 5 % de CO2. Pour la plupart des cytokines, une incubation de 24 heures sera suffisante.</li>
</ol>
6. Lecture de la stimulation
<ol>
	<li>À la fin de la période d'incubation, centrifuger la plaque de 96 puits pendant 5 min à température ambiante à 450 x g pour ramener les cellules au fond.</li>
	<li>Prélever le surnageant (un volume maximal de 180 μl) et le conserver pour une analyse ultérieure des cytokines (-20 °C) ou pour la production de virus (-80 °C).</li>
	<li>Les PBMC stimulés présents dans le culot peuvent être analysés par qPCR ou immunotransfert (Western blot) en ajoutant un tampon de lyse, ou alternativement, les PBMC peuvent être marqués pour une analyse en cytométrie en flux.</li>
</ol>

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</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Dans cette étude, nous démontrons que l’infection de PBMC par le HRSV est un système modèle rapide et fiable dans lequel les voies inflammatoires peuvent être étudiées. Afin de stimuler les PBMC, il faut préparer et quantifier un stock de HRSV.
Plusieurs lignées cellulaires sont sensibles à l’infection par le VRSR. Les lignées cellulaires les plus utilisées pour la culture du HRSV sont les cellules HEp-2, HeLa et Vero. Cependant, nous ne recommandons pas l’utilisation de cellules Vero pour la ...

Le virus respiratoire syncytial humain (VRHR) est la cause la plus fréquente d’infections des voies respiratoires inférieures chez les enfants. Chaque année, plus de 33 millions d’enfants de moins de cinq ans sont infectés par le VRH, ce qui entraîne plus de trois millions d’hospitalisations et près de 200 000 décès1. De plus en plus de preuves suggèrent que le VRS représente également une menace importante pour les personnes âgées et les adultes atteints de maladies chroniques sous-jacentes2.
La majorité des infections par le VRSH chez les jeunes enfants présentent des symptômes bénins, comparables à ceux du rhume, et ne nécessitent pas d’intervention clinique. Cependant, une petite proportion de patients nécessitent une hospitalisation et une ventilation mécanique en raison d’une bronchiolite sévère.
Une partie de la pathogenèse de la maladie HRSV est la réponse immunitaire exubérante et inadéquate de l'hôte à l'infection3,4. Ceci est illustré par plusieurs observations. La période de maladie maximale est souvent précédée du pic de l’infection virale et coïncide mieux avec l’infiltration cellulaire des tissus infectés et la libération de cytokines inflammatoires3. Une autre source de preuves provient des essais sur le HRSV inactivé au formol (FI-RSV) dans les années 1960. Au lieu d’induire une protection chez les jeunes nourrissons, le vaccin a entraîné une réponse immunitaire exagérée, ce qui a entraîné une aggravation des maladies respiratoires et une augmentation de la morbidité et de la mortalité.
Plusieurs modèles ont été développés pour étudier la pathogenèse des infections par le HRSV. Les lignées cellulaires continues, comme HEp-2 et A549, ont été largement utilisées pour étudier l’infection par le HRSV in vitro. Les cellules épithéliales sont les principales cibles de l’infection par le HRSV5, c’est pourquoi l’accent a été mis sur ces types de cellules. Cependant, la situation in vivo est beaucoup plus complexe et ne se limite pas à un seul type de cellule. Afin d’examiner ces interactions complexes, plusieurs modèles d’infection animale ont été développés pour étudier la pathogenèse du VRH. Jusqu’à présent, deux stratégies différentes ont été employées, se concentrant soit sur des modèles hétérologues (non humains), soit sur des modèles apparentés de pneumovirus hôte. Des exemples de modèles hétérologues pour le HRSV incluent les chimpanzés, les moutons, les rats cotonniers et les souris. L’infection par le VRS chez son hôte naturel a été étudiée chez les bovins et chez la souris, en utilisant respectivement le VRS bovin et le pneumovirus.
Bien que chacun de ces modèles ait fourni des informations importantes sur la pathogenèse de la maladie, le VRSV est fortement adapté aux humains. Par conséquent, en plus des lignées cellulaires et des modèles animaux actuellement utilisés, nous proposons d’utiliser des PBMC primaires humaines comme modèle de stimulation par HRSV. Les PBMC humains peuvent être obtenus auprès d’un éventail de personnes pour répondre à des questions de recherche spécifiques, y compris les jeunes enfants6, les personnes immunodéprimées ainsi que les adultes en bonne santé7 ou les personnes âgées8. Les PBMC peuvent être utilisés pour étudier les aspects innés de l’infection ainsi que la réponse adaptative au virus. Les voies inflammatoires activées importantes pour la pathogenèse de la maladie HRSV peuvent être étudiées au niveau de l’ARNm et des protéines. De plus, l’infection virale de (sous-ensembles de) cellules immunitaires peut être déterminée par cytométrie en flux. Nous avons déjà utilisé ce modèle pour identifier les effets synergiques de l’infection par le HRSV avec le ligand bactérien muramyl dipeptide (MDP) sur l’induction de cytokines pro-inflammatoires7. Nous proposons d’utiliser la stimulation par le VRS des PBMC primaires humains comme un modèle in vitro robuste, facile et rapide pour étudier les voies inflammatoires impliquées dans la pathogenèse de la maladie du VRSL.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS sans Ca2+ Mg2+ ou rouge phénol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td>HBSS, Calcium, Magnésium, sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td>DMEM, Glucose élevé, GlutaMAX, Pyruvate</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>72400054</td><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES</td></tr><tr><td>Reduced Serum Medium (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td>FBS (Fetal Bovin Serum)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Albumine de sérum bovin</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Pénicilline-Streptomycine, liquide</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1x), Rouge de Phénol</td></tr><tr><td>Cellules HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>A549 Cellules</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>Saccharose BioXtra, &ge ; 99,5 %</td></tr><tr><td>IgG2 anti-souris-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555057</td><td>Ms IgG2b K FITC contrôle isotype</td></tr><tr><td>Anti-NP-RSV-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab25849</td><td>Anti-Respiratory Syncytial Virus anticorps [671] (FITC)</td></tr><tr><td>Milieu à gradient de densité (Lymphoprep)</td><td>Axis-Shield</td><td>1114545</td><td></td></tr><tr><td>tubes EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Merck Millipore</td><td>1000141000</td><td>Acétone pour l’analyse</td></tr><tr><td colspan="4">Matériau </td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polyallomer, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>SureSpin 630 Rotor avec godets de 36 ml</td><td>Sorvall</td><td>79368</td><td>Rotor à godets oscillants en titane</td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>CB 150l 2 Liant</td><td></td><td></td><td></td> d’incubateur</tr></tbody></table>

un modèle in vitro pour étudier les réponses immunitaires des cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’infection par le virus respiratoire syncytial humain

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Les infections par le virus respiratoire syncytial humain (VRHR) présentent un large spectre de gravité de la maladie, allant d’infections bénignes à une bronchiolite potentiellement mortelle. Une partie importante de la pathogenèse d’une maladie grave est une réponse immunitaire accrue conduisant à une immunopathologie.	Ici, nous décrivons un protocole utilisé pour étudier la réponse immunitaire des cellules immunitaires humaines à une infection par le VRSL. Tout d’abord, nous décrivons les méthodes utilisées pour la culture, la purification et la quantification du HRSV. Par la suite, nous décrivons un modèle humain in vitro dans lequel les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont stimulées par le HRSV en direct. Ce système modèle peut être utilisé pour étudier plusieurs paramètres qui peuvent contribuer à la gravité de la maladie, y compris la réponse immunitaire innée et adaptative. Ces réponses peuvent être mesurées au niveau transcriptionnel et translationnel. De plus, l’infection virale des cellules peut être facilement mesurée à l’aide de la cytométrie en flux. Dans l’ensemble, la stimulation de PBMC avec le HRSV en direct fournit un système modèle rapide et reproductible pour examiner les mécanismes impliqués dans la maladie induite par le HRSV.

La méthode de culture et de purification du HRSV A2 décrite ici permet d'obtenir un rendement compris entre 2&nbsp;×&nbsp;107 et 2&nbsp;×&nbsp;108 particules virales infectieuses quantifiées par FITC-50 par ml. Les résultats de l'analyse microscopique, pour laquelle les cellules infectées marquées au FITC ont été comptées (résultats non montrés), ont été comparés aux résultats de la quantification par cytométrie en flux (Figure 1). Les deux méthodes ont fourni des titres similaires,...

Le virus respiratoire syncytial humain (HRSV) peut provoquer une bronchiolite sévère chez les jeunes nourrissons. Une partie de la pathogenèse de la maladie grave du VRSL est causée par la réponse immunitaire de l’hôte. La stimulation des cellules immunitaires humaines primaires avec le HRSV fournit un système modèle rapide et reproductible pour étudier l’activation des voies inflammatoires et l’infection.

Un modèle in vitro pour étudier les réponses immunitaires des cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’infection par le virus respiratoire syncytial humain

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier la réponse des cellules immunitaires humaines à une infection par le virus respiratoire syncytial, ou VRS. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant une souche infectieuse de VRS sur des cellules HELo. Dans une deuxième étape, la souche de VRS cultivée est purifiée par ultracentrifugation.Ensuite, les cellules immunitaires sanguines primaires humaines sont isolées par centrifugation de densité. Dans la dernière étape, les cellules immunitaires isolées sont stimulées avec le virus. En définitive, la réponse immunitaire cellulaire à l'infection par le VRS peut être évaluée par ELISA, QPCR ou cytométrie en flux.Cette technique constitue un ajout précieux à l'étude des infections virales respiratoires sur place. Le VRS est hautement adapté aux humains. Il est donc important d'utiliser des cellules immunitaires humaines pour étudier les voies inflammatoires impliquées dans la pathogenèse du virus.Bien que le virus utilisé dans cette vidéo soit le VRS, cette méthode peut également être facilement adaptée à l'étude d'autres virus, tels que le virus de la grippe ou le rhinovirus. Commencez par réchauffer un flacon de stock de VRS humain dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius. Une fois le virus décongelé, diluez le stock en aliquots de quatre millilitres de milieu d'infection par flacon.En maintenant le MOI à 0,1 ou moins, ajoutez le virus aux cellules Heli avec un volume total aussi faible que possible sans provoquer le dessèchement des cellules. Incubez ensuite les cultures pendant deux à quatre heures à 37 degrés Celsius et 5 % CO2, en agitant doucement le flacon toutes les 15 minutes pour redistribuer le milieu. Ensuite, retirez l'inoculum et lavez les cellules une fois avec du PBS.Ensuite, ajoutez 15 millilitres de milieu de culture dans les flacons et incubez-les pendant trois à cinq jours dans les mêmes conditions de culture. Observez les cellules une fois par jour, chaque jour, en microscopie optique classique, à la recherche de modifications cytopathologiques induites par le virus. Lorsque ces modifications sont observées, grattez les cellules pour récolter le VRS, puis recueillez la suspension dans un tube stérile de 50 millilitres, mettez les cellules en vortex, puis centrifugez-les pendant 10 minutes à 1800 G et à température ambiante afin de former un culot de débris cellulaires.Le VRS ne forme pas de culot à cette vitesse, et par conséquent, le surnageant peut être conservé à moins 80 degrés Celsius comme stock de semence en aliquots d'un millilitre. Pour une utilisation ultérieure, congeler toujours rapidement le VRS dans de l'azote liquide afin d'éviter la perte de particules virales infectieuses. Pour purifier le VRS, commencer par placer un tube à centrifuger stérile dans chaque godet d'une ultracentrifugeuse.Ensuite, ajoutez cinq millilitres de solution de saccharose filtrée et stérilisée, fraîchement préparée, au fond de chaque tube. Puis, très lentement, ajoutez 30 millilitres de la solution de VRS par-dessus la solution de saccharose, en prenant soin de ne pas perturber la solution de saccharose et de maintenir les couches bien distinctes. Ensuite, dans un cabinet de flux laminaire afin de préserver la stérilité, équilibrez soigneusement les six godets d'ultracentrifugation avec du PBS stérile à ± 0,1 gramme près les uns par rapport aux autres, bouchons inclus. Faites centrifuger le virus pendant 1,5 heure à 20 000 RCF et à quatre degrés Celsius.Ensuite, une fois la centrifugation terminée, utilisez une pince stérile pour retirer soigneusement les tubes de centrifugation des godets. Les particules virales auront traversé la couche de saccharose pour former un culot. Versez les tubes de centrifugation dans un flacon de déchets viraux et laissez-les s’égoutter à l’envers sur une surface stérile.Ne laissez pas le culot s'assécher complètement. Ensuite, faites couler soigneusement un millilitre de HPSS sur le culot et inclinez à nouveau le tube de centrifugation pour éliminer le HPSS. Puis retournez le tube à l'envers à nouveau, en prenant soin de ne pas laisser le culot s'assécher.Maintenant, resuspendre le culot 40 fois dans un autre millilitre de HBSS en prenant soin d'éviter la formation de bulles, car cela peut détruire le virus. Ensuite, congeler rapidement des aliquotes du virus dans de l'azote liquide. Conserver le virus à moins 80 degrés Celsius jusqu'à sa quantification et son utilisation ultérieure. Après avoir prélevé du sang dans des tubes EDTA de 10 millilitres auprès de volontaires sains, diluer le sang avec du PBS à température ambiante jusqu'à deux fois, pour un volume maximal de 35 millilitres de sang dilué dans un tube de 50 millilitres.Ensuite, fixez une aiguille stérile à verrouillage sur une seringue stérile de 50 millilitres, puis aspirez le milieu de gradient de densité dans la seringue. Placez l'aiguille au fond du tube contenant le sang dilué et pipetez soigneusement 15 millilitres de milieu de gradient de densité sous le sang, en maintenant une démarcation nette entre le gradient de densité et le sang. Séparez maintenant les cellules pendant 20 minutes à 800 ×g, à température ambiante, avec une accélération maximale et le frein désactivé. Après la séparation, les érythrocytes se trouvent dans le culot au fond du tube, avec une couche argentée de neutrophiles au-dessus.La couche claire située au-dessus du culot contient le milieu de gradient de densité, et la fine couche située entre ce milieu et la couche de plasma sanguin supérieure contient les PBMC. Utilisez une pipette Pasteur pour prélever soigneusement les PBMC, puis transférez les cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres placé sur de la glace. Ajoutez du PBS glacé jusqu'à un volume de 50 millilitres et centrifugez pour obtenir un culot cellulaire une fois la rotation terminée.Aspirez le surnageant et lavez le culot avec 50 millilitres de PBS glacé deux fois ; après le deuxième lavage, ajoutez un millilitre de milieu glacé au culot, comptez les cellules et ajustez la concentration cellulaire à cinq fois 10 à la puissance six PBMC par millilitre. Pour stimuler les PBMC avec le VRS vivant, ajoutez d'abord 100 microlitres de PBMC dans chaque puits d'une plaque de 96 puits à fond rond. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de deux stimuli fraîchement dilués à chaque puits.Incubez correctement la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 %CO2, puis centrifugez la plaque et récupérez le surnageant pour une analyse ultérieure par Eliza. Les PBMC stimulés présents dans le culot peuvent être analysés par QPCR ou colorés pour la cytométrie en flux. Lors de l'expérimentation de stimulation A-P-B-M-C, la méthode de fractionnement des stimuli est recommandée avec cette approche.Les conditions sont divisées en conditions de stimuli standards telles que le RPMI ou le VRS humain, et en conditions de fractions testées telles que le mial, le dipeptide ou le LPS. Il est important d'inclure systématiquement un contrôle négatif, tel que le RPMI seul, et un contrôle positif, tel que le LPS, dans chaque expérience. Après 24 heures de stimulation avec le VRS, différentes populations de PBMC présentent un taux d'infection dépendant de la dose ainsi qu'une différence dans l'efficacité d'infection par le VRS. Après 24 heures de stimulation avec le virus, une analyse par qPCR du niveau d'expression de la TNF alpha ou de l'interféron gamma dans les PBMC montre que le VRS induit une surexpression marquée de la transcription de ces deux cytokines inflammatoires. En revanche, la stimulation avec le mial, le dipeptide ou le LPS entraîne uniquement une faible expression d'ARNm.Lorsque les PBMC sont stimulés conjointement par le VSR et le dipeptide MIAL, on observe une forte régulation positive synergique. Les PBMC stimulés ont également été analysés pour leur production de TNF-alpha ou d'interféron gamma par ELISA. Contrairement aux observations au niveau transcriptionnel, le VSR est un faible inducteur de la sécrétion protéique de TNF-alpha et d'interféron gamma ; la stimulation des PBMC par le dipeptide MIAM entraîne la production de faibles quantités de TNF-alpha et d'aucun interféron gamma.À l'instar des analyses transcriptionnelles, à la fois le TNF alpha et l'interféron gamma présentent une uprégulation synergétique lors d'une co-stimulation avec le VRS et le dipeptide MIAM, utilisé comme témoin afin de déterminer si l'induction des cytokines dépend de la réplication du VRS. Les PBMC ont été stimulés par le VRS vivant ou inactivé par la bêta-propiolactone, comme illustré dans les graphiques ; à la fois le VRS vivant et le VRS inactivé induisent la production de cytokines pro-inflammatoires. N'oubliez pas que les expériences impliquant le VRS doivent être réalisées dans une hotte de sécurité biologique, en laboratoire de niveau de biosécurité 2.De plus, lors de la mise en œuvre de cette méthode, il est essentiel de se rappeler d'utiliser des réactifs et des matériaux exempts d'endotoxines tout au long de l'ensemble du protocole. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de stimuler les PBMC humains avec le VRS et de plusieurs tests pouvant être utilisés pour analyser la réponse immunitaire.

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