Transformation de la levure et Clonage

Yeast Transformation and Cloning
JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans
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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans
Yeast Transformation and Cloning

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08:30 min
April 30, 2023

Overview

Les S. cerevisiae sont des organismes unicellulaires eucaryotes communément utilisés comme organisme modèle en recherche biologique. Dans le cadre de leur travail, les chercheurs spécialisés sur la levure s’appuient sur la technique fondamentale de la transformation (l’assimilation d’ADN étranger par une cellule) pour contrôler l’expression des gènes, induire des délétions génétiques, exprimer des protéines recombinantes et marquer les structures sous-cellulaires.

Cette vidéo donne un aperçu de comment et pourquoi la transformation de la levure est effectuée en laboratoire. Les caractéristiques importantes des plasmides de levure seront présentées, ainsi que la procédure requise pour la préparation des cellules de levure en vue de l’intégration de nouveaux plasmides. Cette présentation inclut également un protocole étape par étape de la méthode d’acétate de lithium pour la transformation de la levure. Cette vidéo se termine avec des exemples parmi les nombreuses applications de cette technique essentielle.

Procedure

La levure ou Saccharomyces cerevisiae est un organisme modèle eucaryote simple et commun qui est utilisé pour l’étude de la génétique et de la biologie cellulaire qui peut donner un aperçu des procédés cellulaires humains. Cette vidéo discute de la transformation, l’assimilation d’ADN étranger par la cellule de levure. Elle va introduire les plasmides de levure, décrire la façon de préparer des cellules de levure pour la transformation, présenter une procédure de transformation étape par étape, et fournir quelques applications de cette technique fondamentale.

Avant de discuter de la transformation de la levure, commençons par parler d’un type d’ADN utilisé dans la transformation : le plasmide. Un plasmide est un petit ADN circulaire à double-brin qui peut s’enrouler de sorte à traverser facilement une membrane cellulaire par ses pores.

Les plasmides contiennent un site de clonage multiple (ou SCM) où les endonucléases de restriction également appelées enzymes de restriction, peuvent couper l’ADN. Les fragments d’ADN d’intérêt coupés avec les mêmes enzymes peuvent alors être ligaturés dans le SCM. Les plasmides contiennent également une origine de réplication ou ORI qui signale à la cellule le point de départ de la réplication. De plus, les plasmides possèdent un marqueur de sélection qui permet aux cellules de levure contenant le plasmide de croître dans des conditions environnementales spécifiques. Les levures qui n’incorporent pas le plasmide correctement ne survivront pas dans un milieu contenant le marqueur de sélection. Les marqueurs de sélection peuvent coder pour des gènes conférant une résistance aux médicaments, ou des gènes codant des enzymes qui permettent à une souche de levure de synthétiser des acides aminés qu’ils ne pourraient produire autrement.

Les vecteurs navettes sont des plasmides qui peuvent se répliquer dans plusieurs espèces hôtes. Par exemple, un plasmide d’E. Coli peut se développer dans la levure. Les plasmides de levure peuvent être réplicatifs ou intégratifs, ce qui signifie que le plasmide peut soit se combiner à l’ADN génomique soit rester indépendant.

Il existe 5 types principaux de plasmides ou vecteurs utilisés dans la levure. Les deux le plus souvent utilisés dans la transformation de la levure sont le plasmide épisomique de levure ou YEp (yeast episomal plasmid en anglais) et le plasmide centrométrique de levure ou YCp (yeast centrometric plasmid en anglais). Ces types de vecteurs contiennent tous deux une séquence de réplication autonome ou ARS. L’ARS contient l’origine de réplication et permet la réplication extra-chromosomique de la levure.

Plusieurs procédures peuvent être utilisées pour la transformation de la levure, notamment la méthode des sphéroplastes, l’électroporation et la transformation avec acétate de lithium. Dans cette vidéo nous allons nous centrer sur la procédure avec acétate de lithium.

Dans cette méthode de transformation, les cations de lithium chargés positivement neutralisent les charges négatives sur la membrane cellulaire et l’ADN plasmidique. L’ADN simple brin, ajouté au mélange de transformation, se lie à la paroi cellulaire de la levure et rend l’ADN plasmidique disponible pour l’absorption par les cellules de levure. L’exposition à une augmentation soudaine de température ou choc thermique génère une différence de pression entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule créant des pores par lesquels l’ADN plasmidique peut passer. Lorsque la température baisse, la paroi cellulaire de la levure se reforme et la transformation s’achève.

Commençons avec une procédure étape par étape de la préparation de la levure pour la transformation. Les cellules de levure doivent être préparées en prélevant tout d’abord une colonie sur une plaque de gélose et en la multipliant sur un milieu de culture constitué d’extrait de levure, de peptone et de dextrose abrévié YPD-un milieu complet pour la culture de levure.

Une fois la colonie prélevée sur une plaque et cultivée sur un milieu de culture YPD, la culture est incubée une nuit à 30 °C sous agitation sur un appareil orbital ou rotatif, comme celui-ci. Les cellules de levures sont sédimentées par centrifugation et le surnageant est éliminé. Les culots cellulaires sont remis en suspension dans une solution tampon de choix ou dans de l’eau stérilisée. Les cellules de levures compétentes préparées ainsi seront utilisées dans la procédure de transformation.

Une fois les cellules de levure préparées, la transformation peut être réalisée en préparant tout d’abord le mélange de transformation.

Ce mélange réactif doit contenir: de l’eau stérilisée et distillée, une solution à 50% de polyéthylène glycol ou PEG, de l’acétate de lithium à 1M, une solution d’ADN simple brin à 10mg/mL, de l’ADN plasmidique et des cellules de levures compétentes. Les proportions exactes de chaque solution doivent être calculées avant le début des expériences en consultant le protocole standard de votre laboratoire pour la transformation des levures.

Le mélange est alors incubé à 30 °C pendant 30 minutes sous agitation. La solution doit être mélangée sans vortex afin d’éviter les ruptures de cellules de levure.

Les cellules subissent un choc thermique en les plaçant dans un bain marie à 42 °C pendant 15 minutes puis en les refroidissant avec de la glace pendant 2 minutes. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation.

Les cellules sont remises en suspension dans de l’eau distillée deux fois et sont placées sur des plaques d’agar qui seront sélectives pour les transformants désirés. Les plaques de transformation sont alors incubées à 30 °C pendant 2 à 4 jours jusqu’à la formation des colonies.

Les procédures de transformation doivent toujours inclure des plaques de contrôle positif et négatif jusqu’à leur optimisation. Le contrôle positif doit être une suspension de cellules de levure avec un ADN plasmidique sur une plaque YPD exempte de tout marqueur de sélection. Cela indique que les cellules sont saines après la procédure de transformation. Le contrôle de plaque négatif consiste en une suspension de cellules de levure sur une plaque de sélection appropriée telle qu’une plaque contenant des antibiotiques. Cette plaque ne doit contenir aucune colonie et montrer qu’il n’y a pas de contamination.

Il existe une multitude d’applications pour la transformation de la levure. Une application de la levure transformée est l’utilisation d’un système double-hybride pour identifier les protéines qui interagissent avec la protéine d’intérêt ou protéine « appât ». Lorsqu’un plasmide issu d’une bibliothèque de ligands potentiels, ou protéines « proies », est transformée et qu’il y a interaction, un facteur de transcription est libéré qui va ensuite activer un gène rapporteur tel que la β-galactosidase. Quand positionné sur des plaques contenant du X-gal – un substrat de β-galactosidase – le gène rapporteur entrainera une coloration en bleue des colonies qui ont une interaction.

De nombreuses délétions peuvent être générées génétiquement dans la levure par une technique utilisant le cycle sexuel. Les cellules haploïdes contenant un locus supprimé et un rapporteur sont combinées en une cellule par combinaison aléatoire ou recombinaison méiotique. Les marqueurs de sélection sont utilisés pour sélectionner les levures ayant réussi à incorporer les délétions. Dans ce cas, la cytométrie en flux est utilisée pour sélectionner des cellules exprimant le GFP.

La levure peut être transformée avec des protéines fluorescentes pour l’observation des effets de mutations sur les interactions entre protéines. Cet article vidéo utilise la microscopie à fluorescence pour étudier les effets de différentes mutations sur les interactions entre protéines essentielles à l’endocytose.

Vous venez de regarder une vidéo de JoVE sur la transformation de la levure. Vous devez maintenant connaître les caractéristiques de base d’un plasmide, la façon de préparer les cellules de levure pour la transformation, et comment effectuer les procédures de transformation. Comme d’habitude, merci de votre attention!

Transcript

Yeast or Saccharomyces cerevisiae, is a widespread simple eukaryotic model organism used in the study of genetics and cell biology that can give insights into human cellular processes. This video discusses transformation – the uptake of foreign DNA by the yeast cell. It will introduce yeast plasmids, how to prepare yeast cells for transformation, a step-by-step transformation procedure, and will provide some applications of this fundamental technique.

Before we talk about the transformation of yeast, let’s first discuss a type of DNA used in transformation: the plasmid. A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA that can supercoil so it can easily pass through pores in a cell membrane.

Plasmids contain a multiple cloning site or MCS where restriction endonucleases, AKA “restriction enzymes”, can cut DNA. DNA fragments of interest cut with the same enzymes can then be ligated into the MCS. Plasmids also contain an origin of replication or ORI that signals to the cell where replication should begin. In addition, plasmids have a selectable marker, which allows the yeast cells that contain the plasmid to grow under specific environmental conditions. Yeast that don’t successfully incorporate the plasmid will not survive in media containing the selectable marker. The selectable markers can encode for genes that enable drug-resistance or genes that encode enzymes that enable a yeast strain to synthesize amino acids that they otherwise cannot produce.

Shuttle vectors are plasmids that can replicate in more than one host species. For instance, a plasmid from E. Coli can grow in yeast. Yeast Plasmids can be non-integrating or integrating, mean that the plasmid either combines with the genomic DNA or remains independent.

There are five different general types of plasmids or vectors that are used in yeast. The two that are used most often in the transformation of yeast are the yeast episomal plasmid or YEp and the yeast centrometic plasmid or YCp . Both of these types of vectors contain an autonomous replication sequence or ARS. The ARS contains the origin of replication and allows for extrachromosomal replication in yeast.

There are several different procedures that can be used to transform yeast which include the spheroplast method, electroporation, and lithium acetate-mediated transformation. For this video we will focus on the lithium acetate procedure.

In this transformation method positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA Single-stranded DNA – added to the transformation mixture – binds to the cell wall of the yeast and leaves the plasmid DNA available for uptake by the yeast cells . The exposure to a sudden increase in temperature, or heat shock creates a pressure difference between the inside and outside of the cell creating pores that plasmid DNA can pass through. When the temperature is decreased, the yeast cell wall will reform and transformation is complete.

Let’s begin with a step-by-step procedure of how to prepare yeast for transformation. Yeast cells must be prepared by first picking a colony from an agar plate and amplifying the colony in yeast extract peptone dextrose medium, abbreviated YPD – a complete medium for yeast growth.

After the colony is picked from a plate and placed into YPD medium, the culture is incubated overnight at 30 °C with agitation on a shaker or roller apparatus, like you see here. The yeast cells are pelleted by centrifugation and the supernant is removed. The pelleted cells are resuspend with the desired buffer or sterile water. These competent prepared yeast cells will be used in the transformation procedure.

Once yeast cells have been prepared, transformation can be carried out by first preparing the transformation mixture.

This reagent mixture should include: sterile distilled water; a solution of 50% polyethylene glycol or PEG, 1M lithium acetate, 10 mg/ml solution of single-stranded DNA, plasmid DNA and competent yeast cells. The exact proportions of each solution should be calculated before beginning the experiment by consulting your laboratory’s standard protocol for yeast transformation.

The mixture is then incubated at 30 °C for 30 minutes with shaking. The solution should be mixed, not vortexed, to ensure the yeast cells do not break apart.

The cells are heat-shocked by placement in a 42 °C water bath for 15 minutes followed by cooling on ice for 2 minutes. The cells are then harvested by centrifugation.

Cells are resuspended in double-distilled water and are plated on agar plates that will select for the desired transformants. Transformation plates are then incubated at 30 °C for two to four days until colonies form.

Transformation procedures should always include positive and negative control plates until they are optimized. The positive control should be a yeast cell suspension with plasmid DNA on a YPD plate that does not contain any selectable marker. This shows that the cells are healthy following the transformation procedure. The negative control plate should be a yeast cell suspension on an appropriate selection plate, such as one that contains antibiotics. The plate should have no colonies and shows that there is no contamination.

There are a myriad of different applications for yeast transformation. One application of transformed yeast is to use a yeast-two hybrid system to identify proteins that interact with your protein of interest, or the bait protein. When a plasmid from a library of candidate binding partners, or prey proteins, are transformed and there is an interaction, a transcription factor is released that will activate a reporter gene, such as Beta-galactosidase. The reporter gene will turn colonies that have an interaction blue when on plates that contain X-gal — a substrate for beta-galadosidase.

Multiple deletions can be engineered into yeast through a technique using sexual cycling. Haploid cells that contain a reporter and deleted locus are combined into one cell through random assortment or meiotic recombination. Selectable markers are used to select for yeast that have successfully incorporated the deletions. In this case, flow cytometry is used to select for cells that express GFP.

Yeast can be transformed with proteins that are fluorescently labeled to view the effect of mutations on protein-protein interactions. This video-article used fluorescent microscopy to study the effects of different mutations on protein-protein interactions essential for endocytosis.

You’ve just watched JoVEs video on yeast transformation. You should now understand the basic aspects of a plasmid, how to prepare yeast cells for transformation and how to perform the transformation procedure. As always, thanks for watching!