Liaison covalente de BMP-2 sur les surfaces en utilisant une approche monocouche auto-assemblée

L’objectif global de cette procédure est de lier de manière covalente deux molécules de BMP à des surfaces sans perdre leur bioactivité. Ceci est accompli en formant d’abord une couche d’or sur un substrat par dépôt physique en phase vapeur. La deuxième étape consiste à créer une monocouche auto-assemblée de mu NHSA bifonctionnel NHS Thiol linker.

Ensuite, RH BMP two est lié de manière covalente à l’éditeur de liens. La dernière étape consiste à retirer le BMP non lié deux par sonication. En fin de compte, un test de liaison d’anticorps est utilisé pour montrer la liaison réussie de BMP deux sur les surfaces et l’activité biologique de BMP deux liée à la surface est déterminée dans les cellules en analysant la phosphorylation de SMA 1 5 8.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des facteurs de croissance, par exemple si la liaison initiale des facteurs de croissance à leurs récepteurs à la surface de la cellule est suffisante pour déclencher des réponses de signalisation. Deux membres de mon laboratoire, Teresa Paul et Elizabeth Schwab, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, nettoyez les lamelles de verre avec des lingettes de précision et sonicez-les pendant cinq minutes dans un mélange individuel d’acétate d’éthyle et de méthanol.

Après sonication, rincez les substrats avec du méthanol et séchez-les sous flux d’azote. Placez les supports propres dans un dispositif de revêtement par pulvérisation cathodique et évacuez la chambre. Retirez la couche supérieure d’oxyde de chrome de la cible de chrome en pulvérisant pendant 60 secondes.

Ensuite, enduire le substrat d’une couche de chrome de 10 nanomètres suivie d’un revêtement avec une couche d’or de 40 nanomètres. Lorsque vous avez terminé, retirez les substrats dorés de la chambre et mettez-les de côté. Transférez les substrats d’or dans une fiole à fond rond à deux cols et incubez-les dans un M-U-N-H-S millimolaire dans du DMF à température ambiante pendant quatre heures sous atmosphère d’azote.

Après l’incubation, sonicez les substrats dans du DMF pendant deux minutes. Rincez-les avec du DMF et du méthanol et séchez-les sous flux d’azote. Diluer la solution mère de RHB MP two avec une molaire de chlorure de sodium dans du PBS pour obtenir une concentration finale de 3,5 microgrammes par millilitre.

Ajustez cette solution de travail à un pH de 8,5 avec de l’hydroxyde de potassium stérile de 10 millimolaires immédiatement avant l’utilisation. Placez l’anneau A-P-D-M-S sur l’échantillon. Transférez le substrat dans une plaque à six puits pour vous assurer que seules les surfaces du substrat sont exposées à la solution d’incubation.

Ensuite, incubez les substrats fonctionnalisés M-U-N-H-S avec la solution de travail RHB MP two à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir retiré le surnageant d’incubation, ajoutez une molaire de chlorure de sodium dans du PBS et sonicez les substrats pendant deux minutes. Une fois terminé, lavez les substrats trois fois avec du chlorure de sodium stérile d’une molaire dans du PBS pour bloquer l’absorption non spécifique de l’anticorps.

Incuber les substrats dans 5 %BSA dans du PBS pendant une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les substrats avec une solution d’anticorps anti-BMP deux pendant une heure à température ambiante une fois terminé, lavez les substrats deux fois avec du PBS et sonicez-les pendant 30 secondes. Ensuite, incubez les substrats dans une solution d’anticorps secondaires conjuguée HRP pendant 30 minutes à température ambiante, puis lavez-les deux fois avec du PBS.

Utilisez le test amplement du rouge grippal pour mesurer l’activité enzymatique HRP à 570 nanomètres avec un lecteur de plaques, ensemencez une fois 10 à la cinquième bouche C, deux C 12 myoblastes par puits dans six plaques de puits dans un milieu de croissance et incubez-les pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Une fois que les plaques ont été retirées de l’incubateur, aspirez le milieu des puits et affamez les cellules de DMEM libre de sérum pendant trois à cinq heures avant de les ensemencer sur les deux surfaces de substrat BMP fonctionnalisées pour l’étude de l’induction de signalisation à court terme. Remplacez le milieu par 200 microlitres de DMEM frais sans sérum et placez les deux substrats BMP immobilisés au-dessus des cellules à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine après l’incubation à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Retirez délicatement les substrats et aspirez le milieu à l’aide d’une pipette. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS et procédez à l’analyse des réponses cellulaires à l’aide de l’électrophorèse sur gel et du western blot pour l’analyse de l’activité biologique à long terme. Placez les cellules sur les surfaces comme décrit précédemment et cultivez-les à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 dans 2 % FBS pendant six jours.

Après l’incubation. Imagez les cellules par microscopie à fluorescence pour vérifier que les BMP RH présentent deux surfaces de liaison RH immobilisées : deux BMP ont été incubées avec un anticorps spécifique BMP deux et un anticorps secondaire conjugué avec HRP. La BMP HR immobilisée en surface deux ou I BMP deux a été détectée avant et après la stimulation cellulaire.

On voit ici la liaison réussie de la BMP RH deux à la surface dans une confirmation reconnue par l’IgG anti BMP deux. Le test métrique de la MHP II immobilisé en surface a été quantifié à l’aide du test métrique du chole rouge de la grippe et les données montrent qu’après la stimulation cellulaire, la protéine était toujours détectée à la surface, les réponses cellulaires aux surfaces présentant des MP RHB immobilisées ont été évaluées et comparées à l’effet des substrats dorés non traités. Ici, deux cellules C 12 ont été stimulées pendant 30 minutes par RHB MP, deux surfaces fonctionnalisées s’approchant du haut.

Dans ce modèle, BMP two inhibe la différenciation des cellules en myotubes multinucléés et induit des phénotypes d’ostéoblastes. L’activation de SMAD 1 5 8, qui sont des rapporteurs en aval de la voie de signalisation BMP deux, est analysée par western blot comme illustré ici. La phosphorylation de SM est observée après une stimulation de 30 minutes par I BMP deux, tandis qu’aucune phosphorylation de SMAD 1 58 ne se produit dans les cellules exposées à des échantillons d’or non traités.

Ce résultat indique que le processus d’immobilisation n’altère pas l’activité à court terme de BMP deux et déclenche des étapes précoces de signalisation smad pour déterminer si I BM P deux affecte la différenciation ostéogénique à long terme. Le niveau d’expression de la phosphatase alcaline a été étudié par un test métrique cholé. L’activité de la phosphatase alcaline des cellules C deux C 12 a été mesurée après incubation des cellules pendant six jours sur de l’or brut et sur des surfaces IBP deux.

L’activité de la phosphatase alcaline dans les lysats de cellules cultivées sur les surfaces I BM P deux a montré une absorption significativement plus élevée par rapport au contrôle. Ce résultat révèle que l’IBMP 2 induit l’expression de la phosphatase alcaline dans les cellules C 2 C 12 afin d’étudier l’effet de l’IBP 2. Sur Myogenesis C, deux cellules C 12 ont été plaquées directement sur de l’or ou sur des surfaces fonctionnalisées et cultivées dans des conditions de faible sérum.

Après six jours, la coloration de la chaîne lourde de myosine a été effectuée comme indiqué ici. C deux cellules C 12 n’ont pas réussi à former des myotubes positifs à chaîne lourde de myosine en présence de I BM P deux, contrairement aux cellules sur des substrats d’or. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immobilisation de BMP deux sur des nanoparticules d’or peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires.

Par exemple, quelle quantité de BMP deux immobilisée est localement nécessaire pour déclencher efficacement des réponses de signalisation.