Name: In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez le suivi cellulaire in vivo par IRM 19F dans un modèle murin avec des cellules marquées ex vivo. Cette méthode permet d'imager et quantifier les cellules marquées en clinique et préclinique.

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Nous tenons à remercier Nadine Henn et Arend Heerschap pour leur aide précieuse. Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut néerlandais de la médecine régénérative (de NIRM, FES0908), le programme ENCITE FP7 (SANTÉ-F5-2008-201842) et TargetBraIn (SANTÉ-F2-2012-279017), une subvention de la Fondation Volkswagen ( I/83 443), l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (VENI 700.10.409 et 917.76.363 Vidi), ERC (Advanced Grant 269019), et l&#39;Université Radboud de Nijmegen Medical Centre (AGIKO-2008-2-4).

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts à divulguer.

Le protocole décrit ici décrit la procédure générale de vivo 19 F IRM suivi de la cellule. En dépit de la méthode de co-incubation décrite, il existe plusieurs protocoles différents pour marquer les cellules avec un agent de F 19. Cependant, la co-incubation est le plus souvent utilisé, et peut être en outre optimisée par exemple par addition d&#39;agents de transfection 6. Le protocole actuel de marquage cellulaire dépendra du type de cellule. Seuls les étapes clés en ...

Dans le suivi de la cellule in vivo est essentiel pour l&#39;optimisation et le suivi des thérapeutiques cellulaires 1. En raison de sa nature non invasive, l&#39;imagerie offre d&#39;excellentes possibilités de suivre des cellules in vivo. Imagerie par résonance magnétique (IRM) est indépendant de rayonnements ionisants et permet une résolution d&#39;image supérieure et intrinsèque contraste des tissus mous. Suivi de la cellule à base d&#39;IRM a déjà été utilisé cliniquement pour suivre les cellules dendritiques dans deux patients atteints de mélanome. IRM clinique conventionnel est réalisé sur le noyau 1 H, mobiles présents dans l&#39;eau dans les tissus. Il est également possible d&#39;effectuer l&#39;IRM sur d&#39;autres noyaux actifs, tels que 13 C, 19 F et 23 Na. Cependant, seulement 19 F IRM a été appliquée avec succès à vivo suivi dans la cellule car il offre la sensibilité la plus élevée après 1 H. L&#39;absence de l&#39;IRM détectable endogène 19 F dans les tissus permet signal haute sélectivité pour lala détection d&#39;agents de contraste exogènes 19 F et permet la quantification de la concentration de fluor directement à partir des données d&#39;image. Pour une discussion détaillée sur 19 F IRM, voir 3-5. Une question clé avec 19 F IRM est la nécessité de développer et d&#39;optimiser les étiquettes de cellules 19 F appropriés, bien que plusieurs étiquettes ont été développés, avec une tendance à des agents multimodaux 6. Le protocole que nous décrivons ici est basée sur des études par nos groupes 7-9, y compris les premiers articles qui décrivent in vivo quantitative 19 cellules à base de l&#39;IRM F suivi 10,11. Le mode opératoire général de cheminement de cellules en utilisant 19 F IRM est résumée sur la figure 1. Nous décrivons un protocole général pour l&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dendritiques (CD) en utilisant un contraste perfluorocarbonée agent de sur-mesure 8. Le protocole d&#39;imagerie est généralement applicable à différents types de cellules, des étiquettes et des modèles animaux. Latype de cellule et l&#39;animal modèle décrit ici ne doit être considéré comme un exemple, et donc nous ne fournissons pas de détails sur l&#39;isolement cellulaire et l&#39;étiquetage, mais plutôt se concentrer sur le protocole d&#39;imagerie. Modifications seront nécessaires pour chaque étiquette, le type de cellule, modèle animal, et l&#39;installation d&#39;imagerie, et ceux-ci peuvent être trouvés dans la littérature ou peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé par les chercheurs. Certaines modifications communes sont incluses dans la discussion.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MFCD00131855</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine (Ketavet)</td><td>Pfizer</td><td>778-551</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>QN05 cm92</td><td></td></tr><tr><td>Ophtosan </td><td>Produlab Pharma</td><td>2702</td><td>pommade oculaire</td></tr><tr><td colspan="4">Nom du matériau </td></tr><tr><td>Scanner IRM</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre RMN</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo 19 f irm pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F IRM permet le suivi de la cellule quantitative sans l&#39;utilisation des rayonnements ionisants. Il s&#39;agit d&#39;une technique non invasive qui peut être appliquée à l&#39;homme. Ici, nous décrivons un protocole général pour le marquage cellulaire, l&#39;imagerie et le traitement d&#39;image. La technique est applicable à différents types cellulaires et des modèles animaux, mais ici nous nous concentrons sur un modèle de souris typique pour le suivi des cellules immunitaires de souris. Les questions les plus importantes pour le marquage cellulaire sont décrites, qui sont applicables à tous les modèles. De même, les paramètres d&#39;imagerie sont répertoriés clés, bien que les détails peuvent varier en fonction du système d&#39;IRM et de la configuration individuelle. Enfin, on inclut un protocole de traitement d&#39;image pour la quantification. Variations pour cela, et d&#39;autres parties du protocole, sont évalués dans la section Discussion. Sur la base de la procédure décrite ici en détail, l&#39;utilisateur devra s&#39;adapter au protocole spécifique pour chaque type de cellule, l&#39;étiquette de la cellule, modèle animal, et la configuration de formation d&#39;image. On notera que le protocol peut également être adapté pour une utilisation humaine, aussi longtemps que les restrictions cliniques sont remplies.

Ici, nous montrons les résultats typiques pour un protocole impliquant le transfert de cellules 19 marquées F-tête chercheuse à un ganglion lymphatique de drainage. Figure 2 montre un spectre de RMN 19 F 10 6 cellules marquées à l'aide d'une référence de TFA. L'installation d'imagerie a été effectuée comme décrit dans le protocole (Figure 3). Pour l'imagerie in vivo, nous avons utilisé une référence constituée d'un cylindre fermé de la même étiq...

Nous décrivons un protocole général pour le suivi in vivo de cellules à l&#39;aide de l&#39;IRM dans un modèle de souris ex vivo avec des cellules marquées. Un protocole typique pour le marquage de cellules, le traitement d&#39;acquisition d&#39;image et la quantification est inclus.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

L’objectif global de cette procédure est d’imager et de quantifier le nombre de cellules marquées au 19 F in vivo à l’aide de 19 FMRI. Cela peut être fait dans un cadre clinique ou préclinique. Pour ce faire, il faut d’abord marquer les cellules avec un agent 19 F approprié.Cela se fait le plus souvent ex vivo. La deuxième étape consiste à quantifier la teneur en 19 F par cellule, ce qui peut être fait en utilisant 19 F et MR avec une référence connue. La teneur en 19 F par cellule est supposée rester constante pendant l’expérience, sinon des facteurs de correction doivent être calculés.Ensuite, le sujet est imagé in vivo à l’aide d’un H et d’un FMRI 19 pour localiser les cellules marquées transférées. Une référence connue et des paramètres d’imagerie appropriés sont essentiels pour la quantification à partir des données d’image. La dernière étape consiste à traiter les données de l’image pour calculer le nombre de cellules.L’histologie ex vivo ou d’autres techniques peuvent être utilisées pour corroborer les données dans la mesure du possible. En fin de compte, 19 FMRI pour le suivi cellulaire in vivo peut être utilisé pour étudier les cellules transférées en termes de localisation et de nombre sur une période de temps pertinente, compte tenu de certaines hypothèses décrites dans le texte. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles qu’une HMRI utilisant des marqueurs de cellules super paramagnétiques, est qu’il n’y a pas de signal de fond confondant et que le nombre de cellules peut être déterminé directement à partir des données d’image.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des thérapies cellulaires, telles que l’emplacement des cellules et leur nombre à différents moments. Pour commencer ce protocole, ajoutez d’abord un marqueur 19 F aux cellules dendritiques immatures à une concentration de quatre milligrammes pour 1 million de cellules dans deux millilitres de milieu. Puis remuez doucement pour mélanger.Ensuite, incubez les cellules dendritiques avec l’étiquette pendant trois jours avant de mûrir et de récolter. Ensuite, collectez les cellules et retirez l’excédent d’étiquette en lavant au moins trois fois. Dans le comptage du PBS, les cellules résultantes sont ensuite remises en suspension dans un petit volume de PBS pour l’injection ou des tests supplémentaires.Notez que le protocole décrit ici est pertinent pour ces cellules dendritiques spécifiques et le marquage. Par conséquent, un protocole pour un autre type de cellule devra soit être trouvé dans la littérature, soit optimisé par le chercheur. Placez un nombre connu de cellules marquées dans un tube RMN.Ajoutez ensuite 10 microlitres de 5 % de fluor tri ou d’acide acide, ou TFA. Si la fréquence de résonance du TFA n’est pas adaptée en raison d’un chevauchement avec l’étiquette, utilisez un autre composé soluble. Placez un échantillon dans un spectromètre RMN et obtenez le spectre du fluor 19.Calculez ensuite les aires relatives sous les pics de la référence et de l’échantillon ou du pic principal de l’échantillon, puis calculez le nombre moyen de fluors par cellule de l’échantillon. Notez que l’ensemble de ce processus doit être répété en moyenne pour atteindre une signification statistique. Cela peut également être fait à l’aide de la spectroscopie directement sur l’appareil d’IRM.Notez également que cette procédure ne révèle que la charge moyenne en fluor 19 pour un grand nombre de cellules, et non la variabilité entre les cellules. Le contrôle de l’uniformité de l’absorption cellulaire nécessite la présence d’un composant fluorescent avec l’agent 19 F. Ici, seul le scénario trois montre un marquage homogène des cellules, bien que cela soit toujours supposé dans les calculs, cela peut être vérifié à l’aide de techniques complémentaires telles que la microscopie configurée pour l’imagerie en plaçant une souris entièrement anesthésiée dans un berceau et en l’immobilisant pour empêcher tout mouvement pendant le balayage.Connectez également le contrôle de la température et de la respiration pour une surveillance physiologique pendant le balayage. Si nécessaire, placez une référence externe à côté de l’animal, la référence et la région d’intérêt doivent être au centre de la bobine. Commencez l’acquisition par une IRM protonique conventionnelle comme référence anatomique pour l’imagerie 19 F.Ensuite, réglez le système sur la fréquence 19 F du marqueur cellulaire et effectuez un balayage 19 FMRI. Idéalement, le balayage 19 FMRI aura le même champ de vision et la même sélection de coupe qu’une IRM conventionnelle, bien que probablement avec une résolution inférieure. Ensuite, déterminez le gain d’impulsion de référence de 19 F à l’aide de la formule présentée ici et acquérez un spectre de 19 FNMR pour déterminer la fréquence de 19 F.Estimer le facteur C dépendant de la bobine de radiofréquence dans une expérience in vitro distincte. L’utilisation d’une bobine de radiofréquence avec un profil B homogène tel qu’une bobine de surface peut entraver la quantification des données 19 F. Étant donné que le signal dépend non seulement de la concentration de 19 F, mais également de la distance de la bobine.Par conséquent, acquérez une carte B un sur le canal H pour corriger rétrospectivement les données 19 F. Cela nécessite que les profils de bobine H et 19 F soient identiques, à l’exception du facteur de proportionnalité C, et qu’un signal de fond suffisant d’un H soit fourni dans les régions de 19 F. Ici, nous voyons des cartes d’angle de retournement des tubes avec TFA dans l’eau acquises au canal H et 19 F. Pour corriger les données 19 F, procurez-vous d’abord une carte d’angle de retournement d’un H avec la méthode de deux angles de retournement.Utilisez un balayage par écho de gradient avec un TR très long étant supérieur à trois fois à un HT avec un angle de retournement estimé d’un peu moins de 90 degrés près de la bobine. Ensuite, obtenez un deuxième balayage par écho de gradient avec deux fois l’angle de retournement du premier balayage. Calculez l’angle de retournement alpha d’un H aux niveaux X, Y, Z via le signal et le sens du premier et du deuxième dégradé balayés par ECHO.L’angle de retournement de 19 F sera identique, à l’exception du facteur un C dû aux profils B proportionnels un, l’atténuation de l’intensité du signal de 19 F à partir d’une séquence d’écho de spin avec excitation, angle de retournement alpha, refocalisation de l’angle de retournement deux alpha pendant la réception du signal, est visible à l’écran ici. L’atténuation due à une excitation imparfaite est observée ici. Ensuite, l’atténuation globale peut être calculée.Notez qu’il est normalisé à un dans le cas d’un angle de retournement de refocalisation parfait de 90 degrés, d’excitation de 180 degrés, d’un angle de retournement de 180 degrés, d’un angle de retournement de 19 F, d’une intensité de signal d’image de 19 F, d’une intensité de 19 F, d’une intensité de 19 degrés et d’une intensité, d’une intensité de 19 F, d’une intensité, d’une intensité, d’une intensités de signal d’image, d’une intensité de signal d’image, d’une intensités de 19 F, d’une valeur de 19 F, d’une correction de l’image, sont calculées via cette formule pour créer des images de superposition d’une image H Exportez les données de l’image et ouvrez les fichiers dans un programme de traitement d’image tel que l’image J, appliquez des ajustements d’image si nécessaire, en veillant à ce que les ajustements restent les mêmes pour toutes les images. Ensuite, rendez les 19 images F en fausses couleurs, puis superposez sur les images H correspondantes.Afin de localiser le signal, sélectionnez l’image de magnitude 19 F avec les cellules appropriées et les ROI de dessin visibles de référence sur les cellules pertinentes, la référence et une région à l’extérieur du sujet pour la valeur de bruit indiquée dans l’échantillon. Notez qu’ici, le balayage anatomique one H est montré pour plus de clarté. La proportionnalité simple et la valeur de 19 F par cellule peuvent ensuite être utilisées pour estimer le nombre de cellules dans le ROI.Ces images sont issues des résultats typiques d’un protocole impliquant le transfert de cellules marquées au 19 F vers un ganglion lymphatique drainant. Ici, nous voyons un spectre de 19 FNMR de 1 million de cellules marquées à l’aide de la référence A TFA, et ici nous voyons une image traitée représentative pour l’imagerie in vivo. Une référence constituée d’un contenant scellé de la même étiquette que celle utilisée pour les cellules a été placée entre les pieds de la souris.En appliquant le protocole décrit, nous avons calculé un nombre de cellules d’environ 1,2 million sur la base de l’image brute de magnitude 19 F. L’image 19 F est superposée en fausses couleurs sur l’image anatomique du proton en échelle de gris. Lors de la mise en place d’une nouvelle expérience, il est important de valider le fluor.Résultats de l’IRM avec l’histologie, l’imagerie optique ou d’autres méthodes. Par exemple, il est important de noter que le marquage au fluor peut rester dans les tissus lorsque les cellules meurent et entraîner un signal faussement positif.

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