Procédures d'identification des prions infectieux Après passage dans le système digestif d'une espèce aviaire

L’objectif global de cette procédure est de documenter le passage de matériel infectieux PreOn dans le système digestif de la Corneille d’Amérique. Pour ce faire, il faut d’abord jauger les corbeaux avec du matériel PreOn infectieux. La deuxième étape consiste à collecter les excréments de corbeau pendant quatre heures après le gavage et à les préparer pour l’injection dans les souris.

Ensuite, les souris sont inoculées par voie intrapéritonéale avec un millilitre d’homogénat fécal de corbeau. La dernière étape consiste à surveiller les souris quotidiennement jusqu’à ce qu’elles expriment des signes cliniques de grattage de souris. En fin de compte, l’analyse par transfert Western est utilisée pour confirmer la présence de PreOn infectieux dans le modèle murin et vérifier la transmission de la maladie.

L’idée que les corbeaux pouvaient transporter. La MDC nous est arrivée un jour d’hiver où, après nous être rendus à une installation de wapitis en captivité où nous faisions des recherches et avons vu des wapitis tués sur la route se nourrir par des corbeaux, et plus tard ce jour-là, des corbeaux sortant du ciel de nulle part, atterrissant dans ces mangeoires, se nourrissant juste à côté du wapiti, déféquant sur le grain que les wapitis consommaient, en plus de l’observation de la littérature que beaucoup de corbeaux cet été-là dans tout le Colorado, l’hiver du Wyoming dans une zone concentrée au Nouveau-Mexique, il se trouve que cette région du Nouveau-Mexique est l’endroit où un certain CABD est apparu et c’est à cent à des centaines de kilomètres de l’épicentre de la maladie du crack. Ces deux observations nous ont donc fait penser que les corneilles pourraient potentiellement jouer un rôle dans le transport de la MDC dans le paysage.

Une démonstration visuelle de ces techniques est essentielle, car des techniques de gavage intrapéritonéal et oral incorrectes peuvent entraîner la mort des animaux étudiés. Pour commencer, ajoutez quatre gouttes de colorant bleu à un œuf brouillé et mélangez bien. Ensuite, prélevez cinq millilitres du mélange de colorant et d’œuf dans une aiguille à gavage de deux pouces avec une personne retenant doucement le corbeau.

Ouvrez le bec du corbeau assez grand pour voir dans sa gorge et insérez soigneusement l’aiguille du gavage dans son œsophage. Si une altération de la respiration est remarquée, retirez la seringue et réessayez car elle a peut-être été placée dans la trachée. Une fois qu’il est certain que l’aiguille du gavage est dans l’œsophage, exprimez lentement le contenu de la seringue.

Vérifiez le corbeau toutes les 30 minutes jusqu’à ce que les excréments tachés de bleu-vert ne soient plus excrétés. Les corbeaux d’essai ont mis environ quatre heures pour cesser d’excréter des excréments teints en bleu. Ensuite, ajoutez une partie de cerveau de souris C 57 noir six non infecté à quatre parties de PBS stérile et quelques perles de verre dans un mélangeur à balles.

Homogénéisateur : homogénéisez l’échantillon pendant une à cinq minutes jusqu’à ce que la consistance lisse soit atteinte. Répétez le processus en utilisant des cerveaux de souris infectés par la souche R ML Chandler infectée C 57 noir. Ensuite, centrifugez l’homogène à 3000 fois G pendant une minute.

Pour éliminer les plus grosses particules. Ensuite, retirez le surnageant et diluez-le avec un volume égal de XPBS stérile pour générer un poids de 10 % par volume de matière cérébrale. Dans le PBS, conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire 17 heures avant le gavage.

Retirez la nourriture mais pas l’eau des enclos. Répartissez au hasard les corbeaux en groupes de traitement et gavage oral chaque corbeau avec cinq millilitres d’homogénat de cerveau de souris fraîchement décongelé, normal ou infecté à l’aide d’une aiguille de gavage de deux pouces. Transférez ensuite les corbeaux dans des cages individuelles.

Ramasser et mettre en commun tous les excréments dans chaque cage quatre heures après le gavage. Ensuite, homogénéisez les excréments accumulés pour chaque corbeau dans un homogénéisateur à balle bleue avec des billes de verre jusqu’à ce qu’une texture uniforme soit obtenue. Ensuite, prenez 500 microlitres du mélange et diluez-le de un à 20 avec 9,5 millilitres de centrifugeuse PBS stérile, l’homogénat fécal dilué pendant 15 minutes.

Ajouter 1 300 fois G, puis transférer le surnageant dans un tube frais. Pour minimiser le risque d’une infection microbienne secondaire, ajoutez une unité de pénicilline et un microgramme de streptomycine par millilitre d’homogénat. Ensuite, sonifiez les échantillons dans un ateur de 3000 MP à une puissance de 70 pendant 30 secondes pour perturber la membrane de tous les microbes restants.

Tout d’abord, attribuez au hasard les souris à l’un des quatre groupes illustrés ici. Le premier groupe recevra des excréments de corbeaux infectés. Le deuxième groupe recevra des excréments de corbeaux non infectés.

Le troisième groupe recevra le cerveau de souris infecté et le quatrième groupe recevra le cerveau de souris normal. Ensuite, pour les groupes MN un et deux, prélevez un millilitre d’excréments de corbeau positifs ou négatifs raclés. Homogéner à l’aide d’une aiguille de calibre 25 selon le numéro de groupe de la souris.

Ensuite, écorchez la souris par la fourrure dorsale de son cou, à l’aide du pouce et de l’index, et faites-la pivoter doucement pour exposer la face ventrale. Surélevez l’extrémité postérieure de la souris de manière à ce que sa tête soit légèrement plus basse.

Insérez l’aiguille à un centimètre de la peau, à un centimètre sur le côté de la ligne médiane et à un à deux centimètres en avant de l’articulation sacro-iliaque. Ensuite, tirez légèrement vers l’arrière et injectez lentement l’homogène dans la cavité du corps de la souris. Ensuite, préparez l’homogénat de cerveau de souris congelé avec et sans scrappy pour l’injection dans les animaux des groupes trois et quatre.

En diluant d’abord les mélanges de bouillon de un à 10 avec du PBS stérile. Ensuite, injectez un millilitre d’homogénat cérébral positif raclé dilué dans les souris du groupe trois et un millilitre d’homogénat cérébral négatif racleur dilué dans les souris. Dans le groupe quatre.

Surveillez les souris tous les jours jusqu’à ce qu’elles expriment des signes cliniques de grattage de souris. Les signes cliniques peuvent inclure une cyphose, une ataxie, une queue raide, un manque de toilettage, une émaciation et une léthargie. Notez mon quotidien pour chacun des six signes cliniques.

Lorsque des signes visibles sont évidents. Zéro équivaut à aucun signe visible. Un équivaut à un niveau modéré et deux à un niveau sévère d’un signe.

Euthanasier les souris lorsque les scores quotidiens totaux pour chaque signe atteignent plus ou égal à huit pendant une journée supérieure ou égale à six de façon continue pendant trois jours ou à 365 jours. Après l’inoculation, prélevez les cerveaux immédiatement après l’euthanasie et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, éliminez correctement les carcasses pour confirmer un diagnostic de découpage.

Décongelez les cerveaux de souris congelés et homogénéisez-les individuellement dans un homogénéisateur à balle bleue avec des billes de verre jusqu’à ce qu’une texture uniforme soit obtenue. Ensuite, préparez 125 microlitres d’une solution de digestion de la protéinase K en combinant 109,39 microlitres de PBS avec 12,5 microlitres d’EDTA de 500 millimolaires à un pH de huit et 3,1 microlitres d’une solution de protéinase K de 50 microgrammes par millilitre. Ajoutez ensuite trois microlitres de la solution de digestion à 17 microlitres de cerveau. Homogénat.

Incuber les échantillons à 45 degrés Celsius sur un bloc de chaleur agitant pendant 30 minutes. Une fois l’incubation terminée, inactivez la solution de digestion en ajoutant huit microlitres de tampon de chargement de page SDS et incubez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Chargez ensuite les échantillons sur une page à 12 % de SDS.

Le gel électrophorèse les protéines et transfère le gel sur une membrane PVDF IMON Une fois transféré, bloquez la membrane PVDF avec 5 % de lait écrémé dans du PBS avec 0,2 % entre 20 et basculez pendant une heure à température ambiante. Ensuite, sondez la membrane avec de l’anticorps monoclonal Borrow 224 et IPRP conjugué à de la peroxydase de raifort diluée un à 20 000 dans un superbloc et rochez pendant une heure à température ambiante après l’incubation. Rincer la membrane pendant une heure dans du PBS avec 0,2 % entre 20.

Visualisez les protéines en incubant la membrane avec un substrat chimiluminescent pendant cinq minutes. Ensuite, imagerie de la membrane sur un système de documentation en gel G-box. Les souris malades ont été identifiées par la manifestation de signes cliniques de grattage de souris et la confirmation de la maladie a été complétée par une analyse de sang Western.

Cerveau de souris normal, homogène sans éraflure : deux voies de gauche, avec et sans l’aide de la protéase K, sans protéase K, trois courbures sont observées. Cependant, comme la protéine normale est sensible aux protéinases, les courbures ne sont pas visibles dans la deuxième voie. La troisième voie montre un échantillon de contrôle positif gratifiant digéré par la protéase.

Les protéases provoquent un décalage dans les trois bandes d’origine en raison de la perte des terminus n et c des protéines. Mais les protéines infectées ne peuvent pas être complètement digérées comme elles l’étaient dans l’échantillon de cerveau normal. Le cerveau digéré par la protéinase K d’une souris inoculée avec des excréments d’une corneille inoculée est montré à droite et confirme la présence de prions dans l’échantillon car les bandes ne sont pas digérées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous comprendrez mieux comment documenter le passage de matières infectieuses à prions dans le système digestif des corneilles. Vérifiez ensuite l’infectiosité à l’aide d’un essai biologique interpéritonéal chez la souris.