Name: Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Découvrez un test rapide de sensibilité aux antibiotiques utilisant une puce microfluidique pour évaluer la viabilité bactérienne sous stress. Cette méthode permet de déterminer le profil de résistance sans surveillance de la division cellulaire.

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Nous remercions les ingénieurs et les étudiants du Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Pour avoir contribué à la conception, à l’usinage et à l’automatisation du système expérimental, nous remercions Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin et le Dr Sudong Shu. Nous remercions Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu et Katarzyna Kuliga pour leur aide dans la mise à l’essai des protocoles expérimentaux et la collecte de données. Nous remercions les Drs Anne E. Carpenter et Mark-Anthony Bray de la plateforme d’imagerie du Broad Institute de Harvard et du MIT pour leur aide dans le développement de la routine d’analyse d’images dans CellProfiler. Le projet décrit a été soutenu en partie par les prix R21AI079474 et 1R01AI101446 de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses ou des Instituts nationaux de la santé. Le projet a également été soutenu par Fraunhofer USA.

1. Créer la couche PDMS (Figure 1)
<ol><li>Mélanger vigoureusement le PDMS et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Pour éliminer les bulles, dégaz le mélange visqueux dans une chambre à vide pendant 1 heure à température ambiante.</li>
	<li>Sur une balance, versez le PDMS lentement sur le moule en aluminium. Versez du centre et maintenez le moule nivelé. Assurez-vous de laisser les broches à découvert. Arrêtez de verser une fois que le poids cible est atteint. Notre moule nécessite 4 g de PDMS et 0,4 g de réactif de durcissement.
</li>
	<li>Niveler le moule à l’intérieur d’un four et durcir à 37 °C pendant la nuit. Les temps de durcissement alternatifs sont de 2 h à 60 °C ou de 1 h à 90 °C.
</li>
	<li>Disséquer la couche PDMS durcie le long du bord du moule et la décoller soigneusement de la surface du moule avec une paire de pinces. Nettoyez la surface du moule avec 70% d’éthanol et une Q-tip.</li>
</ol>2. Assemblez la cellule d’écoulement selon la figure 2
L’assemblage standard de PDMS avec des lames de verre se fait par traitement au plasma d’oxygène des deux surfaces, ce qui garantit une liaison sans fuite entre le PDMS et la lame de verre du microscope. Dans le protocole présenté, le traitement au plasma détruirait le revêtement chimique sur la lame de verre. Par conséquent, la lame est scellée sous pression plutôt que traitée au plasma.
<ol><li>Placez la fenêtre en verre dans la poche de la cellule d’écoulement.</li>
	<li>Posez une lame de verre enduit sur la fenêtre en verre à l’intérieur de la poche de la cellule d’écoulement avec le côté actif vers le haut, et placez la couche PDMS avec des canaux orientés vers le bas sur le dessus. Placez la glissière PDMS de manière à ce que les entrées de canal s’alignent sur les trous traversants de la plaque métallique. Poussez doucement l’air entre les couches.</li>
	<li>Retournez l’assemblage PDMS/lame de verre afin que le PDMS fasse face à la fenêtre en verre. Superposez les entrées du canal PDMS avec les trous traversants de la plaque métallique.</li>
	<li>Placez la plaque de pression sur le dessus et serrez les vis.</li>
	<li>Placez la cellule d’écoulement assemblée sous le microscope. Réglez le grossissement du microscope sur 60X et préalignez les positions du canal.</li>
</ol>3. Préparer les bactéries de la phase logarithmique
<ol><li>Jour avant l’expérience : Inoculer 50 ml de bouillon Mueller Hinton contenant 2 % de NaCl (MH2) avec une colonie bactérienne. Agiter à 250 tr/min pendant la nuit à 37 °C. Une ou deux souches bactériennes peuvent être étudiées dans une expérience pour la configuration décrite.
</li>
	<li>Avant l’expérience : Mélanger 50 μl de culture bactérienne pendant la nuit dans 50 ml de milieu MH2. Agiter à 250 tr/min pendant 3 h à 37 °C pour s’assurer que les bactéries sont en phase logarithmique.</li>
</ol>4. Réchauffer les composants de la solution expérimentale au moins 10 minutes avant qu’ils ne soient nécessaires
<ol><li>Décongeler le colorant fluorescent (5 mM de stock) et la lysostaphine (10 μg/ml de stock) à température ambiante.</li>
	<li>Réchauffer la poudre d’oxacilline à température ambiante.</li>
</ol>5. Préparer et charger la suspension bactérienne
<ol><li>Après la fin de la sous-culture de 3 heures: Prendre 10 ml de culture de bactéries et centrifuger à 1 650 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et la remise en suspension des bactéries dans 1 ml de milieux frais MH2.</li>
	<li>Fixez un tube de courte longueur à une seringue Luer lock de 1 ml. Rincer le tube de la seringue avec 1 ml de support. Laissez un peu de support dans le tube pour éviter les bulles d’air lors de l’étirage dans la suspension bactérienne.</li>
	<li>Chargez 0,7 ml de bactéries de type 1 dans la seringue. Remplissez deux canaux de la cellule d’écoulement avec des bactéries de type 1. Surveillez l’apparition du liquide de l’autre côté du canal après ca. 150 μl. La transparence du canal change à mesure qu’il est rempli de bactéries.
</li>
	<li>Si vous expérimentez avec plusieurs types de bactéries, répétez la procédure de chargement pour les bactéries de type 2 dans les deux canaux restants de la cellule d’écoulement.</li>
	<li>Placez la cellule d’écoulement à l’intérieur de l’incubateur à 37 °C pendant 45 min pour permettre la décantation bactérienne et sa fixation à la surface de la glissière.</li>
</ol>6. Préparer et charger les solutions expérimentales
<ol><li>Préparer 140 μl de solution de colorant fluorescent à 0,5 mM en mélangeant 14 μl de colorant fluorescent (5 mM) et 126 μl de milieux MH2.</li>
	<li>Diluer 10 mg d’oxacilline dans 40 ml de MH2 pour obtenir une concentration finale de 250 μg/ml d’oxacilline.</li>
	<li>Préparer 130 ml de solution témoin avec des concentrations finales de colorant fluorescent de 0,25 μM et de 0,7 ng/ml de lysostaphine. Pour ce faire, mélanger 65 μl de colorant fluorescent (0,5 mM), 9,12 μl de stock de lysostaphine (10 μg/ml) et 130 ml de milieux MH2.</li>
	<li>Préparer 130 ml de solution antibiotique avec des concentrations finales de colorant fluorescent de 0,25 μM, de 0,7 ng/ml de lysostaphine et de 50 μg/ml d’oxacilline. Pour ce faire, mélanger 65 μl de colorant fluorescent (0,5 mM), 9,12 μl de stock de lysostaphine (10 μg/ml), 26 ml d’oxacilline (250 μg/ml) et 104 ml de milieux MH2.</li>
	<li>Remplissez deux seringues de 60 ml avec une solution de contrôle et deux seringues de 60 ml avec une solution antibiotique. Conservez les solutions enveloppées dans du papier d’aluminium pour éviter la dégradation des réactifs induite par la lumière. Remplissez trop les seringues pour tenir compte de la perte due au rinçage du tube.
</li>
	<li>Retirez les bulles d’air des seringues en feuilletant. Fixez et remplissez le tube d’entrée à la pointe avec la solution expérimentale.</li>
	<li>Montez des seringues sur la pompe. Placez d’abord la seringue avec le plus petit volume, puis verrouillez la position du piston. Placez le reste des seringues sur la pompe, en serrant leurs pistons si nécessaire.</li>
	<li>Réglez la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 60 ml. Faites un flush avec la pompe jusqu’à ce qu’un flux constant de liquide soit vu de toutes les seringues.</li>
</ol>7. Configurez la cellule d’écoulement au microscope
<ol><li>Retirez la cellule d’écoulement de la centrifugeuse et montez-la sur l’étage du microscope(Figure 3).</li>
	<li>Connectez le tube d’entrée/sortie à chacun des canaux de cellule d’écoulement (une entrée/une sortie par canal). La collecte de la sortie dans quatre conteneurs différents permet de mesurer des volumes de sortie de canal individuels.</li>
</ol>8. Exécutez l’expérience de 60 minutes
<ol><li>Vérifiez les positions préalignées de l’étape 2.5. Si le champ de vision du microscope n’est pas centré sur le canal et/ou n’est pas mis au point, ajustez les paramètres et enregistrez les nouvelles positions. Une mise au point précise peut ne pas être possible avant le début de l’écoulement en raison de la forte densité de bactéries chargées.
</li>
	<li>Réglez le temps d’acquisition du contraste de phase à 10 ms et le temps d’acquisition de la fluorescence à 1 600 ms.</li>
	<li>Obtenir des images de contraste de phase et de fluorescence pour chaque position avant d’initier le flux. Cela donne une estimation qualitative de la densité bactérienne chargée.
</li>
	<li>Démarrez le flux de liquide et vérifiez immédiatement que le microscope est focalisé sur le bas des canaux.</li>
	<li>Prenez des images de contraste de phase et de fluorescence des zones cibles dans la première minute d’écoulement.</li>
	<li>Acquérir des images toutes les 2 minutes après le premier ensemble d’images jusqu’à ce que 60 min de flux se soit produite. Recentrez-vous au besoin.</li>
</ol>9. Désinfecter la cellule d’écoulement
<ol><li>Faire une solution d’eau de Javel à 10% dans un bécher (100 ml). Remplissez 4 seringues de 20 ml avec 10 ml du mélange. Déblocez les seringues et fixez-les à la cellule d’écoulement. Il faudra ~ 1-2 min pour que les canaux soient débraux des bactéries.
</li>
	<li>Réglez la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 3 ml. Courir pendant 3 min.</li>
	<li>Remplissez 4 seringues de 60 ml avec 60 ml d’eau DI. Déblocez les seringues et fixez-les à la cellule d’écoulement.</li>
	<li>Régler la vitesse de la pompe à 1 ml/min et le volume de la pompe à 30 ml. Courir pendant 30 min.</li>
	<li>Surveillez le nettoyage du canal au microscope.</li>
	<li>Désassemblez la cellule d’écoulement. Jetez la lame époxy utilisée. Faire tremper les composants de la cellule d’écoulement dans de l’eau DI pendant 20 min. Sécher à l’air.</li>
</ol>10. Analyser les images et générer des données
<ol><li>Comptez le nombre de bactéries dans chaque image. Le logiciel en libre accès, CellProfiler est utilisé pour effectuer le traitement d’image par lots16. Un aperçu général de la routine CellProfiler est résumé dans le tableau 1. Le nombre de bactéries présentes dans l’image de contraste de phase (Np)donne le nombre total de bactéries. Le nombre de bactéries visibles dans l’image de fluorescence (Nf)donne le nombre de bactéries mortes.
</li>
	<li>Calculer le pourcentage normalisé de mort cellulaire bactérienne en fonction du temps.<ol>
<li>Importez Nf et Np pour des images individuelles dans le logiciel d’analyse de données.</li>
		<li>Calculer la fraction de bactéries mortes dans chaque canal à un point de temps spécifique donné par la fraction (Nf / Np) à t = T.</li>
		<li>Soustrayez la fraction de bactéries mortes présentes au début de l’expérience (t = 1 min) pour les canaux témoins et expérimentaux.</li>
		<li>Soustrayez la fraction de bactéries mortes présentes dans le canal témoin de celle présente dans le canal expérimental à chaque point temporel avec l’équation suivante : <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>Graphenorme DP vs t pour le cours de l’expérience. Il est à noter qu’un échantillon dont le pourcentage de mort cellulaire est supérieur à 1 % est considéré comme réceptif, tandis que moins de 0,5 % de décès indique une résistance. Les pourcentages qui se situent entre ces deux seuils sont considérés comme indéterminés et l’échantillon doit être testé de nouveau.
</li>
		<li>Utilisez une feuille de calcul pour résumer et analyser les résultats de différentes expériences.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li>
</ol>

La méthode microfluidique est en instance de brevet : Sauer-Budge A, Sharon A, Kalachnikov M, Wirz H, inventeurs ; Procédé et dispositif de détection rapide de la résistance bactérienne aux antibiotiques/sensibilité au brevet PCT/US10/33523.

Le protocole présenté a été validé et optimisé dans un ensemble d’expériences avec des souches de Staphylococcus aureus sensibles à la méthicilline et résistantes à la méthicilline10. Par conséquent, ce protocole sans modification devrait être directement applicable à d’autres souches de S. aureus et à d’autres antibiotiques avec des mécanismes d’action affectant la biosynthèse bactérienne de paroi cellulaire. Les types de bactéries autres que S. aureus peuvent nécessiter une variati...

L’augmentation de la résistance bactérienne intensifie le besoin de tests de sensibilité aux antibiotiques rapides basés sur le phénotype afin de protéger nos médicaments de dernier recours. Les tests de sensibilité standard sont basés sur l’inhibition de la croissance bactérienne en présence d’antibiotiques qui prennent plusieurs (8-24) heures à compléter. Nous avons développé un nouveau test de sensibilité aux antibiotiques sur une plateforme microfluidique qui s’appuie sur l’activation du stress des voies biosynthétiques pour accélérer l’action des antibiotiques.
Les tests de sensibilité aux antibiotiques à l’échelle microfluidique ont l’avantage d’une utilisation efficace des échantillons, car ils nécessitent un petit nombre de bactéries. En outre, les dispositifs microfluidiques peuvent être multiplexés afin de tester plusieurs échantillons dans plusieurs conditions1,2. Récemment, un certain nombre de méthodes microfluidiques pour les tests de sensibilité aux antibiotiques ont été signalées3-9. Dans ces procédés, les bactéries sont cultivées à l’intérieur des gouttelettes nano- et picolitres3,7,dans le volume total du canal microfluidique4-6,8,ou sous forme de bactéries uniques localisées électriquement à la surface inférieure du canal9. Bien que ces tests soient effectués dans des canaux microfluidiques, ils surveillent tous la croissance microbienne en présence et en l’absence d’antibiotiques similaires aux méthodes traditionnelles. Les mesures de croissance sont prises via la densité optique, les colorants sensibles au pH ou le contraste de champ /phase lumineux ou des images de fluorescence. Bien que certains de ces tests soient plus rapides que les méthodes traditionnelles, ils détectent chacun passivement la résistance aux antibiotiques. En d’autres termes, ces méthodes nécessitent toujours que l’utilisateur attende la croissance bactérienne comme lecture finale.
En revanche, nous avons développé une méthode qui utilise une combinaison de cisaillement et de stress enzymatique pour activer les voies biochimiques sensibles aux antibiotiques10. La remise en question des bactéries stressées avec ces antibiotiques crée un test de susceptibilité plus rapide. Les bactéries résistantes à l’antibiotique sont capables de résister aux conditions stressantes. Les bactéries sensibles, d’autre part, sont rapidement tuées par les contraintes combinées. Le pourcentage de mort cellulaire après une heure, mesuré par microscopie à l’aide d’une coloration fluorescente des cellules mortes, définit le phénotype de la bactérie (résistante vs sensible).
Pour une mise en œuvre réussie de notre méthode, les bactéries doivent être immobilisées sur la surface inférieure du canal microfluidique. De cette façon, les bactéries peuvent être soumises à divers stress et simultanément esso repérées au microscope dans un seul plan. Une lame de verre de microscope revêtue est utilisée pour l’immobilisation des bactéries. La lame est pré-revêtue par le fabricant avec des groupes époxydes pour la liaison aux protéines non spécifiques. La liaison non spécifique de ces époxydes aux protéines de surface bactériennes fixe de manière covalente les bactéries à la surface de la lame.
Les souches sont testées dans des conditions identiques (cisaillement + stress enzymatique) en l’absence (contrôle) et en présence (expérience) d’antibiotique. Les photos de contraste de phase et de microscope à fluorescence de chaque canal sont prises automatiquement toutes les deux minutes pendant une heure. Les désignations de résistance sont ensuite faites en comparant le pourcentage de bactéries mortes dans le canal expérimental à celles présentes dans le canal témoin. Après une heure, un échantillon dont le pourcentage de mort cellulaire est supérieur à 1 % est considéré comme réceptif, tandis que moins de 0,5 % de décès indique une résistance. Les pourcentages qui se situent entre ces deux seuils sont considérés comme indéterminés et l’échantillon doit être testé de nouveau.
Les canaux microfluidiques sont définis dans PDMS, qui est un matériau de choix pour les dispositifs microfluidiques11. Pdms est optiquement transparent dans une large gamme de longueurs d’onde, biocompatible, inerte, perméable aux gaz et a une faible perméabilité aux liquides; par conséquent, il est bien adapté à ces expériences.
La contrainte mécanique/de cisaillement est créée par l’écoulement des milieux à température ambiante sur les bactéries immobilisées. (Remarque : Le réchauffement du support à 37 °C n’a pas d’effet significatif sur les résultats de l’essai.) Les pompes automatisées de seringue forcent les milieux (contenant une coloration des cellules mortes +/- antibiotique, ainsi que des facteurs de stress enzymatiques facultatifs) à travers les canaux microfluidiques (200 μm x 400 μm) à un débit de 1 ml/min pour donner 6,25 kPa de force de cisaillement ou un taux de cisaillement de 6 000 sec-1. Ce taux est égal ou supérieur aux contraintes de cisaillement précédemment étudiées sur les staphylocoques.
L’enzyme, la lysostaphine, a été choisie pour des expériences préliminaires parce qu’elle cause des dommages directs à la paroi cellulaire de Staphylococcus. La concentration de lysostaphin (0,7 ng/ml) était suffisante pour causer des dommages bactériens de paroi cellulaire, mais pas suffisante pour causer la mort cellulaire bactérienne sans antibiotique dans la période de l’expérience. La lysostaphine n’est pas requise pour la désignation correcte de la susceptibilité bactérienne, mais elle augmente le résultat, conduisant à une augmentation de la mort cellulaire chez les souches sensibles. En revanche, la contrainte de cisaillement est essentielle pour la fonction d’essai. Lorsque des souches de Staphylococcus aureus sensibles à la méthicilline sont traitées avec de la lysostaphine et de l’oxacilline en l’absence d’écoulement, aucune mort cellulaire n’est enregistrée au cours de l’expérience.
La viabilité cellulaire est surveillée avec une coloration fluorescente des cellules mortes12. Le choix du colorant était basé sur sa capacité à colorer sélectivement seulement les cellules endommagées, sa nontoxicité aux cellules vivantes, et sa faible fluorescence de fond, qui a permis son ajout direct au milieu cellulaire sans étapes supplémentaires. Le choix d’une concentration de colorant fluorescent de 0,25 μM visait à atteindre des niveaux de signal acceptables pendant un temps d’exposition de 1,6 s à la lumière d’excitation de fluorescence.
Le bêta-lactamine, oxacilline, a été employé dans nos études préliminaires. Les espèces de S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) sont résistantes à l’oxacilline et ne présenteront aucune mort cellulaire appréciable au cours de l’expérience. La concentration de 50 μg/ml a été déterminée dans les études préliminaires. Des concentrations plus faibles d’antibiotiques ont donné moins de séparation entre les souches résistantes et sensibles, tandis que des concentrations plus élevées n’ont pas entraîné de différence appréciable dans les résultats expérimentaux.
Nous avons précédemment rendu compte du développement réussi d’un test qui combine des contraintes mécaniques et enzymatiques qui affectent directement la paroi cellulaire bactérienne13 avec un antibiotique qui inhibe la biosynthèse de la paroi cellulaire14,15. Ces expériences de démonstration de principe ont été réalisées sur un panel de SARM et de S. aureus (MSSA), sensible à la méthicilline. Cependant, avec la sélection des paramètres expérimentaux appropriés, notre méthode devrait être applicable à plusieurs espèces de bactéries et à plusieurs classes d’antibiotiques.

<table><tbody><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>S7020</td><td>Coloration par fluorescence à cellules mortes</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>A9418-5G</td><td>Utilisé pour le stockage de la lysostaphine</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>S8750-500G</td><td>Utilisé pour le stockage de la lysostaphine</td></tr><tr><td>Lysostaphin&nbsp ;</td><td>Cell Sciences</td><td>CRL309A</td><td>Arrive sous forme solide de 1 mg. Pour le stockage : Dissoudre dans 20 mM d’acétate de sodium. Mélanger avec une solution de BSA jusqu’à la concentration finale de 1 % BSA et 100 & micro ; g/ml &nbsp ; lysostaphine pour le stockage&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sel d’oxacilline</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>28221-1G</td><td>Antibiotique</td></tr><tr><td>Mueller Hinton Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0757-17-6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma Aldrixh</td><td>S3014-500G</td><td>2 % ajouté au bouillon Mueller-Hilton avant l’autoclave</td></tr><tr><td>1 ml, seringue Luer-lock&nbsp ;</td><td>BD (Beckton, Dickinson et Comp.)</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Luer-lock BD de 2 oz</td><td>(Beckton, Dickinson et Comp.)</td><td>309653 - 60 mL</td><td>Remplissage à ~65 ml</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr> à <tr><td>fluorescence inversée Olympus IX-70</td><td>Cambridge Scientific</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>60X, Objectif à fluorescence/contraste de phase</td><td>Olympus Corp.</td><td>LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga Caméra CCD monochrome 12 bits</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Automatisation du microscope Obturateurs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>contraste de phase/fluorescence</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H204/H202</td><td></td></tr><tr><td>X/Y Stage&nbsp ;</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H107AENN</td><td></td></tr><tr><td>Moteur de mise au point Joystick</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H122</td><td></td></tr><tr><td>pour contrôle XYZ</td> Contrôleur <td>CS152EF</td><td></td><td>Proscan PRIOR Scientific</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition d’images</td> H3-XY2 Logiciel d’acquisition d’images <td>Fraunhofer CMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Assembly et PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell</td><td>BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td><td>3333-1044</td> Les <td>dessins techniques ont été produits par Fraunhofer CMI</td></tr><tr><td>Fenêtre en verre</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1054</td> La <td>fenêtre en verre a été coupée à la bonne taille chez Fraunhofer CMI</td></tr><tr><td>BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm Edmund</td><td>Optics Inc.</td><td>NT48-543</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’étanchéité</td><td>BU Scientific Instruments Facility</td><td>3333-1045</td><td></td></tr><tr><td>Lame en verre époxyde</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SuperEpoxy 2</td><td></td></tr><tr><td>PDMS master</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td>Master usiné en aluminium ou en laiton avec UPM-0005 (machine de découpe à la volée par ultraprécision)</td></tr><tr><td>Conception de diapositives PDMS</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td></td></tr><tr><td>Écrou de</td><td></td><td></td><td></td>tube</tr><tr><td>, Super flangeless Tinytight, sans tête, 1/16 po, PEEK, vert&nbsp ;</td><td>IDEX Health Science</td><td>M-644-03</td><td>Les entrées/sorties de la cellule d’écoulement sont taraudées pour cette virole</td></tr><tr><td>Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK avec bague de verrouillage SS, noir</td><td>IDEX Health Science</td><td>M-657</td><td></td></tr><tr><td>Écrou, Super flangeless Tinytight, sans tête, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, naturel</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-255</td><td></td></tr><tr><td>Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), jaune</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-259</td><td>Convient aux tubes d’adaptateur Luer-lock</td></tr><tr><td>, téflon FEP, .030 po x 1/16 po x 20 pi, vert&nbsp ;</td><td>IDEX Health Science</td><td>1520G</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur, Luer femelle à connexion rapide 1/4-28, PEEK, rouge&nbsp ;</td><td>IDEX Sciences de la santé</td><td>P-658</td><td></td></tr></tbody></table>

tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Nous avons développé une méthode microfluidique rapide pour les tests de sensibilité aux antibiotiques dans un environnement basé sur le stress. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes survivent à ces conditions stressantes. L’hypothèse derrière cette méthode est nouvelle : l’activation du stress des voies biochimiques, qui sont des cibles des antibiotiques, peut accélérer les tests de sensibilité aux antibiotiques. Par rapport aux méthodes standard d’essai de sensibilité aux antibiotiques, l’étape limitant le taux - la croissance bactérienne - est omise lors de l’application de l’antibiotique. La mise en œuvre technique de la méthode se fait dans une combinaison de techniques standard et d’approches innovantes. Les parties standard de la méthode comprennent des protocoles de culture bactérienne, la définition de canaux microfluidiques dans le polydiméthylsiloxane (PDMS), la surveillance de la viabilité cellulaire avec fluorescence et le traitement d’images par lots pour le comptage des bactéries. Les parties innovantes de la méthode sont l’utilisation du flux de milieux de culture pour l’application de contraintes mécaniques, l’utilisation d’enzymes pour endommager mais pas tuer les bactéries et l’utilisation de substrats de microréseaux pour la fixation bactérienne. La plate-forme développée peut être utilisée dans le développement et l’essai de médicaments antibiotiques et non antibiotiques. Par rapport aux expériences de suspension bactérienne standard, l’effet du médicament peut être activé et désactivé à plusieurs reprises sur des périodes de temps contrôlées. L’observation répétitive de la même population bactérienne est possible au cours de la même expérience.

Les données présentées à la figure 4 montrent la réponse d’une souche sensible de Staphylococcus aureus au fil du temps dans un canal microfluidique contenant des antibiotiques. Les images de contraste de phase acquises à 1 min et à la fin de l’expérience 1 heure sont représentées sur les figures 4A et B. Les données analysées sur 1 heure sont présentées à la figure 4C avec les bactéries surlignées en rouge (5 828 au total). Les images...

Nous avons développé une plateforme microfluidique pour des tests rapides de sensibilité aux antibiotiques. Le fluide est passé à grande vitesse sur les bactéries immobilisées au fond d’un canal microfluidique. En présence de stress et d’antibiotiques, les souches sensibles de bactéries meurent rapidement. Cependant, les bactéries résistantes peuvent survivre à ces conditions stressantes.

Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer rapidement la sensibilité des bactéries aux antibiotiques d’intérêt. Ceci est réalisé en immobilisant d’abord les bactéries en phase logarithmique au fond d’un canal microfluidique. Dans la deuxième étape, le milieu contenant l’antibiotique et un colorant fluorescent mort vivant est ensuite poussé à travers le canal à un débit élevé, stressant les bactéries et activant leurs voies biochimiques ciblées par les antibiotiques.Les images de contraste de phase et de fluorescence sont automatiquement collectées toutes les deux minutes pendant une heure pour surveiller la viabilité bactérienne, les pourcentages normalisés de mort bactérienne sont calculés à partir des images acquises à chaque point de l’expérience. En fin de compte, le phénotype de sensibilité aux antibiotiques de la bactérie est déterminé à partir d’une augmentation du pourcentage de mort cellulaire normalisée au fil du temps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de test de sensibilité phénotypique telles que le bouillon, la dilution ou la microculture, est que notre méthode ne nécessite pas de surveillance de la divisio

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

La conception d'un système de flux de travail d'une journée simple pour le diagnostique des pathogènes bactériens permet la reconnaissance rapide des infections du sang. L'inclusion de huit cliniquement pertinentes cibles bactériennes et leurs profils de résistance aux antibiotiques offre au clinicien un premier aperçu sur le même jour, ce qui peut conduire à un traitement plus adéquat.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Source : Liu, P. C., et al. Conception et utilisation d’un morbidostat automatisé à faible coût pour l’évolution adaptative des bactéries sous sélection d’antibiotiques. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre l’utilisation d’une puce microfluidique pour visualiser et comparer la croissance et la morphologie de souches d’E. coli de type sauvage et résistantes au triméthoprime sous stress antibiotique du triméthoprime.

Croissance bactérienne sur une puce microfluidique pour étudier la résistance aux antibiotiques

Source : Zhang, M. et al., Tests rapides de susceptibilité antimicrobienne par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo démontre l’application de la microscopie à diffusion Raman stimulée pour évaluer la susceptibilité aux antibiotiques en suivant l’activité métabolique marquée au deutérium. En surveillant les signaux carbone-deutérium, la méthode permet la détection rapide de populations bactériennes...

Détection de la susceptibilité aux antibiotiques bactériens à l’aide d’un microscope à diffusion Raman stimulée

Cette vidéo présente un test de biocapteur conductimétrique pour étudier l’interaction d’un anticorps avec un antigène cible immobilisé sur une puce de transducteur. Le biocapteur est conçu pour avoir une protéine chimérique bifonctionnelle – une enzyme β-lactamase avec un site catalytique fonctionnel fusionné à un nanocorps pour se lier à l’antigène cible immobilisé. Lors de la liaison, l’hydrolyse catalytique d’un substrat antibiotique par l’enzyme β-lactamase génère un signal électrique,...

Dosage par biocapteur conductimétrique basé sur la β-lactamase pour les interactions protéine-protéine

Nous décrivons un morbidostat configurable à faible coût qui permet de caractériser la résistance aux antibiotiques en ajustant dynamiquement la concentration du médicament. Le dispositif peut être intégré à une plate-forme microfluidique multiplexée. L’approche peut être étendue aux études de résistance aux antibiotiques en laboratoire.

Conception et utilisation d&#39;un faible coût automatisé Morbidostat pour Adaptive Evolution des bactéries Sous Sélection des médicaments antibiotiques

Test de synergie antimicrobiens est utilisée pour évaluer l’effet de deux ou plusieurs antibiotiques utilisés en combinaison et est généralement effectuée par l’une des deux méthodes : le tableau de damier ou l’analyse temps-détruisent. Nous présentons ici une automatisée, technique de jet d’encre imprimante-assisted damier tableau synergie et une étude classique temps-détruisent synergie.

Synergie antimicrobienne essais par le jet d’encre imprimante-assisted damier automatisé Array et la méthode de temps-détruisent manuelle

Ce protocole présente un test rapide de sensibilité aux antimicrobiens (AST) en 2,5 heures par imagerie de diffusion Raman stimulée par une cellule unique du métabolisme D2O. Cette méthode s’applique aux bactéries dans l’urine ou l’environnement sanguin total, ce qui est transformateur pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

Ce protocole décrit la conception et l’utilisation d’une puce d’isolement (iChip) pour la culture in situ de microbes récalcitrants du sol dans leur milieu naturel. Il décrit également la culture in situ de bactéries du sol productrices d’antimicrobiens. Le protocole peut être adapté pour récupérer des bactéries de diverses niches avec d’autres propriétés souhaitables.

In situ Isolement et culture de bactéries récalcitrantes du sol à l’aide d’une puce d’isolement (iChip)

Ce protocole décrit une méthode LAMP basée sur une puce microfluidique entièrement intégrée, permettant la détection au point d'intervention de 15 pathogènes responsables d'infections respiratoires basses chez les patients en soins intensifs en moins d'une heure.

Détection rapide au point d'intervention des agents pathogènes responsables des infections des voies respiratoires inférieures chez les patients en unité de soins intensifs

Un lensless sur puce plateforme de microscopie à fluorescence est démontré que peut objets image fluorescente sur un ultra-grand champ de vue des ex,&gt; 0,6 à 8 cm2 avec &lt;4μm résolution à l'aide d'un échantillonnage à la compression basée algorithme de décodage. Un tel compact et à large champ modalité d'imagerie fluorescente sur puce pourrait être précieuse pour les haut-débit cytométrie, rares recherche sur les cellules et les puces-analyse.

Lensless microscopie à fluorescence sur une puce

Découvrez un test rapide de sensibilité aux antibiotiques utilisant une puce microfluidique pour évaluer la viabilité bactérienne sous stress. Cette méthode permet de déterminer le profil de résistance sans surveillance de la division cellulaire.

Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

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