Name: Dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs Yamanaka (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T09:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Découvrez la reprogrammation in vivo de cellules somatiques vers la pluripotence par injection hydrodynamique des facteurs Yamanaka dans la veine caudale. Cette méthode permet d'étudier la plasticité cellulaire sans formation de tératomes.

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Ce travail a été partiellement soutenu par le Conseil de recherche en ingénierie et en sciences physiques (EPSRC, Swindon, Royaume-Uni) et les programmes FP-7 de la Commission européenne NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) et ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY a été soutenu par une bourse de doctorat à temps plein du ministère de l’Éducation (Turquie) et IL reconnaît le soutien partiel du British Council et de la Fondation CAIXA (Espagne). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

1. Reprogrammation in vivo du tissu hépatique par HTV Administration d’ADNp
<ol>
	<li>Laissez les souris femelles Balb/C, âgées de 6 semaines, s’acclimater à l’animalerie pendant une semaine avant d’effectuer toute procédure.</li>
	<li>Préparez une solution saline à 0,9 % dans de l’eau distillée et filtrez à travers un microfiltre de 0,22 μm.</li>
	<li>Préparez une solution avec 75 μg de pCX-OKS-2A et 75 μg d’ADN plasmidique pCX-cMyc dans 1,5 ml de solution saline à 0,9 % par souris. note: Le volume total d’injection doit être compris entre 8 et 10 % du poids corporel total. 
	Remarque : avant l’injection, conservez les souris dans une chambre de chauffe à 37 °C jusqu’à ce que les veines de la queue soient facilement visualisées et apparaissent dilatées.</li>
	<li>Induire une anesthésie avec de l’isoflurane avant (dans la chambre de chauffe) et pendant l’injection (avec un masque anesthésique).</li>
	<li>Administrer la solution d’ADNp ou le contrôle salin avec une seringue de 27 G par injection de HTV. Remarque : pour que la transfection réussisse, le volume total doit être injecté en 5 à 7 secondes maximum.</li>
	<li>Veillez à ce que les animaux se remettent correctement de l’injection.</li>
</ol>
2. Perfusion hépatique et isolement des hépactocytes primaires pour les études qRT-PCR
<ol>
	<li>À différents moments, y compris 2, 4, 8, 12 et 24 jours après l’injection de HTV, induisez une anesthésie profonde avec de l’isoflurane.</li>
	<li>Vaporisez de l'éthanol à 70 % sur l'abdomen de l'animal, faites une incision à travers la peau sur la ligne médiane ventrale avec des ciseaux chirurgicaux et disséquez la couche musculaire abdominale pour exposer les viscères.</li>
	<li>Coupez le diaphragme pour exposer la cavité thoracique avec des ciseaux et clampez la veine cave avec une pince de verrouillage.</li>
	<li>Déplacez les viscères vers la droite et les lobes du foie de manière à ce que le cave inférieur et la veine porte soient facilement accessibles.</li>
	<li>Canulez la veine cave inférieure avec un cathéter de 22 G et coupez la veine porte pour éviter un excès de pression.</li>
	<li>Commencer la perfusion avec 10 ml de tampon HBSS (sans Ca2+ et Mg2+, avec du bicarbonate), préchauffé à 37 °C. Perfuser lentement le tampon avec une seringue de 10 ml, jusqu’à ce que le foie blanchisse (3 min).</li>
	<li>Poursuivre la perfusion avec le milieu Liver Digest, préchauffé à 37 °C, à un débit de 0,6 ml/min (pendant 15 min) jusqu’à ce que le foie devienne gonflé et lâche. note: Une digestion et une perfusion excessives peuvent endommager les hépatocytes ou les cellules reprogrammées.</li>
	<li>Poursuivez l’expérience à 4 °C.</li>
	<li>Retirez le foie à l’aide d’une pince après avoir coupé les ligaments falciforme et coronaire et lavez-le avec un produit de lavage pour hépatocytes, tout en le passant dans une crépine cellulaire de 100 μm pour obtenir une suspension cellulaire.</li>
	<li>Prélever la suspension cellulaire dans des tubes de 50 ml et ajuster le volume à 15 ml avec le produit de lavage hépatocytaire.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 50 g pendant 4 min. Maintenir la température à 4 °C. Jeter le surnageant (qui contient Kupffer et les cellules épithéliales) et remettre en suspension la pastille cellulaire (contenant les hépatocytes) dans 10 ml de produit de lavage des hépatocytes. note: La pastille cellulaire doit être remise en suspension très soigneusement, les hépatocytes sont des cellules très fragiles.</li>
	<li>Répétez la procédure de centrifugation trois fois au total et remettez en suspension la pastille finale dans 10 ml de produit de lavage hépatocytaire.</li>
	<li>Estimez le nombre de cellules à l’aide d’un microscope optique et d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Préparer des aliquotes de 2 x 106 cellules, centrifuger à 300 x g pour récupérer toutes les cellules et jeter le surnageant.</li>
	<li>À ce stade, la pastille cellulaire peut être congelée et conservée à -20 °C jusqu’à un traitement ultérieur ou utilisée immédiatement pour l’extraction de l’ARN.</li>
</ol>
3. Etude de l’expression génique d’hépatocytes isolés pour la régulation positive de gènes pluripotents
<ol>
	<li>Extrayez l’ARN de 2 x 106 cellules avec un kit de colonne de spin en suivant les instructions du fournisseur.</li>
	<li>Utilisez 1 μg de l’ARN extrait pour effectuer une qRT-PCR en deux étapes en suivant les instructions du fournisseur.</li>
	<li>Utilisez les hépatocytes des animaux injectés de solution saline comme contrôle pour corriger l’expression génique relative de la reprogrammation, de la pluripotence et des marqueurs hépatocytaires.</li>
</ol>
4. Analyse par cytométrie en flux de la pluripotence accrue au niveau de la protéine
<ol>
	<li>Les jours 1 et 4 après l’injection, effectuer une perfusion hépatique et isoler les hépatocytes primaires comme indiqué ci-dessus.</li>
	<li>Ajuster la densité cellulaire à 1 x 107 cellules/ml et préparer des aliquotes de 100 μl.</li>
	<li>Fixez les cellules avec le tampon de fixation BD Cytofix et perméabilisez avec 1x tampon BD Perm/Wash.</li>
	<li>Incuber les cellules avec l’anti-souris OCT4-PerCP-Cy5.5 ou l’anti-souris Nanog-PE pendant 30 min.</li>
	<li>Incluez des contrôles négatifs et isotypes.</li>
	<li>Analysez les cellules colorées par le cytomètre en flux de recherche haute performance CyAn ADP.</li>
</ol>
5. Immunocoloration de coupes hépatiques pour des marqueurs de pluripotence
<ol>
	<li>Quatre jours après l’injection, perfuser le foie comme indiqué ci-dessus, mais uniquement avec un tampon HBSS afin d’éliminer le sang du tissu hépatique.</li>
	<li>Coupez un morceau de tissu hépatique et plongez-le dans du 2-méthylbutane (prérefroidi dans de l’azote liquide) afin de poursuivre la cryosection.</li>
	<li>Les tissus congelés peuvent être conservés à -80 °C ou coupés directement en sections de 14 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.</li>
	<li>Faites sécher à l’air libre les sections de tissu pendant 1 heure à température ambiante et post-fixation avec du méthanol, prérefroidi à -20 °C pendant 10 min. Sécher à l’air libre pendant 15 min, puis laver les sections deux fois avec du PBS (5 min chacune).</li>
	<li>Incuber les sections dans un tampon de blocage (5 % de sérum de chèvre-0,1 % de Triton dans le PBS pH 7,3) à température ambiante pendant 1 heure, suivi de deux étapes de lavage avec un tampon de lavage (1 % BSA-0,1 % de Triton dans du PBS, pH 7,3).</li>
	<li>Incuber les coupes de tissu pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires anti-OCT4, anti-SOX2 et anti-Nanog.</li>
	<li>Le lendemain, lavez les sections 3 fois (5 min chacune) avec un tampon de lavage et incubez-les pendant 1,5 heure à température ambiante avec l’anticorps secondaire.</li>
	<li>Lavez des coupes de foie avec du PBS (3x, 5 min chacune) et montez-les dans du DAPI et un milieu contenant de l’anti-décoloration.</li>
	<li>Visualisez les lames au microscope à épifluorescence.</li>
</ol>
6. Coloration à la phosphatase alcaline (ALP) de coupes de tissus hépatiques
<ol>
	<li>Obtenez des coupes de tissu hépatique comme décrit précédemment.</li>
	<li>Réchauffez les sections de tissu à température ambiante pendant 15 minutes avant d’effectuer la coloration.</li>
	<li>Fixer avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 2 min. Remarque : un temps de fixation excessif peut diminuer l’activité de l’ALP.</li>
	<li>Faites sécher les sections à l’air libre pendant 30 min, puis incubez avec un substrat liquide BCIP/NBT à 37 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Lavez les lames à l’eau distillée et fixez-les avec un support de montage aqueux.</li>
	<li>Capturez des images aléatoires par microscopie optique.</li>
</ol>
7. Quantification des taux d’albumine et d’enzymes hépatiques dans le sérum pour évaluer la toxicité hépatique
<ol>
	<li>Les jours 4, 8, 12 et 120 après la transfection, prélevez 300 μl de sang directement dans le ventricule cardiaque.</li>
	<li>Gardez le sang sur de la glace pendant que les différents échantillons sont prélevés pour éviter la coagulation.</li>
	<li>Une fois que tous les échantillons sont prêts, incuber pendant 30 minutes à 37 °C jusqu’à ce que le sang coagule.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 2 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Pipeter soigneusement le sérum (dans le surnageant) dans un nouveau tube Eppendorf et congeler à -80 °C jusqu’au traitement des échantillons.</li>
	<li>Analysez les taux sériques pour l’albumine, l’ALT, l’AST, l’ALP et le GLDH.</li>
</ol>
8. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et à l’acide périodique (PAS) des coupes de foie pour évaluer la toxicité hépatique
<ol>
	<li>À différents moments, y compris 2, 4, 8, 12, 24, 50 et 120 jours après l’injection de HTV ; effectuez une perfusion hépatique avec un tampon HBSS uniquement comme décrit précédemment.</li>
	<li>Coupez un morceau de tissu hépatique et fixez-le à 4 % de paraformaldéhyde.</li>
	<li>Intégrez le tissu hépatique dans des blocs de paraffine, sectionnez et colorez avec une coloration H&E ou PAS.</li>
	<li>Capturez des images aléatoires par microscopie optique.</li>
</ol>

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<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Adeno-Associated+Viral+Vectors+For+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy.</a> Gene Ther. 19, 162-168 (2012).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+And+Prospects%3A+Naked+Dna+Gene+Transfer+And+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy.</a> Gene Ther. 10, 453-458 (2003).</li>
<li>Wolff, J. A., Budker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+Of+Naked+Dna+Uptake+And+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression.</a> Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Cette étude fournit une preuve de principe de la reprogrammation cellulaire in vivo vers la pluripotence suite au transfert efficace et à la surexpression des facteurs OKSM dans le foie de souris adulte. À l’aide de différentes techniques telles que la qRT-PCR, la cytométrie en flux, l’IHC ou l’analyse sérique, le tissu cible a été étudié pour observer la reprogrammation cellulaire in vivo . Très rapidement, à partir de l’induction de la surexpression du facteur OKSM dans le tissu, les marqueurs de pluripotence ont été régulés à la hausse aux niveaux de l’ARNm et des protéines (dans les 48 heures). Tout au long de ces expériences, entre 5 et 15 % des cellules extraites du tissu se sont révélées positives pour le Nanog et l’Oct3/4. De plus, aucune anomalie structurelle ou fonctionnelle n’a été observée dans le foie pendant 120 jours. L’expression de transgènes par injection HTV d’ADN plasmidique dans des tissus autres que le foie (poumon, rate, rein et cœur) a déjà été rapportée, mais les niveaux d’expression génique étaient inférieurs d’au moins 3 ordres de grandeur à ceux des hépatocytes30. Les données de cette étude indiquent que la reprogrammation des cellules somatiques vers un état pluripotent in vivo est sûre, rapide et efficace. Compte tenu de la majorité des méthodologies de reprogrammation cellulaire in vitro existantes qui permettent généralement de générer des cellules pluripotentes (iPS) en 3 semaines avec une efficacité inférieure à 1 %32, la reprogrammation in vivo à la pluripotence peut offrir des alternatives très intéressantes. Nous émettons l’hypothèse que le concept de reprogrammation in vivo de la pluripotence pourrait être appliqué à divers types de cellules somatiques avec une efficacité élevée (en fonction du vecteur utilisé), mais le niveau de pluripotence fonctionnelle atteint dans les cellules reprogrammées in vivo devra être déterminé. De plus, grâce à la mise au point de protocoles et de technologies améliorés, les cellules reprogrammées in vivo pourraient être extraites et utilisées à des fins de médecine régénérative.
Il y a quelques étapes critiques à suivre afin de reprogrammer des cellules somatiques adultes in vivo avec une grande efficacité. L’obtention de niveaux élevés d’expression génique dans le tissu cible est une condition préalable. Dans cette étude, cela a été illustré par l’utilisation du transfert et de l’expression efficaces de l’ADN plasmidique vers les hépatocytes à l’aide de l’injection de HTV. Les facteurs les plus importants pour l’injection de HTV sont le volume, qui doit être compris entre 8 et 10 % du poids corporel total de l’animal, et la vitesse d’injection, qui doit être effectuée dans les 5 à 7 secondes. Les souris de moins de 6 semaines ne doivent pas être utilisées, car l’injection de HTV peut causer plus de dommages tissulaires dans le foie, ce qui peut affecter l’efficacité de la reprogrammation cellulaire. Le patrimoine génétique des animaux n’a pas eu d’impact sur la détermination de l’efficacité de la reprogrammation in vivo , car nous avons précédemment signalé des niveaux similaires de reprogrammation chez les souris Balb/C et TNG-A, cette dernière étant une souche transgénique qui porte le rapporteur eGFP inséré dans le locus Nanog et qui est élevée sur le fond Sv12929.
Nous supposons que la reprogrammation cellulaire in vivo vers un état pluripotent (qui devra être déterminé) peut être appliquée à d’autres types de tissus à condition que les facteurs OKSM soient efficacement délivrés aux cellules cibles, permettant des niveaux élevés d’expression génique. Une variété de vecteurs d’administration de gènes non viraux et viraux ont été étudiés dans des essais précliniques et cliniques afin de cibler différents types de cellules et de tissus33. Par exemple, pour les tissus neuraux ou oculaires, les virus adéno-associés ont été le vecteur préféré pour un transfert de gènes in vivo efficace34-37, tandis que dans les tissus musculaires, il a été démontré que les injections d’ADN plasmidique nu entraînent des niveaux relativement élevés d’expression génique38,39. Par conséquent, la méthode de transfert de gène du vecteur doit être soigneusement sélectionnée en fonction du type de tissu afin d’obtenir une reprogrammation cellulaire in vivo efficace et rapide vers un état pluripotent.

Les préoccupations éthiques concernant l’utilisation des cellules souches embryonnaires ont été l’une des limites du développement de la recherche sur les cellules souches. Cependant, la découverte par Yamanaka et ses collègues que l’expression forcée de quatre facteurs de transcription (à savoir : Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) pourrait conduire à la reprogrammation in vitro des cellules somatiques en cellules pluripotentes, appelées cellules souches pluripotentes induites (iPS), a ouvert de nouvelles opportunités. Le transfert de gènes viraux1-5 et non viraux6-10, la translocation cytoplasmique des protéines11,12 et la transfection des miARN13-16 font partie des diverses méthodes utilisées aujourd’hui pour générer des cellules iPS. Pourtant, ces méthodologies de reprogrammation souffrent de divers problèmes qui limitent leur traduction en clinique, tels que : a) de graves limitations de l’efficacité de la reprogrammation cellulaire ; b) l’utilisation prédominante de vecteurs viraux ; c) des protocoles longs et en plusieurs étapes des conditions d’élevage ; et d) le risque de tumorigénicité par l’implantation des cellules iPS générées in vitro 17-20.
Le transfert de gènes de facteurs de transcription définis3 à 5 par les rétrovirus est la méthode la plus couramment utilisée pour reprogrammer les cellules somatiques. Cependant, il comporte les risques liés à la possibilité d’une mutagenèse insertionnelle, d’une transduction stable et d’une expression à long terme de proto-oncogènes21,22. Des vecteurs de transfert de gènes non viraux tels que l’ADNplasmidique 6, 7, 23 ou l’administration de l’ARN10 à l’aide de liposomes ou d’électroporation ont également été explorés. Bien que plus sûrs que les virus, ces vecteurs offrent une efficacité de transduction et de reprogrammation considérablement limitée24,25 .
L’un des dogmes centraux de ce domaine émergent est que l’implantation in vivo de cellules iPS conduira à leur différenciation incontrôlée et à la formation d’une masse tumorale (tératome), composée de divers tissus des trois couches germinales différentes. Par conséquent, le concept de reprogrammation à la pluripotence s’est principalement concentré sur les manipulations in vitro de cellules somatiques primaires extraites (le plus souvent des fibroblastes). Cependant, comme décrit ci-dessus, ce principe souffre de protocoles de culture cellulaire longs et complexes, y compris de multiples cycles de traitement (transfert de gènes, facteurs de croissance, antibiotiques, antioxydants) qui peuvent eux-mêmes augmenter les risques de formation de tératomes ou d’autres formes de tumorigenèse lors de l’implantation des cellules24-28.
Nous proposons que la reprogrammation des cellules somatiques adultes in vivo par la surexpression transitoire des facteurs de transcription OKSM ne conduise pas à la formation ultérieure de tératomes29. La méthode pour y parvenir dépendra de l’obtention de niveaux élevés d’expression du facteur de transcription dans le tissu cible de la manière la plus sûre possible. Dans cette étude, nous avons sélectionné une technologie de transfert de gènes sans virus qui s’est avérée cibler efficacement le foie afin de reprogrammer les cellules à la pluripotence in vivo. Cette technologie implique l’injection rapide et de grand volume de veine de queue hydrodynamique (HTV) d’ADN plasmidique30,31. Des niveaux d’expression élevés des gènes transfectés peuvent être atteints dans les hépatocytes adultes en suivant cette méthode de transfert de gènes non viraux. De plus, cette technologie minimise les risques potentiels liés à l’utilisation de vecteurs viraux (par exemple, insertion génomique permanente, mutagénèse insertionnelle).

<table><tbody><tr><td>pCX-OKS-2A pDNA</td><td>Addgene</td><td>19771</td><td>Obtenu à partir d’Addgene en tant que stab bactérien, production de plasmide effectuée dans Plasmid Factory (Allemagne)</td></tr><tr><td>pCX-cMyc</td><td>Addgene</td><td>19772</td><td>Obtenu à partir d’Addgene en tant que stab bactérien, production de plasmide réalisée dans Plasmid Factory (Allemagne)</td></tr><tr><td>0.22 &mu ; m filter</td><td>Milliopore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>B505</td><td></td></tr><tr><td>HBSS buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td>Ca2+ et Mg2+ sans bicarbonate, avec bicarbonate</td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Wash medium</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>100 & mu; Filtre cellulaire m</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’ARN nucléospin II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.25</td><td>Kit pour l’isolement de l’ARN à partir de cellules et de tissus</td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iO SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 amorce directe</td><td>Séquence Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA</td></tr><tr><td>Oct3/4 amorce inverse</td><td>Séquence Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>CTCAATGCTAGTTCGCTTCGCTTTTTTTTTTTC</td></tr><tr><td>Sox2 amorce directe</td> Séquence <td>Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG</td></tr><tr><td>Sox2 amorce inverse</td><td>Séquence Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>TCACATGTGCGACAGGGGCAG</td></tr><tr><td>C-myc amorce directe Séquence</td><td>Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC</td></tr><tr><td>C-myc amorce inverse</td><td>Séquence Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTGTGTGTG</td></tr><tr><td>Nanog amorce directe</td> Séquence <td>Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG</td></tr><tr><td>Nanog amorce inverse</td><td>Séquence Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>GCAATGGATGCTGGGATACTC</td></tr><tr><td>Ecat1 amorce directe</td><td>Séquence Sigma</td><td> donné dans les commentaires</td><td>TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT</td></tr><tr><td>Ecat1 amorce inverse</td><td>Séquence Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>ATGGGCCGCCATACGACGCTCAACT</td></tr><tr><td>Rex1 amorce directe</td> Séquence <td>Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>ACGAGTGGCAGTTTTTTTGTGA</td></tr><tr><td>Rex1 amorce inverse</td> Séquence <td>Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT</td></tr><tr><td>Alb amorce directe</td><td>Sigma</td><td>séquence donnée dans les commentaires</td><td>GTTCGCTACACCCAGAAAGC</td></tr><tr><td>Alb amorce inverse</td><td>Sigma</td><td>séquence donnée dans les commentaires</td><td>CCACACAAGGCAGTCTCTGA</td></tr><tr><td>Aat amorce directe</td><td>Sigma</td><td>séquence donnée dans les commentaires</td><td>CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG</td></tr><tr><td>Aat amorce inverse</td><td>Sigma</td><td>séquence donnée dans les commentaires</td><td>ATGGACAGTCTGGGGGAGTG</td></tr><tr><td>Trf amorce directe</td><td>Sigma</td><td>séquence donnée dans les commentaires</td><td>ACCATGTTGTGGTCTCACGA</td></tr><tr><td>Trf amorce inverse</td><td>Séquence Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG</td></tr><tr><td>B amorce directe d’actine</td> Séquence <td>Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>GACCTCTATGCCAACACAGT</td></tr><tr><td>B Amorce inverse d’actine</td><td>Séquence Sigma</td><td>donnée dans les commentaires</td><td>AGTACTTGCGCTCAGGAGGA</td></tr><tr><td>BD Cytofix tampon de fixation</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560585</tr><tr><td>1x Tampon BD Perm/Wash</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris OCT4-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris Nanog-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>X100-Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>lapin pAb anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>Utilisation à une concentration de 3 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>rabbit pAb anti-SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>Utilisation à une concentration de 1 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>rabbit pAb anti-Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892</td><td>Utilisation à une concentration de 1 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>mAb souris anti-SSEA1</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Utilisation à une concentration de 20 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>d’IgG anti-lapin pAb de chèvre marqués avec Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-165-003-JIR</td><td>Utilisation à une concentration de 1/250</td></tr><tr><td>IgG anti-souris pAb de chèvre marquées avec Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-165-003-JIR</td><td>Utilisation à une concentration de 1/250</td></tr><tr><td>Milieu de montage VECTASHIELD avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT Système de substrat liquide</td><td>Sigma</td><td>B1911</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage aqueux</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde</td><td>Fisher</td><td>AA433689M</td><td>La solution mère est de 16 %, l’utiliser à 4 %</td></tr> <tr><td>Hématoxyline et eosin</td><td>Sigma</td><td>GH53/HT110216</td><td></td></tr><tr><td>Coloration PAS</td><td>Sigma</td><td>395B</td><td></td></tr></tbody></table>

dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs yamanaka

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) qui résultent de la reprogrammation des cellules somatiques à un état pluripotent par l’expression forcée de facteurs définis offrent de nouvelles opportunités pour la médecine régénérative. De telles applications cliniques des cellules iPS ont été limitées jusqu’à présent, principalement en raison de la faible efficacité des méthodologies de reprogrammation existantes et du risque que les cellules iPS générées forment des tumeurs lors de l’implantation.
Nous avons émis l’hypothèse que la reprogrammation des cellules somatiques vers la pluripotence pourrait être réalisée in vivo par transfert de gènes de facteurs de reprogrammation. Afin de reprogrammer efficacement les cellules in vivo, des niveaux élevés de facteurs de transcription Yamanaka (OKSM) doivent être exprimés au niveau du tissu cible. Cela peut être réalisé en utilisant différents vecteurs de gènes viraux ou non viraux en fonction du tissu cible. Dans cette étude particulière, l’injection hydrodynamique de l’ADN plasmidique dans la veine de la queue (HTV) a été utilisée pour délivrer les facteurs OKSM aux hépatocytes de souris. Cela a fourni la preuve de la reprogrammation in vivo des cellules somatiques adultes vers un état pluripotent avec une efficacité élevée et une cinétique rapide. De plus, aucune formation de tumeur ou de tératome n’a été observée in situ.
On peut conclure que la reprogrammation des cellules somatiques in vivo peut offrir une approche potentielle pour induire une pluripotence accrue rapidement, efficacement et en toute sécurité par rapport aux protocoles réalisés in vitro et peut être appliquée à différents types de tissus à l’avenir.

Figure 1 montre un aperçu de la procédure impliquant le transfert génique de plasmides codant pour OKSM vers le foie de souris et les différentes techniques réalisées pour observer la reprogrammation cellulaire in vivo. Après l'injection par HTV des plasmides, une augmentation significative de l'expression génique des facteurs de reprogrammation transférés (Oct3/4, Sox2, Klf4 et cMyc) au niveau de l'ARNm a été observée le jour 2 suivant l'injection. L'expression de ces facteurs diminue au fil du temps après l'injection, comme indiqué dans Figure 2a. En ce qui concerne l'expression des marqueurs endogènes de pluripotence (Nanog, Ecat1 et Rex1), leurs niveaux ont été fortement surexprimés par rapport à ceux des hépatocytes provenant d'animaux injectés avec une solution saline aux jours 2 et 4 après l'injection, puis sont revenus aux niveaux de base à partir du jour 8 (Figure 2b). Parallèlement, la dédifférenciation de la population d'hépatocytes a été confirmée par la répression des gènes spécifiques aux hépatocytes (Alb, Aat et Trf), réduction statistiquement significative au jour 4 et revenant aux niveaux de base à partir du jour 8 (Figure 2d).
L'expression d'Oct3/4 et de Nanog au niveau protéique a été étudiée par cytométrie en flux. Comme illustré dans la figure 2c, seul Oct3/4 est exprimé au jour 1 après l'injection de HTV, tandis que pour l'expression du marqueur endogène de pluripotence Nanog, il a fallu attendre jusqu'au jour 4.
La survenue d'une reprogrammation cellulaire in vivo a été confirmée par une analyse immunohistochimique des tissus hépatiques à l'aide d'anticorps anti-OCT4, anti-SOX2 et anti-Nanog, ainsi que par une coloration spécifique de l'activité de la phosphatase alcaline (ALP). Des cellules positives pour tous les marqueurs et pour l'activité enzymatique sont régulièrement observées dans les tissus hépatiques des animaux injectés avec OKSM, mais pas dans ceux des témoins injectés avec une solution saline (Figure 3).
Les effets secondaires possibles de toxicité et la formation de tératomes suite à la reprogrammation cellulaire in vivo par injection HTV d'ADN plasmidique ont été étudiées par quantification des niveaux d'enzymes hépatiques dans le sérum, ainsi que par colorations H&amp;E et PAS de coupes de tissu hépatique sur une période de 120 jours. Des signes transitoires et non sévères de lésions tissulaires ont été observés jusqu'au jour 2, mais pas au-delà. Aucune formation de tératome ni aucun signe de dysplasie ou d'altérations morphologiques n'ont été observés pendant la durée de l'étude (Figure 4). Aucune anomalie structurelle ou fonctionnelle hépatique n'a été détectée tout au long de l'étude chez aucun des animaux, comme le confirment les taux d'albumine et d'enzymes hépatiques ainsi que la coloration du glycogène sur les coupes tissulaires (Figures 4b et c).
<img alt="Injection de facteurs de reprogrammation in vivo, schéma de souris, plasmide, analyse de tissus, PCR, cytométrie." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Aperçu schématique du protocole de reprogrammation in vivo et de son analyse. Le protocole comprend deux étapes principales : (i) l'administration de facteurs de reprogrammation in vivo et (ii) l'extraction des tissus et l'analyse des échantillons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig1large.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour voir la figure en taille plus grande</a>.
<img alt="Analyse de l'expression génique ; graphiques en barres avec données d'expression relative sur plusieurs jours ; figures a-d ; résultats scientifiques." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Surexpression in vivo des facteurs de transcription Yamanaka dans le foie de souris adultes. Des souris Balb/C ont été injectées par hydrodynamothérapie (HTV) avec du sérum physiologique (0,9 %) seul ou avec 75 μg de pCX-OKS-2A et 75 μg de pCX-cMyc dans du sérum physiologique (0,9 %). Aux jours 2, 4, 8, 12 et 24, une analyse RT-qPCR sur des hépatocytes a été réalisée afin de déterminer l'expression génique relative de : (a) facteurs de transcription transférés (OKSM) et (b) marqueurs endogènes de pluripotence ; (c) analyse par cytométrie en flux des cellules positives pour OCT3/4 et Nanog ; (d) expression génique relative des marqueurs d'hépatocytes, déterminée par RT-qPCR. Tous les niveaux d'expression génique ont été normalisés par rapport au groupe injecté avec du sérum physiologique par HTV. (* p&lt;0,05 indique une différence statistiquement significative par rapport aux groupes injectés avec du sérum physiologique par HTV, obtenue par analyse de variance et comparaison par paires de Tukey). Figure adaptée de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig2large.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour voir la figure en taille agrandie</a>.
<img alt="Comparaison par microscopie d'immunofluorescence de OCT4, SOX2, NANOG dans des cellules traitées au sérum physiologique par rapport à des cellules traitées au OKSM." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. Reprogrammation cellulaire in vivo sur un tissu hépatique de souris adulte par immunohistochimie. Souris Balb/C injectées par HTV avec du sérum physiologique 0,9 % seul, ou avec 75 μg de pCX-OKS-2A et 75 μg de pCX-cMyc dans du sérum physiologique 0,9 %. Au jour 4, les foies ont été prélevés et des coupes congelées de tissu ont été marquées avec des anticorps anti-OCT4, anti-SOX2 ou anti-Nanog afin d’évaluer l’immunoréactivité, ou avec BCIP/NBT afin de déterminer l’activité de la phosphatase alcaline dans le tissu (40X). Les barres d’échelle représentent 100 μm. Figure adaptée de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig3large.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour voir la figure en taille agrandie</a>.
<img alt="Histologie hépatique, taux d'enzymes et albumine dans le traitement au sérum physiologique versus OKSM, résultats de l'expérience." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Effet de la reprogrammation cellulaire in vivo sur la fonction hépatique et l'histopathologie. Des souris Balb/C ont été injectées par HTV soit avec 75 μg de pCX-OKS-2A et 75 μg de pCX-cMyc dans du sérum physiologique à 0,9 %, soit avec du sérum physiologique à 0,9 % uniquement. Aux jours 2, 4, 8, 12, 50 et 120, des tissus hépatiques et des séra ont été isolés et analysés pour : (a) coloration H&amp;E ; (b) taux d'enzymes hépatiques ; (c) taux d'albumine ; (d) coloration PAS. Des images représentatives ont été obtenues par microscopie optique (10X). Les barres d'échelle représentent 100 μm. Figure adaptée de Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir la figure en taille agrandie</a>.

Cette étude démontre la reprogrammation des cellules somatiques vers la pluripotence in vivo sans génération de tératomes. Nous avons utilisé l’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de l’ADN plasmidique codant pour les facteurs de Yamanka afin d’induire la reprogrammation in vivo des hépatocytes adultes en cellules de pluripotence accrue.

Dans reprogrammation in vivo de cellules somatiques adultes à la pluripotence par surexpression de facteurs Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’induire et d’évaluer la reprogrammation des cellules somatiques vers la pluripotence dans leur microenvironnement in vivo. Ceci est réalisé en chargeant une seringue avec des ADN plasmidiques codant pour les facteurs Yamanaka et en les injectant hydrodynamiquement dans la veine de la queue d’une souris A BC dans un deuxième temps. Les hépatocytes primaires sont isolés des tissus hépatiques et les niveaux d’expression géniques et protéiques pertinents sont étudiés par Q-R-T-P-C-R en temps réel et cytométrie en flux.Ensuite, des tissus hépatiques entiers sont sectionnés et colorés par différentes techniques afin de confirmer la reprogrammation du tissu et d’évaluer la toxicité de la procédure. On obtient des résultats qui montrent des différences dans l’expression génique et protéique de la reprogrammation, de la pluripotence et des marqueurs spécifiques des hépatocytes. De plus, l’innocuité de l’approche est également validée par des preuves biochimiques et histologiques.Le principal avantage de la reprogrammation des cellules somatiques in vivo est qu’elle se produit rapidement, efficacement et de manière transitoire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la reprogrammation. Par exemple, les résultats de l’induction de la pluripotence chez l’adulte in vivo.Pour commencer l’anesthésie, une souris bulby femelle de six semaines. Préparez ensuite une solution d’ADN plasmidique CODE pour les facteurs Yamanaka et un contrôle salin comme décrit dans le protocole textuel d’accompagnement. Pour que la transfection réussisse, injectez la dose entière en cinq à sept secondes au maximum à des moments prédéterminés après l’injection. Isolez les hépatocytes primaires en exposant la cavité thoracique et en perfusant le foie avec un tampon HBSS préchaud, puis perfuser le milieu de digestion du foie à un débit de 0,6 litre par minute pendant 15 minutes jusqu’à ce que le foie devienne gonflé et lâche.Ensuite, retirez le foie à l’aide d’une pince après avoir coupé les ligaments falor et coronaires. Pour plus de détails sur l’isolement des cellules hépatiques primaires, voir les étapes dans cette vidéo JoVE supplémentaire. Ensuite, lavez le foie avec un produit de lavage à hépatocytes tout en le passant dans une passoire cellulaire de 100 microns.Pour obtenir une suspension cellulaire, prélevez la suspension cellulaire dans des tubes de 50 millilitres et ajustez le volume à 15 millilitres avec un produit de lavage hépatocytaire. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 50 G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et suspendez la pastille cellulaire.Dans 10 millilitres de milieu de lavage des hépatocytes, la pastille cellulaire doit être suspendue avec précaution car les hépatocytes sont des cellules très fragiles. Répétez la procédure de centrifugation trois fois au total et suspendez la pastille finale dans 10 millilitres de produit de lavage hépatocytaire. Ensuite, estimez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope optique pour étudier l’expression génique d’hépatocytes isolés.Commencez par centrifuger deux fois 10 à la sixième cellule à 300 fois G et jetez le snat. Ensuite, extrayez l’ARN des cellules à l’aide d’un kit de colonne de spin en suivant les instructions du fournisseur. Ensuite, utilisez un microgramme de l’ARN extrait des groupes de traitement et de contrôle pour effectuer une étude Q-R-T-P-C-R en deux étapes afin de rechercher des changements dans les niveaux de reprogrammation de la pluripotence et des marqueurs hépatocytaires.Pour analyser la pluripotence accrue des cellules au niveau des protéines, prenez les hépatocytes isolés et ajustez la densité des cellules à une fois 10 à la septième cellule par millilitre. Pour la cytométrie en flux, préparez des aliquotes de 100 microlitres de suspension cellulaire, puis fixez-les dans 100 microlitres de cyto BD. Fixez le tampon de fixation pendant 20 minutes à température ambiante après la fixation, granulez les cellules et réanimez-les, suspendez-les dans 100 microlitres d’un tampon de lavage par perméation X BD incubez pendant 10 minutes, ajoutez à température ambiante.Ensuite, incubez les cellules avec des anticorps primaires pour les facteurs de transcription exprimés dans les cellules pluripotentes pendant 30 minutes. Cela inclut soit anti-souris T quatre par CP SCI 5.5 ou anti-US nag pe. Assurez-vous également d’inclure des contrôles négatifs et isotypes.Analysez ensuite les cellules colorées dans le cytomètre en flux avec les canaux CP sci 5.5 et PE quatre jours après l’injection de la section cryogénique de l’ADN plasmidique, le foie comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Ensuite, incubez des sections fixes de méthanol dans un tampon de blocage à température ambiante pendant une heure, suivi de deux étapes de lavage pendant cinq minutes chacune avec un tampon de lavage. Ensuite, ajoutez quatre anticorps anti-T, quatre anti-chaussettes deux et des anticorps primaires anti-harcèlement sur des lames séparées, en veillant à couvrir complètement le tissu hépatique.Couvrez les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient évités et incubez les sections pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec un tampon de lavage. Ensuite, incubez-les pendant 1,5 heure à température ambiante avec leurs anticorps secondaires respectifs après l’incubation.Lavez les sections de foie trois fois pendant cinq minutes chacune avec du PBS. Montez-les dans un support anti-décoloration dappy et protégez-les avec des lamelles. Visualisez ensuite les lames à l’aide d’un microscope à épifluorescence.Réchauffez les sections cryogéniques à température ambiante pendant 15 minutes et fixez-les avec 4 % d’aldéhyde paraforme pendant deux minutes. Ensuite, faites sécher les lames à l’air libre pendant 30 minutes. Une fois secs, incubez les sections avec un substrat liquide B-C-I-P-N-B-T à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Pendant ce temps, la solution réagira avec la phosphatase alcaline dans le tissu pour former un précipité insoluble visible au microscope. Après 30 minutes, lavez les lames à l’eau distillée et montez-les avec des supports de montage aqueux. Ensuite, capturez des images à l’aide de la microscopie optique les jours 4, 8, 12 et 120.Après la transfection, prélevez 300 microlitres de sang directement dans le ventricule cardiaque. Gardez le sang sur de la glace pendant que les différents échantillons sont prélevés pour éviter qu’il ne coagule trop tôt. Une fois tous les échantillons prélevés, incubez-les pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius ou jusqu’à ce que le sang coagule.Ensuite, centrifugez les échantillons à 2000 G pendant cinq minutes et pipetez soigneusement le sérum dans un nouveau tube einor. Analysez ensuite les taux sériques d’albumine et d’enzymes hépatiques, A-L-T-A-S-T-A-L-P et GLDH à l’aide d’un spectrophotomètre. En plus du dépistage du sang afin d’évaluer la toxicité hépatique, préparez également des coupes de tissus incrustées en paraffine comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement.Ensuite, colorez le tissu avec une coloration H et D ou PIS et analysez les images capturées. Microscopie optique après injection hydrodynamique des plasmides dans la veine caudale, une augmentation significative de l’expression génique des facteurs de reprogrammation transfectés. T trois, quatre chaussettes, deux et cmic au niveau de l’ARNm ont été observés le deuxième jour après l’injection.L’expression de ces facteurs diminue avec le temps après l’injection. Les marqueurs de pluripotence endogènes, nano g ECAT un et REX un, sont également significativement régulés à la hausse par rapport à ceux présents dans les hépatocytes d’animaux injectés de solution saline le deuxième et le quatrième jour après l’injection et sont revenus aux niveaux de base à partir du huitième jour. Dans le même temps, la dédifférenciation de la population d’hépatocytes a été confirmée par la régulation négative des gènes spécifiques des hépatocytes, A-L-B-A-A-T et TRF qui étaient statistiquement significatifs le quatrième jour et ont atteint les niveaux de base à partir du huitième jour.De plus, l’expression de T trois quatre et nag au niveau de la protéine a été étudiée par cytométrie en flux, comme le montre ici. Seul OC trois quatre est exprimé le premier jour. Après l’injection de HTV, alors que pour l’expression du marqueur de pluripotence endogène nano G, il a fallu attendre le quatrième jour.L’apparition d’une reprogrammation cellulaire in vivo a été confirmée par l’analyse immunohistochimique des tissus hépatiques. Des cellules positives pour tous les marqueurs et l’activité enzymatique sont reproduites dans les tissus hépatiques des animaux injectés de KSM, mais pas dans les témoins injectés de solution saline. Les colorations H et E et PAS montrent des signes transitoires mais non graves de lésions tissulaires qui se sont dissipées après le deuxième jour.Aucune formation de tératomes ni aucun signe de dysplasie ou d’altérations morphologiques n’a été observé pendant la période de l’étude. Il n’y avait pas non plus d’anomalies fonctionnelles hépatiques tout au long de l’étude chez aucun des animaux, comme le confirment les taux d’albumine et d’enzymes hépatiques indiqués ici. Cette étude fournit la preuve de principe de la reprogrammation cellulaire in vivo vers la pluripotence.Cela s’est produit rapidement, transitivement et efficacement après l’administration des facteurs Yamanaka. Nous avons émis l’hypothèse que la reprogrammation in vivo peut être réalisée dans d’autres tissus que le foie, à condition que ce gène adéquat. Les vecteurs hépatiques sont conçus pour transfecter le tissu cible.De plus, avec des protocoles et des technologies améliorés, il pourrait être possible d’extraire les cellules du programme in vivo pour les utiliser pour des études ultérieures.

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