Complexes métalliques anticancéreux: Synthèse et évaluation de la cytotoxicité par le dosage au MTT

L’objectif global de cette procédure est de préparer des médicaments métallos anticancéreux et d’évaluer leur cytotoxicité par le test MTT. Ceci est accompli en synthétisant d’abord des composés anticancéreux à base de métaux. La deuxième étape consiste à préparer des plaques de cellules cancéreuses à 96 puits.

Ensuite, les composés anticancéreux à base de métaux sont insérés dans les cellules cancéreuses. La dernière étape consiste à mesurer la viabilité cellulaire par le test MTT, où la réduction de MTT par les enzymes mitochondriales et cytosoliques pour former du zen est mesurée en fin de compte l’activité anticancéreuse et la concentration inhibitrice demi-maximale. Ou je vois que 50 valeurs des composés sont déterminées.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car il s’agit d’une procédure en plusieurs étapes qui nécessite toute l’attention du travailleur de laboratoire et qui est soumise à un calendrier strict. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la préparation de la plaque cellulaire n’est pas simple, car travailler avec des cellules viables nécessite de suivre des directives particulières. En travaillant dans une boîte à gants, préparez le complexe de vanadium cinq en dissolvant 0,42 millimole du précurseur du ligand dans du THF sec.

Ensuite, ajoutez-le à une solution d’agitation de quantités équivalentes de vanadium ou d’oxyde de tris isop dans du THF. Mélangez le mélange réactionnel à température ambiante pendant 15 minutes avant d’éliminer les substances volatiles sous vide. Ensuite, ajoutez un hexane froid et retirez-le sous vide.

Une poudre violet foncé doit être obtenue dans un rendement quantitatif. Peser huit milligrammes du composé obtenu dans un flacon d’épi-orph. Pour préparer le complexe quatre titanesques, dissolvez 0,35 millimole du précurseur du ligand dans du THF sec et ajoutez-le à une solution d’agitation contenant des quantités équivalentes à des quantités d’oxyde de titane tétra-isop dans du THF.

Remuez le mélange réactionnel à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, retirez les volatiles sous vide pour donner un produit jaune dans un rendement quantitatif. Peser huit milligrammes du composé obtenu dans un flacon d’eph pour préparer des cellules HT 29 dans une première culture sur plaque de 96 puits.

Les cellules d’un ballon de 75 centimètres carrés, comme décrit dans le protocole de texte, retirent le milieu lorsque les cellules HT 29 atteignent leur coefficient de fluidité maximal. Après avoir lavé les cellules dans un millilitre de solution de trypsine EDTA, ajoutez un millilitre de la même solution et incubez pendant cinq minutes. Détachez les cellules HT 29 de la fiole et ajoutez 10 millilitres de milieu pour désactiver l’activité de la trypsine.

Transférez cinq millilitres du mélange cellulaire dans un tube. À l’aide d’une pipette, transférez quelques gouttes du mélange cellulaire dans une contre-chambre. La contre-chambre comprend deux parties de cinq carrés sur cinq.

Comptez les cellules dans cinq carrés représentatifs de chaque partie à l’aide d’un microscope. Quatre carrés dans les coins et un carré au milieu. Calculez le nombre estimé de cellules présentes.

Additionnez les cellules des cinq carrés représentatifs de chaque partie. Calculez la somme moyenne des deux parties et divisez par 20. Ensuite, divisez 0,6 par le quotient.

Le nombre reçu est la quantité de mélange de cellules nécessaire par plaque. Ce calcul se réfère à une plaque qui contient 9 000 cellules par puits. À l’aide d’une pipette, mélanger la quantité de mélange cellulaire requise par plaque avec 13,2 millilitres de milieu.

Ajouter le mélange dans une assiette à 96 puits. À l’aide d’une pipette à 11 canaux à 200 microlitres par puits sur six lignes contenant 66 puits au total. Un puits de chaque ligne doit rester vide pour le contrôle à vide.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour permettre aux cellules de se fixer à la plaque pour insérer les composés en premier, ajoutez 200 microlitres de THF sec à huit milligrammes de composé en poids. Diluez davantage la solution composée en ajoutant d’abord 60 microlitres de THF dans neuf fichiers einor différents. Pour chaque solution, à l’aide d’une pipette, transférez 60 microlitres de la solution composée à la première lime einor.

Ensuite, réanimez, suspendez et transférez 60 microlitres dans le flacon suivant et ainsi de suite jusqu’à ce que 10 concentrations différentes soient obtenues. Procéder à la dilution de 20 microlitres de chaque concentration dans le THF avec 180 microlitres de milieu. Préparez également une solution de contrôle de solvant uniquement en ajoutant 20 microlitres de THF à 180 microlitres de milieu.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de chaque solution résultante dans chaque puits. Celui-ci contient déjà 200 microlitres de la solution de cellules susmentionnée dans le milieu pour donner des concentrations finales du composé allant jusqu’à 200 milligrammes par litre. Chaque ligne contient des cellules traitées avec le composé à 10 concentrations différentes.

L’un, le puits témoin contenant des cellules traitées avec un solvant uniquement et l’autre puits sans cellules. Pour le contrôle à blanc, configurez les lignes pour répéter chaque mesure du composé trois fois. Incuber la plaque chargée pendant trois jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone. Préparez la solution MTT comme décrit dans le protocole texte à l’aide d’une pipette à 11 canaux.

Ajoutez 20 microlitres de solution MTT dans chaque puits, à l’exception des puits de contrôle vierges. Incuber la plaque pendant trois heures supplémentaires après l’incubation. Retirez la solution moyenne de chaque puits et ajoutez 200 microlitres d’isopropanol dans chaque puits.

Pour dissoudre le formin, remuez l’assiette pendant 30 minutes jusqu’à ce qu’elle soit homogène. Mesurer l’absorbance à 550 nanomètres pour 200 microlitres de la solution homogène par un lecteur de microplaques, spectrophotomètre répétant chaque mesure sur trois jours différents. Ensuite, calculez le pourcentage de viabilité cellulaire en déduisant la valeur d’absorbance du témoin à blanc de la valeur mesurée, en divisant le résultat par l’absorbance de la valeur de contrôle du solvant THF et en multipliant par 100 %Calculez les valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale à l’aide d’un logiciel graphique.

La CI 50 rapportée est la moyenne de toutes les valeurs CI 50 collectées sur au moins trois jours différents, et la valeur d’erreur est l’écart type. Les données reçues de l’essai MTT sont analysées afin d’évaluer la cytotoxicité du composé. Les mesures doivent être effectuées sur une plage de concentrations qui produira un graphique affichant une distribution de points pairs : au moins trois points sur chaque plateau et trois points pour définir la pente.

Des mesures insuffisantes à des concentrations élevées ou à de faibles concentrations nuiront à l’ajustement de régression non linéaire de la courbe nécessaire à la détermination des valeurs de CI 50 et, par conséquent, diminueront leur précision. Les valeurs relatives de CI 50, déterminées par l’ajustement de régression non linéaire, correspondent aux concentrations conduisant à 50 % de l’inhibition de la croissance cellulaire possible par le composé testé. Il s’agit du point médian entre la viabilité cellulaire maximale et minimale mesurée, qui ne sont pas nécessairement de 100 % et 0 % respectivement.

Lors de l’inspection des résultats des expériences décrites dans le protocole. Il est clair que le cisplatine ainsi que les complexes de titane et de vanadium sont très actifs. Il est également à noter que plus la valeur d’inhibition maximale d’un composé donné est proche de 100 %, plus la valeur relative de la CI 50 est proche de la valeur absolue lorsque l’on compare les valeurs de la CI 50 entre les différents composés.

Le complexe quatre titane a la cytotoxicité la plus élevée et ses valeurs IC 50 sont inférieures à celles du cisplatine et du complexe cinq vanadium. Cependant, le ligand libre présente une activité nettement réduite depuis l’ajout du ligand à différentes concentrations. La viabilité cellulaire ne diminue pas aussi significativement que pour ses complexes.

Cela garantit que la haute activité anticancéreuse des complexes repose sur les centres métalliques lors de la tentative de cette procédure. Il est important de maintenir des conditions stériles en tout temps. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la cytotoxicité de vos composés anticancéreux par le M-T-T-S-A.