Transformation de la levure et Clonage

La levure ou Saccharomyces cerevisiae est un organisme modèle eucaryote simple et commun qui est utilisé pour l’étude de la génétique et de la biologie cellulaire qui peut donner un aperçu des procédés cellulaires humains. Cette vidéo discute de la transformation, l’assimilation d’ADN étranger par la cellule de levure. Elle va introduire les plasmides de levure, décrire la façon de préparer des cellules de levure pour la transformation, présenter une procédure de transformation étape par étape, et fournir quelques applications de cette technique fondamentale.

Avant de discuter de la transformation de la levure, commençons par parler d'un type d’ADN utilisé dans la transformation : le plasmide. Un plasmide est un petit ADN circulaire à double-brin qui peut s’enrouler de sorte à traverser facilement une membrane cellulaire par ses pores.

Les plasmides contiennent un site de clonage multiple (ou SCM) où les endonucléases de restriction également appelées enzymes de restriction, peuvent couper l’ADN. Les fragments d’ADN d'intérêt coupés avec les mêmes enzymes peuvent alors être ligaturés dans le SCM. Les plasmides contiennent également une origine de réplication ou ORI qui signale à la cellule le point de départ de la réplication. De plus, les plasmides possèdent un marqueur de sélection qui permet aux cellules de levure contenant le plasmide de croître dans des conditions environnementales spécifiques. Les levures qui n'incorporent pas le plasmide correctement ne survivront pas dans un milieu contenant le marqueur de sélection. Les marqueurs de sélection peuvent coder pour des gènes conférant une résistance aux médicaments, ou des gènes codant des enzymes qui permettent à une souche de levure de synthétiser des acides aminés qu’ils ne pourraient produire autrement.

Les vecteurs navettes sont des plasmides qui peuvent se répliquer dans plusieurs espèces hôtes. Par exemple, un plasmide d’E. Coli peut se développer dans la levure. Les plasmides de levure peuvent être réplicatifs ou intégratifs, ce qui signifie que le plasmide peut soit se combiner à l’ADN génomique soit rester indépendant.

Il existe 5 types principaux de plasmides ou vecteurs utilisés dans la levure. Les deux le plus souvent utilisés dans la transformation de la levure sont le plasmide épisomique de levure ou YEp (yeast episomal plasmid en anglais) et le plasmide centrométrique de levure ou YCp (yeast centrometric plasmid en anglais). Ces types de vecteurs contiennent tous deux une séquence de réplication autonome ou ARS. L’ARS contient l’origine de réplication et permet la réplication extra-chromosomique de la levure.

Plusieurs procédures peuvent être utilisées pour la transformation de la levure, notamment la méthode des sphéroplastes, l’électroporation et la transformation avec acétate de lithium. Dans cette vidéo nous allons nous centrer sur la procédure avec acétate de lithium.

Dans cette méthode de transformation, les cations de lithium chargés positivement neutralisent les charges négatives sur la membrane cellulaire et l’ADN plasmidique. L’ADN simple brin, ajouté au mélange de transformation, se lie à la paroi cellulaire de la levure et rend l’ADN plasmidique disponible pour l’absorption par les cellules de levure. L’exposition à une augmentation soudaine de température ou choc thermique génère une différence de pression entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule créant des pores par lesquels l’ADN plasmidique peut passer. Lorsque la température baisse, la paroi cellulaire de la levure se reforme et la transformation s'achève.

Commençons avec une procédure étape par étape de la préparation de la levure pour la transformation. Les cellules de levure doivent être préparées en prélevant tout d'abord une colonie sur une plaque de gélose et en la multipliant sur un milieu de culture constitué d’extrait de levure, de peptone et de dextrose abrévié YPD-un milieu complet pour la culture de levure.

Une fois la colonie prélevée sur une plaque et cultivée sur un milieu de culture YPD, la culture est incubée une nuit à 30 °C sous agitation sur un appareil orbital ou rotatif, comme celui-ci. Les cellules de levures sont sédimentées par centrifugation et le surnageant est éliminé. Les culots cellulaires sont remis en suspension dans une solution tampon de choix ou dans de l’eau stérilisée. Les cellules de levures compétentes préparées ainsi seront utilisées dans la procédure de transformation.

Une fois les cellules de levure préparées, la transformation peut être réalisée en préparant tout d'abord le mélange de transformation.

Ce mélange réactif doit contenir: de l’eau stérilisée et distillée, une solution à 50% de polyéthylène glycol ou PEG, de l’acétate de lithium à 1M, une solution d’ADN simple brin à 10mg/mL, de l’ADN plasmidique et des cellules de levures compétentes. Les proportions exactes de chaque solution doivent être calculées avant le début des expériences en consultant le protocole standard de votre laboratoire pour la transformation des levures.

Le mélange est alors incubé à 30 °C pendant 30 minutes sous agitation. La solution doit être mélangée sans vortex afin d’éviter les ruptures de cellules de levure.

Les cellules subissent un choc thermique en les plaçant dans un bain marie à 42 °C pendant 15 minutes puis en les refroidissant avec de la glace pendant 2 minutes. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation.

Les cellules sont remises en suspension dans de l’eau distillée deux fois et sont placées sur des plaques d’agar qui seront sélectives pour les transformants désirés. Les plaques de transformation sont alors incubées à 30 °C pendant 2 à 4 jours jusqu’à la formation des colonies.

Les procédures de transformation doivent toujours inclure des plaques de contrôle positif et négatif jusqu’à leur optimisation. Le contrôle positif doit être une suspension de cellules de levure avec un ADN plasmidique sur une plaque YPD exempte de tout marqueur de sélection. Cela indique que les cellules sont saines après la procédure de transformation. Le contrôle de plaque négatif consiste en une suspension de cellules de levure sur une plaque de sélection appropriée telle qu'une plaque contenant des antibiotiques. Cette plaque ne doit contenir aucune colonie et montrer qu’il n’y a pas de contamination.

Il existe une multitude d’applications pour la transformation de la levure. Une application de la levure transformée est l’utilisation d’un système double-hybride pour identifier les protéines qui interagissent avec la protéine d’intérêt ou protéine « appât ». Lorsqu’un plasmide issu d’une bibliothèque de ligands potentiels, ou protéines « proies », est transformée et qu'il y a interaction, un facteur de transcription est libéré qui va ensuite activer un gène rapporteur tel que la β-galactosidase. Quand positionné sur des plaques contenant du X-gal - un substrat de β-galactosidase - le gène rapporteur entrainera une coloration en bleue des colonies qui ont une interaction.

De nombreuses délétions peuvent être générées génétiquement dans la levure par une technique utilisant le cycle sexuel. Les cellules haploïdes contenant un locus supprimé et un rapporteur sont combinées en une cellule par combinaison aléatoire ou recombinaison méiotique. Les marqueurs de sélection sont utilisés pour sélectionner les levures ayant réussi à incorporer les délétions. Dans ce cas, la cytométrie en flux est utilisée pour sélectionner des cellules exprimant le GFP.

La levure peut être transformée avec des protéines fluorescentes pour l’observation des effets de mutations sur les interactions entre protéines. Cet article vidéo utilise la microscopie à fluorescence pour étudier les effets de différentes mutations sur les interactions entre protéines essentielles à l’endocytose.

Vous venez de regarder une vidéo de JoVE sur la transformation de la levure. Vous devez maintenant connaître les caractéristiques de base d’un plasmide, la façon de préparer les cellules de levure pour la transformation, et comment effectuer les procédures de transformation. Comme d’habitude, merci de votre attention!