Name: Essai in vitro pour évaluer limpact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Apprenez un essai in vitro pour évaluer l'impact des voies immunorégulatrices sur la fonction effectrice des cellules T CD4 spécifiques au VIH. Cette méthode permet d'analyser la sécrétion de cytokines et la restauration de la fonction immunitaire.

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Nous remercions Gordon Freeman pour fournir l&#39;anticorps bloquant anti-PD-L1. Nous remercions le personnel clinique et de laboratoire à l&#39;Hôpital général du Massachusetts et tous les participants à l&#39;étude pour leur rôle inestimable dans ce projet. Cette étude a été financée par l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health (SP1 AI-080192; DEK), le coeur-poumon National and Blood Institute des National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK est soutenu par une bourse de carrière bourse de recherche du Fonds de recherche en santé du Québec (FRQS). FP est soutenu par une subvention de la communion de l&#39;Assemblée générale Comité exécutif Hôpital Massachusetts sur la recherche et le Global Health Institute de Harvard (HGHI).

Une. L&#39;épuisement et l&#39;isolement des PBMC par Ficoll séparation <ol><li> Épuiser les cellules T CD8 + en ajoutant humain CD8 + Depletion Cocktail à 50 ul / ml de sang entier. </li><li> Bien mélanger et incuber pendant 20 min à température ambiante (18-25 ° C). </li><li> Après incubation, mélanger le sang total avec HBSS (solution saline équilibrée de Hank sans Ca 2 + ou Mg 2 +) et couche sur Histopaque. Tourner à 340 rcf pendant 30 min (pas de frein, accélération lente). </li><li> Recueillir les CMSP et transférer à une nouvelle conique de 50 ml. Laver 2 fois avec 45 ml de RPMI 1640 supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1% de HEPES et en faisant tourner pendant 10 min à 340 rcf. </li></ol> 2. Blocus d&#39;anticorps et de stimulation spécifique de l&#39;antigène des cellules <ol><li> Resuspendre les cellules à 2x10 6 pour la condition dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum humain supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% de HEPES,représentant 500 pi par état. </li><li> Aliquote de 500 ul de suspension cellulaire par FACS tube. </li><li> En fonction de la voie d&#39;une enquête, ajouter PD-L1, l&#39;IL-10Rα anticorps de blocage et / ou des contrôles isotypiques à 10 ug / ml et incuber pendant 15 min à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Stimuler les cellules avec une piscine de peptide Gag VIH-1 à 1 pg / ml / peptide concentration finale. Inclure aussi un contrôle &quot;pas de stimulation&quot; pour chaque condition de blocage. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures. </li></ol> 3. Collecte et analyse de surnageant <ol><li> Après 48 heures, centrifuger les tubes FACS pendant 7 minutes à 340 FCR. </li><li> Recueillir soigneusement les 2 x 225 pi surnageant dans des tubes Eppendorf pour Luminex arrangements de billes sans perturber le culot. </li><li> Inactiver les virus dans le surnageant recueilli avec 25 ul de 0,5% de PBS-Tween pour donner une concentration finale de 0,05% de PBS-Tween. </li><li> Magasin recueillies surnageants qui ne sont pas immediately utilisé dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Mesurer les concentrations de cytokines souhaitées en utilisant le kit Millipore Luminex selon le protocole du fabricant. </li></ol> 4. Collecte et Analyse phénotypique des cellules par cytométrie en flux <ol><li> Après avoir recueilli le surnageant, laver les cellules dans 3 ml de PBS. Spin cellules pendant 7 minutes à 340 FCR et décanter excès lavage. </li><li> Teinture de viabilité en utilisant un kit portable de Stain mort Vivant / Mort peut être fixée selon le protocole du fabricant. </li><li> Laver les cellules dans du PBS pendant 7 min à 340 rcf et à 4 ° C. Remettre en suspension dans 100 ul de PBS 1% de FBS. </li><li> Si la coloration pour les monocytes ou d&#39;autres cellules présentatrices d&#39;antigènes, les récepteurs de Fc bloc en ajoutant 1,4 ul de réactif de blocage des FcR et vortex pour mélanger. </li><li> Incuber pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter les anticorps de surface, les vortex, et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS, décanter excès de lavage, et ajouter 200 ul paraformaldéhyde 4%. Incuberà la température ambiante pendant 20 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS, remettre en suspension dans 250 ul de PBS 1% de FBS, et d&#39;acquérir une multilaser cytomètre de flux (par exemple BD LSRII ou Fortessa). </li></ol> 5. Analyse des cellules par qRT-PCR <ol><li> Pour les cellules non analysé par cytométrie de flux: après la collecte de surnageant, lyser les cellules dans 300 ul de tampon RLT Qiagen contenant 1% de bêta-mercaptoéthanol. Si ce n&#39;est pas en continuant avec le protocole, les cellules peuvent être congelées à -80 ° C après ce point. </li><li> Isoler l&#39;ARN en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ARN en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Synthétiser un ADNc à partir d&#39;ARN en utilisant un kit de synthèse d&#39;ADNc en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Faire la PCR quantitative en utilisant la technologie SYBR Green. </li><li> Création d&#39;un mélange d&#39;amorces pour chaque amorce utilisée, y compris des gènes domestiques (par exemple, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) par l&#39;addition d&#39;amorces à la nucléase sans eau pour donner une concentration finale de 10uM. Garder sur la glace. </li><li> Créer un mélange maître pour chaque amorce en ajoutant 10,5 pi d&#39;eau sans nucléase, 12,5 pi SYBR vert, et 1 pi mélange d&#39;amorces par plaque bien. Garder sur la glace. </li><li> Pipette 24 ul mélange maître dans chaque puits de la plaque qui sera utilisé. </li><li> Ajouter 1 ul d&#39;ADNc à chaque puits selon modèle. </li><li> Cap puits et la plaque de centrifuger 3 min à 800 rcf. </li><li> Exécutez plaque sur une machine qRT-PCR, par exemple, un instrument Stratagene MX3005P. </li></ol> 6. Adaptation pour intracellulaire de cytokines coloration à 48 h Ajouter Brefeldin monensin et 6 heures avant la coloration des cytokines intracellulaires. Brefeldin est ajouté à une concentration de 10 ug / ml tandis que la monensine est ajoutée selon les instructions du fabricant. Pour plus de commodité, la Bréfeldine peut être ajouté 12 heures avant la teinture, à une concentration de 5 pg / ml. <ol><li> Après coloration de surface, laver les cellules avec du PBS 1% de FBS et tache danscytokines intracellulaires telles que l&#39;IL-12, IFN-γ et TNF-α en utilisant un kit de fixation / perméabilisation de solutions et de protocole. </li><li> Laver les cellules, remettre en suspension dans 250 ul de PBS 1% de FBS, et fonctionner sur un multilaser cytomètre de flux (par exemple BD LSR II ou Fortessa). </li></ol> 7. Adaptation pour le tri des cellules <ol><li> 16 heures après la stimulation, la tache pour la viabilité cellulaire en utilisant le kit de Stain mort Vivant / Mort peut être fixée selon le protocole du fabricant. Gardez les cellules sur la glace durant la procédure entière. </li><li> Laver les cellules avec du PBS pendant 7 min à 340 rcf et à 4 ° C. Remettre en suspension dans 100 ul de PBS 1% de FBS. </li><li> Ajouter des anticorps de surface, vortex pour mélanger et incuber les cellules sur la glace dans l&#39;obscurité pendant 20 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS à 340 rcf et à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul de milieu RPMI 1640 froid contenant 10% de sérum bovin foetal supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% HEPES. </li><li> cellules de filtrage à l&#39;aide de 5 ml Polystyrene Tube à fond rond avec bouchon Cell-passoire. </li><li> Préparer des tubes de collecte pour trier par addition de 200 ul de milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum bovin foetal supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% de HEPES à chaque tube. Conservez tous les tubes sur la glace pendant le tri. </li><li> Trier en direct les sous-ensembles de cellules d&#39;intérêt sur ​​un instrument (par exemple BD FACS Aria II) situé dans un établissement équipé pour matières infectieuses. </li><li> Après que les cellules ont été triées, place des cellules dans l&#39;incubateur pour la durée souhaitée et suivre l&#39;analyse collection surnageant / Luminex et d&#39;analyse collecte de culot cellulaire / PCR. </li></ol>

<ol><li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li>
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<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8%2B+T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).</li>
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<li>Barber, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+function+in+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Nature. 439, 682-687 (2006).</li>
<li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8%2B+T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li>
<li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li>
<li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

collecte de surnageant est une composante essentielle de cette conception expérimentale. Lors de la récolte des surnageants pour l&#39;analyse Luminex, des aliquotes ont été établis et conservés à -80 ° C pour éviter la dégradation des protéines en raison de cycles gel-dégel. La congélation et la décongélation peut être processus rigoureux pour les protéines, et en minimisant gel-dégel, le signal sera maximisé dans les essais. Par conséquent, il est plus facile d&#39;obtenir des données plus précises et reproductibles l...

Au cours des infections virales persistantes, les cellules-T spécifiques virus acquièrent des défauts fonctionnels dans un processus connu sous le nom T épuisement cellulaire. Au début des études in vivo dans le modèle de LCMV murin d&#39;infection virale chronique ont indiqué que les cellules T spécifiques du virus épuisés ont réduit la fonction cytolytique contre les cellules infectées par un virus, perdent leur capacité à proliférer et à présenter une capacité réduite à produire des cytokines telles que l&#39;IL-2, TNF- α et IFN-γ 1,2. Un réseau complexe de voies immunorégulateurs, tels que PD-1 et l&#39;IL-10, sont régulés à la hausse au cours des infections chroniques et de contribuer à un dysfonctionnement des cellules T (revue dans 3,4). Administration in vivo d&#39;anticorps bloquants contre ces voies inhibitrices chez la souris de LCMV modèle de fonction des cellules T spécifiques du virus épuisés et amélioré la clairance virale rétablie, ce qui indique que l&#39;épuisement de cellules T est un phénomène partiellement réversible (revue dans 5). Conclusions sur ee modèle de LCMV ont été rapidement étendu à des infections virales chroniques humaines telles que le VHB, le VHC et le VIH 5. Dans chronique par le VIH-1 infection, PD-1 et IL-10 sont régulés à la hausse dans les voies sujets infectés et en corrélation avec les paramètres de la progression de la maladie, directement avec la charge virale et inversement proportionnelle à la numération des CD4 8.6. Blocage des anticorps PD-1 ou l&#39;IL-10 in vitro des voies restauré la prolifération des cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH, indiquant que, comme dans le modèle de la souris LCMV, T épuisement des cellules chez l&#39;homme est un phénomène partiellement réversible. Toutefois, en raison de la nature délicate des expériences sur des échantillons humains ainsi que les limites de la sensibilité des tests in vitro, étude approfondie des profils de restauration fonctionnelle obtenus par ces interventions est frappante absent. Les tests de prolifération ont été, jusqu&#39;à présent, le seul test fiable in vitro testé dans la plupart des études, mais il ya un manque remarquable de preuves sur l&#39;impact de ces interventionsinterventions sur: 1) la capacité de destruction des cellules T cytotoxiques, 2) l&#39;effet antiviral des lymphocytes T sur la réplication virale, 3) le profil de sécrétion des cytokines, et 4) l&#39;effet sur CD4 aide des lymphocytes T sur d&#39;autres sous-ensembles de cellules. Coloration intracellulaire des cytokines (ICS) est un courant très utile et largement utilisé dosage basé sur une cytométrie qui est utilisé pour détecter la production de cytokines dans divers types de cellules chez les souris et les humains. Il a également été utilisé pour étudier l&#39;effet de l&#39;anticorps au blocage des voies inhibitrices. Dans les dosages de l&#39;ICS, la sécrétion de cytokines est bloquée par l&#39;addition de Brefeldin et / ou de monensin. Les cytokines piégées à l&#39;intérieur des cellules sont ensuite détectés avec des anticorps fluorescents en utilisant la cytométrie en flux polychromatique. La durée de l&#39;essai est généralement limité à 6 ou 12 h après la stimulation antigénique puisque les deux Brefeldin et monensine, qui sont typiquement ajoutés en 2 heures de l&#39;addition de l&#39;antigène, sont toxiques pour les cellules. Le dosage des ICS est une technique puissante qui a été i utilesn l&#39;investigation de l&#39;effet de l&#39;administration in vivo d&#39;anticorps de blocage intervention chez les souris où les cellules ont été extraites, après une certaine période de temps après l&#39;exposition de l&#39;anticorps 9. Cependant, il existe plusieurs limitations à l&#39;application de cette approche expérimentale pour évaluer l&#39;impact de blocage des récepteurs inhibiteurs dans les échantillons humains. Lors d&#39;interventions d&#39;anticorps de voies inhibitrices dans une stimulation 6 ou 12 heures in vitro (typiquement le cas avec des échantillons humains), le blocage des récepteurs inhibiteurs dans la plupart des cas, ne modifie pas la fréquence de la réponse des cellules T spécifiques de l&#39;antigène, mesurée par des dosages de l&#39;ICS standards 6, 7. Les mesures de la production de cytokines par des cellules, mesurée par l&#39;intensité moyenne ou la médiane de fluorescence ont donné des résultats incohérents 6, 7, 10. D&#39;autre part, lorsque ICS est effectuée à un point de temps après la fin de la stimulation (par exemple six jours), les changements dans le nombre de cytokine sécrétant caunes peuvent être observées. Les différences sont un effet combiné de la prolifération altérée, la survie et l&#39;évolution de la fonction d&#39;effecteur qui s&#39;accumulent au cours de la période de temps spécifiée 6. Une façon de surmonter une partie de ces limitations est à incuber pendant de longues périodes de temps (par exemple 36 h, 60 h, etc.) Avec l&#39;antigène avant l&#39;ajout de l&#39;inhibiteur de sécrétion des cytokines sans attendre à la prolifération de se produire. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour déterminer la cinétique de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH 11,12, mais cette approche n&#39;est pas en mesure de détecter des réponses petites et ne donnera pas un résultat intégré de la sécrétion de cytokine totale survenant car la stimulation. Par conséquent, ICS n&#39;est pas une méthode suffisamment sensible pour détecter l&#39;impact de blocage des voies inhibitrices de la quantité de cytokines produites par les cellules T activées par rapport à la quantification de l&#39;ARNm de cytokines ou des mesures de la sécrétion de cytokines dans le supernatant aux mêmes points dans le temps. En outre, la plupart des cytokines produites par les lymphocytes T activés agissent de façon autocrine, en contribuant à la rétroaction positive ou négative par une interaction avec des boucles de cellules présentatrices d&#39;antigène. Par conséquent, l&#39;addition de Brefeldin monensin ou au cours de l&#39;essai de ICS empêche la sécrétion de cytokines et donc la stimulation des cellules T n&#39;est pas optimale. Enfin, la détection de multiples cytokines avec ICS est limitée par la disponibilité d&#39;anticorps et de la sensibilité pour la détection des cytokines avec la cytométrie de flux, ainsi que par des contraintes dans le nombre des fluorochromes qui peuvent être utilisés simultanément dans n&#39;importe quel panneau donné. Nous avons développé une approche très sensible in vitro expérimentale pour évaluer l&#39;impact des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH et par la suite CD4 aide à cellules présentatrices d&#39;antigène (CPA) et les cellules tueuses naturelles (cellules NK). Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer l&#39;impact de blocus de molécules inhibitrices de la fonction des cellules T CD8 par épuiser les cellules de PBMC T CD4 ou en stimulant des peptides optimales reconnues uniquement par les cellules T CD8. Contrairement à intracellulaires dosages de cytokines de coloration, nous avons décidé de ne pas interférer avec la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH afin d&#39;être en mesure de: 1) réaliser une quantification plus précise des niveaux de cytokines produites; 2) étudier un panel plus large des cytokines ou des molécules effectrices, et 3) évaluer l&#39;impact de cytokines produites par les cellules T CD4 spécifiques du VIH sur les autres sous-ensembles de cellules. On stimule CD8 PBMC déplétées avec une piscine Gag du VIH-1 de peptide, en présence d&#39;anticorps bloquants pour la voie immunorégulateur d&#39;intérêt. Après le temps désiré d&#39;incubation, généralement 48 heures, nous recueillons les surnageants de mesurer la sécrétion de cytokines avec des tableaux de perles et de recueillir les culots cellulaires soit pour l&#39;analyse phénotypique des différents sous-ensembles de cellules ou pour l&#39;analyse de la transcription. De noter, à tson article 48, point de temps h, on ne détecte pas une population significative de la prolifération des cellules T 12. Il s&#39;agit d&#39;une approche souple et plusieurs adaptations de cette conception peut être appliquée pour répondre à différentes hypothèses. Par exemple, les sous-ensembles de cellules individuelles (telles que des cellules T CD4 spécifiques du VIH ou de PD-1 des cellules de haute T CD4, etc.) Peuvent être triées après 12 h d&#39;incubation avant incubation supplémentaire pendant 36 heures puis on a recueilli les surnageants et les culots de cellules d&#39;enquêter plus spécifiquement l&#39;impact des interventions du blocus sur la sécrétion de cytokines par les sous-populations définies de CMSP.

<table><tbody><tr><td>Solution saline équilibrée Hanks sans Ca2+ ou Mg2+</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Sérum humain AB</td><td>Gemini BioProducts</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Mediatech</td><td>30 001 CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Mediatech</td><td>25 005 CI</td><td></td></tr><tr><td>Tampon HEPES</td><td>Mediatech</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>Réactif bloquant FcR, humain</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8+ Depletion </td><td>Cocktail Stem Cell</td><td>15663</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de teinture de cellules mortes fixable, pour l’excitation UV</td><td>Invitrogen</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Improm-II Système de Transcription Inverse</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600830</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Perméabilisation Kit de Solution</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337100</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&#947 ; amorce</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FOR : CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV : TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td></tr><tr><td>GAPDH primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FOR : TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV : AGTGATGGCATGGACTGTGG</td></tr></tbody></table>

essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de immunoregulateurs voies sur t cd4 cellulaire effecteur fonction spécifique au vih

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T épuisement cellulaire est un facteur important de la clairance de l&#39;agent pathogène échoué au cours des infections virales chroniques. Voies immunorégulatoires, comme PD-1 et IL-10, sont régulés à la hausse sur cette exposition de l&#39;antigène en cours et contribuent à la perte de la prolifération, de la fonction cytolytique réduite et altérée la production de cytokines par les cellules T CD4 et CD8. Dans le modèle murin de l&#39;infection par LCMV, l&#39;administration d&#39;anticorps bloquants contre ces deux voies augmentée réponses des lymphocytes T. Cependant, il n&#39;existe actuellement aucun test in vitro pour mesurer l&#39;impact d&#39;un tel blocus sur la sécrétion de cytokines dans des cellules à partir d&#39;échantillons humains. Notre protocole et approche expérimentale nous permettent de quantifier avec précision et efficacité la restauration de la production de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH chez des sujets infectés par le VIH. Ici, nous décrivons un modèle expérimental in vitro qui permet des mesures de la sécrétion de cytokines par les cellules spécifiques au VIH T CD4 et de leur impact sur ​​les autres cell sous-ensembles. Cellules T CD8 ont été épuisés de sang total et PBMC restantes ont été isolées par la méthode de séparation Ficoll. Les PBMC appauvries en CD8 ont ensuite été incubées avec des anticorps bloquants contre PD-L1 et / ou l&#39;IL-10Rα et, après une stimulation avec une piscine de HIV-1 Gag peptide, les cellules ont été incubées à 37 ° C, 5% CO 2. Après 48 h, le surnageant a été recueilli pour l&#39;analyse des cytokines par les tableaux et les perles culots cellulaires ont été recueillis pour chaque analyse phénotypique par cytométrie de flux ou de l&#39;analyse de la transcription en utilisant la qRT-PCR. Pour une analyse plus détaillée, différentes populations de cellules ont été obtenues par l&#39;épuisement sélective de sous-ensemble à partir de PBMC ou par tri en utilisant la cytométrie en flux avant d&#39;être évalués dans les mêmes essais. Ces méthodes offrent une approche très sensible et spécifique pour déterminer la modulation de la production de cytokines par les cellules T auxiliaires spécifiques de l&#39;antigène et de déterminer les interactions fonctionnelles entre les différentes populations de cellules immunitaires.

Pour effectuer des mesures de cytokines en utilisant ce système in vitro, il est essentiel d'être capable de distinguer les réponses spécifiques de l'antigène par rapport au pas de commande de stimulation. En général, nous avons considéré que les réponses positives des valeurs de la stimulation antigénique qui donnent au moins trois fois plus dans les niveaux de cytokine par rapport au pas de commande de stimulation et qui étaient dans la plage linéaire du dosage. Nous utilisons sensibilité tableau de perles do...

Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH.

Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

L’objectif global de cette procédure est d’analyser la sécrétion de cytokines, la transcription et l’impact morphologique des lymphocytes T stimulés. Tout d’abord, utilisez un gradient d’appel FI pour isoler les cellules mononucléées du sang périphérique CD huit des individus infectés par le VIH qui incubent les cellules avec le contrôle de l’isotype ou l’anticorps bloquant d’intérêt. Stimulez ensuite les cellules avec l’antigène d’intérêt.Ensuite, centrifugez les cultures cellulaires afin de collecter des surnageants pour les mesures de cytokines et des pastilles cellulaires pour l’analyse phénotypique ou l’analyse transcriptionnelle si vous le souhaitez. Adapter ce protocole pour inclure le tri des différents types de cellules par cytométrie en flux Résultats sur la sécrétion de cytokines. L’analyse phénotypique ou transcriptionnelle peut montrer l’impact du blocage des anticorps des voies inhibitrices sur la restauration de la fonction effectrice des lymphocytes T CD quatre spécifiques du VIH.Ce test in vitro peut être utilisé efficacement pour quantifier les niveaux de cytokines restaurés par le blocage des voies inhibitrices, pour étudier un large panel de molécules effectrices et aussi pour évaluer l’impact des cytokines produites par le C spécifique du VIH pour les lymphocytes T sur d’autres sous-ensembles cellulaires. Megan Hart, une technicienne de recherche de notre laboratoire, va maintenant faire la démonstration de cette procédure, épuiser les cellules T positives CD huit en ajoutant le cocktail humain de déplétion positive CD huit à 50 microlitres par millilitre de sang total, bien mélanger et incuber pendant 20 minutes. À température ambiante, mélangez le sang entier avec le tampon de Hank.Maintenant, superposez soigneusement le sang sur le pack histo, puis centrifugez le gradient à 540 RCF pendant 30 minutes. Collectez la couche de cellules mononucléées du sang périphérique. Transférez les cellules dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et lavez-les deux fois avec 45 millilitres de RPMI 1640 complet.Remettre en suspension les cellules lavées dans le RPMI 1640 complet. Ensuite, aliquote 500 microlitres de suspension cellulaire par tube de fax. En fonction de la voie explorée, ajoutez les anticorps bloquants.Ajoutez également les commandes d’isotype aux tubes appropriés. Incuber les cellules pendant 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Ensuite, stimulez les cellules avec un pool de peptides UN gag du VIH.Incluez également un contrôle sans stimulation pour chaque condition de blocage. Continuez à cultiver les cellules pendant 48 heures. Granuler les cellules par centrifugation puis sans perturber la pastille.Transférez deux fois 225 microlitres de surnageant dans des tubes EOR pour que les réseaux de vitesse luminex inactivent le virus à 25 microlitres de 0,5 % PBS tween. Mesurez ensuite les concentrations de cytokines souhaitées à l’aide du kit Millipore luminex selon le protocole du fabricant. Après avoir lavé les cellules dans trois millilitres de PBS, colorez pour la viabilité, puis mettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS contenant 1 % de FBS si coloration pour les monocytes ou d’autres cellules présentatrices d’antigènes à 1,4 microlitres de vortex de réactif bloquant le FCR pour mélanger et incuber pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, ajoutez le vortex d’anticorps de surface et incubez pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Après un lavage à 200 microlitres de 4 % de para formaldéhyde et incuber à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité. Après un lavage, nous suspendons les cellules dans 250 microlitres de 1 % FBS pour analyse sur un cytomètre de flux multi-laser pour le lyce quantitatif R-T-P-P-C-R les cellules dans 300 microlitres de tampon kyogen, RLT contenant 1 % d’ARN d’isolat d’éthanol céto Beamer, à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN suivant le protocole du fabricant.Synthétisez maintenant le CD NA à partir de l’ARN à l’aide d’un kit de synthèse CD NA et en suivant le protocole du fabricant. Ensuite, créez un mélange d’amorces pour chaque amorce, y compris les gènes d’entretien ménager en ajoutant des amorces à de l’eau sans nucléases et à garder sur de la glace. Pour chaque master mix d’amplification, ajoutez 10,5 microlitres d’eau sans nucléase, 12,5 microlitres de cyber green et un microlitre de mélange d’amorce par plaque.Eh bien, maintenant, pipetez 24 microlitres de master mix dans chaque réaction. Eh bien ajoutez également un microlitre de CD NA à chacun, bien selon le modèle. Bouchez les puits et centrifugez la plaque pendant trois minutes à 1500 RCF.Ensuite, exécutez la plaque sur une machine QRT PCR R pour la coloration de la surface des cellules. Ajouter les colorants felden et monin environ six heures avant la coloration intracellulaire des cytokines. Ensuite, lavez les cellules avec 1 % de FBS dans du PBS et colorez-les pour les cytokines intracellulaires à l’aide d’un kit de solution de perméation de fixation et d’un protocole après avoir lavé les cellules.Une fois que nous avons suspendu les pastilles dans 250 microlitres de 1 % FBS, analysez les échantillons sur un cytomètre à flux multi-laser 16 heures après la coloration de stimulation pour la viabilité à l’aide du kit de coloration de cellules mortes fixables en direct. Selon le protocole du fabricant, après un lavage PBS, nous suspendons les cellules dans 100 microlitres de 1 % FBS au vortex d’anticorps de surface pour mélanger et incuber les cellules sur de la glace dans l’obscurité pendant 20 minutes. Lavez les cellules une fois et suspendez-les dans 500 microlitres de RPMI 1640 complété par du froid.Le média filtre ensuite les cellules à travers un capuchon de crépine de cellule dans un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres. Ensuite, à 200 microlitres de média RPMI 1640 complété par tube de collecte. Garder tous les tubes sur la glace pendant le tri, trier en direct les sous-ensembles de cellules d’intérêt sur un instrument situé dans une installation équipée pour la culture de matières biologiques dangereuses.Les cellules triées pendant la durée souhaitée. Suite à l’analyse des analyses luminex et PCR dans cette expérience, la stimulation pbmc appauvrie en CD huit avec un pool de peptides VIH V un gag entraîne une augmentation médiane de 800 fois pour la production d’interféron gamma. Le niveau de transcrits de l’interféron gamma a été multiplié par dix en médiane après la stimulation.Dans ce cas, l’analyse in vitro de la fonction des lymphocytes T CD quatre spécifiques du VIH indique une forte corrélation entre la sécrétion de la protéine d’interféron gamma et les niveaux d’ARNm de l’interféron gamma. Il est intéressant de noter que la stimulation par le pool de peptides gag du VIH entraîne une plus grande sécrétion d’interféron gamma que les antigènes bactériens du tétanos. D’autres résultats de l’anatoxine avec la sécrétion d’IL 13 indiquent les différents profils cytokiniques du VIH et des réponses des lymphocytes T DC quatre spécifiques du tétanos.Le blocage de la voie one n’a généralement pas d’impact significatif sur la sécrétion de cytokines sans aucune stimulation antigénique, mais augmente la sécrétion d’interféron gamma et d’IL deux. Lorsque les cellules sont stimulées par le VIH, un peptide gag se développe. Lorsque les cellules CD trois sont épuisées de la pbmc, il n’y a pas d’interféron gamma ou d’IL deux produits en réponse à la stimulation de l’antigène.Ces données indiquent que la sécrétion d’interféron gamma et d’IL 2 est induite en réponse à la stimulation spécifique des lymphocytes T CD quatre et de l’antigène spécifique du VIH. Cette expérience utilise le flux de travail démontré à l’aide de cellules T CD quatre triées par des faits pour examiner l’impact du blocage de un sur l’interféron gamma et l’IL deux. L’un des principaux avantages de cette méthode est sa capacité à évaluer comment les molécules immunorégulatrices régulent l’interaction des lymphocytes T CD quatre spécifiques du VIH avec les cellules présentatrices d’antigènes.Ici, le protocole a été adapté pour effectuer une coloration intracellulaire des cytokines 48 heures après la stimulation. Les résultats montrent que les monocytes sont la principale source d’IL 12 après stimulation avec le VIH à un pool de peptides gag. Cette approche expérimentale in vitro permet aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie des lymphocytes T d’explorer l’impact des voies immunorégulatrices sur l’effet régulateur de la fonction efficace des lymphocytes T spécifiques d’Addison dans des échantillons humains.

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