Tests de sensibilité aux antibiotiques induits par le stress sur une puce

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer rapidement la sensibilité des bactéries aux antibiotiques d’intérêt. Ceci est réalisé en immobilisant d’abord les bactéries en phase logarithmique au fond d’un canal microfluidique. Dans la deuxième étape, le milieu contenant l’antibiotique et un colorant fluorescent mort vivant est ensuite poussé à travers le canal à un débit élevé, stressant les bactéries et activant leurs voies biochimiques ciblées par les antibiotiques.

Les images de contraste de phase et de fluorescence sont automatiquement collectées toutes les deux minutes pendant une heure pour surveiller la viabilité bactérienne, les pourcentages normalisés de mort bactérienne sont calculés à partir des images acquises à chaque point de l’expérience. En fin de compte, le phénotype de sensibilité aux antibiotiques de la bactérie est déterminé à partir d’une augmentation du pourcentage de mort cellulaire normalisée au fil du temps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de test de sensibilité phénotypique telles que le bouillon, la dilution ou la microculture, est que notre méthode ne nécessite pas de surveillance de la division bactérienne.

Au lieu de cela, nous pouvons accéder à leur profil de sensibilité directement à partir de la petite population existante. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des infections bactériennes résistantes car la méthode est rapide, peut être facilement multiplexée et automatisée Pour créer la couche PDMS, commencez par dégazer un mélange visqueux PDMS fraîchement préparé dans une chambre à vide à température ambiante après une heure, utilisez une balance pour remplir le moule en aluminium avec une masse prédéfinie de mélange PDMS DGA. Versez lentement le PDMS sur le centre du moule, en prenant soin de garder le moule à niveau et les broches découvertes.

Faites durcir le PDMS pendant la nuit dans un four à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, libérez la plaque supérieure du moule et retirez soigneusement le PDMS durci du moule pour assembler la cellule d’écoulement. Tout d’abord, placez la fenêtre en verre dans la poche de la cellule d’écoulement.

Posez ensuite une diapositive en verre enduit sur la fenêtre en verre à l’intérieur de la poche de la cellule d’écoulement avec le côté actif vers le haut. La couche PDMS fraîchement créée avec les canaux vers le bas sur le dessus de sorte que les entrées de canal s’alignent avec les trous traversants de la plaque métallique. Poussez doucement l’air entre les couches, puis retournez l’ensemble de diapositives en verre PDMS de sorte que le PDMS fasse face à la fenêtre en verre.

Superposez les entrées du canal PDMS avec les trous traversants de la plaque métallique, puis placez la plaque de pression sur le dessus et serrez les vis. Placez maintenant la cellule d’écoulement assemblée sous le microscope, réglez le grossissement du microscope sur 60 x et pré-alignez les positions des canaux pour préparer les bactéries en phase logarithmique à charger dans la cellule d’écoulement mélangé 50 microlitres de la colonie bactérienne cultivée d’intérêt pendant la nuit dans 50 millilitres de bouillon frais MH deux. Incuber pendant trois heures en secouant à 250 tr/min et 37 degrés Celsius après la centrifugeuse de sous-culture 10 millilitres de la culture pendant deux minutes à 1 650 fois G et à température ambiante.

Retirez ensuite le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu MH deux frais. Ensuite, fixez une courte longueur de tube à une seringue d’un millilitre et rincez le tube avec un millilitre de média, en laissant une petite quantité de média dans le tube pour éviter les bulles d’air lors de l’aspiration de la suspension bactérienne. Ensuite, chargez 0,7 millilitre de bactéries dans la seringue et remplissez deux canaux de la cellule d’écoulement avec la culture cellulaire bactérienne.

La transparence du canal change lorsqu’il est rempli de bactéries. Ensuite, incubez la cellule d’écoulement pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius pour permettre aux bactéries de se fixer à la surface de la lame. Préparer les solutions de l’expérience.

Tout d’abord, remplissez deux seringues de 60 millilitres avec une solution de contrôle fraîchement préparée et deux seringues de 60 millilitres avec une solution antibiotique fraîchement préparée. Agitez les seringues pour éliminer les bulles d’air, puis fixez le tube d’entrée en poussant les solutions respectives à travers l’extrémité du tube. Conservez les solutions enveloppées dans une feuille d’aluminium pour éviter la dégradation des réactifs induite par la lumière.

Montez maintenant les seringues avec la solution expérimentale sur la pompe, une à la fois. Pressez leurs pistons si nécessaire pour les adapter à la pompe. Verrouillez les seringues en place à l’aide de la barre transversale de maintien de la seringue.

Réglez la vitesse de la pompe à un millilitre par minute et le volume de la pompe à 60 millilitres et rincez la pompe jusqu’à ce qu’un débit de liquide constant soit visible de toutes les seringues. Commencez maintenant l’expérience en retirant la cellule d’écoulement de l’incubateur et en la montant sur la platine du microscope pré-mal alignée. Ensuite, connectez un tube d’entrée provenant d’une seringue et un tube de sortie allant à une bouteille à déchets à chacun des canaux de la cellule d’écoulement.

À ce stade, l’expérience est entièrement mise en place et prête à commencer. Réglez le temps d’acquisition du contraste de phase sur 10 millisecondes et le temps d’acquisition de la fluorescence sur 1600 millisecondes, puis obtenez des images de contraste de phase et de fluorescence pour chaque position avant de lancer le flux. Veuillez noter qu’avant le début de l’image de l’écoulement, il peut être impossible de se concentrer sur le fond du canal en raison de la forte densité de bactéries chargées dans le canal.

Commencez maintenant l’écoulement du liquide. Vérifiez immédiatement que le microscope est focalisé sur le bas des canaux. Prenez ensuite des images en contraste de phase et en fluorescence des zones cibles dans la première minute de flux.

Acquérez des images toutes les deux minutes après la première série d’images jusqu’à ce que 60 minutes de flux se soient produites. En reconcentrant si nécessaire pour s’assurer que l’expérience se déroule correctement, on peut examiner les données de contraste de phase et de fluorescence acquises. Dans cet échantillon de données, une déformation sensible a été chargée dans les canaux un et deux, tandis qu’une déformation de résistance était dans les canaux trois et quatre.

À la fin de l’expérience, exécutez un cycle de nettoyage avec application séquentielle d’eau de Javel et d’eau. Remplissez quatre seringues de 20 millilitres avec 10 millilitres d’une solution d’eau de Javel à 10 % et quatre seringues de 60 millilitres avec de l’eau di. Après le débullage, fixez les seringues remplies d’eau de Javel à la cellule d’écoulement et réglez la vitesse de la pompe à un millilitre par minute et le volume de la pompe à trois millilitres.

Faites fonctionner la pompe pendant trois minutes, surveillez le nettoyage du canal à l’écran. Après trois minutes, remplacez les seringues d’eau de Javel par des seringues à eau et faites fonctionner pendant 30 minutes à raison d’un millilitre par minute. Enfin, comptez le nombre de bactéries dans chaque image à l’aide d’un logiciel de traitement d’image.

Calculez le pourcentage normalisé de mort cellulaire bactérienne en fonction du temps à l’aide de cette formule où NF est égal au nombre de bactéries mortes comptées dans le décompte d’images de fluorescence. Et NP est égal au nombre total de bactéries déterminé à partir de l’image en contraste de phase. Les images présentées ici illustrent la réponse dépendante du temps d’une souche sensible de staphylocoque aria à l’oxacilline à l’intérieur d’une cellule d’écoulement microfluidique.

Ces quadrants montrent des images en contraste de phase acquises une minute après le début de l’expérience et à une heure près avec les images de fluorescence correspondantes montrées ici. Une augmentation significative du nombre de bactéries fluorescentes est observée à la fin de l’expérience, indiquant la mort cellulaire dans le canal et la sensibilité de la souche à l’antibiotique en raison de la non-uniformité stochastique des lames individuelles revêtues d’époxy. Il peut y avoir une perte de cellules bactériennes tout au long de l’expérience sous un stress pur et soutenu pour tenir compte de cette variation, chaque image de fluorescence d’une population de cellules mortes est normalisée avec l’image de contraste de phase co-acquise, ce qui donne la population cellulaire totale à moins d’une seconde du même point de temps.

Ces agrandissements démontrent que l’algorithme de comptage réussit mieux à compter avec précision les bactéries individuelles dans les images de fluorescence que dans les images à contraste de phase densément peuplées. La coloration des cellules mortes donne un contraste de fluorescence élevé pour les bactéries mortes individuelles. Comme le nombre de bactéries fluorescentes dépasse rarement 5 % du nombre total, chaque bactérie est très brillante par rapport à l’arrière-plan.

Par conséquent, les bactéries fluorescentes peuvent être facilement comptées avec un haut degré de précision. Par exemple, dans cette expérience, sur un total de 5 828 bactéries détectées, surlignées en rouge, 174 ont été déterminées comme mortes ici. Les données normalisées MSSA et Mr.RSA pour trois expériences différentes sont illustrées comme prévu pour les souches résistantes, la mort cellulaire normalisée est de faible amplitude inférieure à 0,5 % et ne change pas au cours de l’expérience.

Cependant, les souches sensibles montrent une augmentation constante de la mort cellulaire et une valeur supérieure à 1 % à la fin de l’expérience. Le déclenchement de la mort cellulaire pour les souches sensibles varie légèrement d’une expérience à l’autre, mais se produit généralement entre 10 et 30 minutes. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes résistants aux antibiotiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles qu’une technique septique doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Cette technique permettra aux chercheurs d’explorer comment les bactéries réagissent au stress et aura un impact sur le développement de nouveaux diagnostics rapides et la découverte de nouveaux médicaments.