Enrichissement et purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d’antigènes de surface cellulaire à l’aide des anticorps monoclonaux TG30 et GCTM-2

L’objectif global de cette procédure est de trier les sous-ensembles de cellules souches embryonnaires humaines en fonction de leur liaison à l’antigène de surface cellulaire des deux anticorps monoclonaux TG 30 et GC TM. Ceci est accompli en dissociant d’abord des cultures de cellules souches embryonnaires humaines ou HESC en suspensions unicellulaires. Dans la deuxième étape, les HESC sont colorés avec les anticorps monoclonaux, TG 30 et GCTM deux.

Enfin, les cellules sont séparées par un tri cellulaire activé par fluorescence et renvoyées en culture. En fin de compte, la capacité de formation de colonies des cellules triées peut être évaluée par cytométrie en flux et microscopie à contraste de phase. L’image principale de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’observation visuelle, est qu’elle fournit une mesure objective de la pluripotence cellule par cellule pour un grand nombre de cellules, ce qui facilite la séparation des cellules souches embryonnaires des cellules différenciées.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pluripotence, telles que la façon dont les changements dans les conditions de culture affectent quantitativement différentes lignées de cellules souches embryonnaires humaines et de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Pour fabriquer une suspension unicellulaire Hess, commencez par aspirer le milieu de culture Hess à partir de deux flacons T 75 contenant une lignée cellulaire Hess cultivée. Lavez chaque flacon avec 10 millilitres de DPBS, puis incubez chaque culture avec trois millilitres de solution de dissociation exprimée en triple E à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Au bout de cinq minutes, cognez le côté du ballon pour déloger les cellules, puis confirmez le détachement au microscope. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture froid dans chaque flacon à l’aide d’une pipette stérile de 10 millilitres. Tritrate doucement les cellules dissociées plusieurs fois contre la paroi du ballon pour obtenir une suspension principalement unicellulaire.

Mélangez maintenant les suspensions unicellulaires hes à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube stérile en polypropylène de 50 millilitres pour colorer les antigènes de surface cellulaire Hess. Tout d’abord, Eloqua a réuni environ 100 000 cellules dans 150 microlitres de milieu dans chacun des six microtubes de centrifugation de contrôle de 1,5 millilitre. Ensuite, incubez les tubes de contrôle et l’échantillon de tri restant avec les anticorps primaires d’intérêt dans des volumes de réaction finaux de 200 microlitres et d’environ neuf millilitres respectivement dans des milieux de culture, y compris les contrôles d’isotype.

Placez les tubes horizontalement sur de la glace et mélangez-les doucement pendant 30 minutes sur une plate-forme à bascule. Après avoir fait tourner les cellules, jetez le surnageant, puis lavez l’échantillon de tri dans 20 millilitres de milieu de culture froid et les échantillons de contrôle dans 200 microlitres du même. Maintenant, incubez l’échantillon de tri dans un volume final de 2,5 millilitres avec les anticorps secondaires appropriés dans un milieu de culture froid et les témoins dans un volume final de 200 microlitres du même ajoutez, ajoutez l’anticorps PE anti-US CD 90.2 fraîchement préparé dans le tube de contrôle approprié à ce moment-là également.

Encore une fois, mélangez délicatement les tubes horizontalement sur de la glace pendant 30 minutes sur une plate-forme à bascule. Après avoir fait tourner les cellules, remettez à nouveau l’échantillon de tri en suspension dans 20 millilitres de milieu de culture froid et les témoins dans 200 microlitres et lavez les cellules deux fois dans le milieu. Remettre en suspension l’échantillon de tri dans deux à trois millilitres de milieu de culture froid complété par de l’iodure de propidium et chacun des témoins, à l’exception des cellules non colorées, dans 300 microlitres de même.

Ensuite, filtrez chaque suspension cellulaire individuelle à travers une crépine à couvercle de 35 microns couplée à des tubes à essai à fond rond en polystyrène de cinq millilitres et centrifugez les tubes pour forcer toute suspension cellulaire résiduelle sur les couvercles de la crépine dans les tubes. Tapotez ensuite les côtés des tubes pour remettre en suspension chaque cellule unique et placez les cellules sur de la glace. Configurer le cytomètre en flux pour le tri cellulaire activé par fluorescence TG 30 GCTM à deux fins afin que les suspensions de cellules Hess dissociées soient contrôlées comme des cellules uniques afin d’éliminer les amas et les doublets potentiels.

Ensuite, éliminez les débris potentiels à l’aide des portes de diffusion avant et latérale afin que seules les cellules intactes soient triées. Ensuite, excluez les cellules non viables en fonction de leur expression d’iodure de propidium. Éliminez les fibroblastes embryonnaires de souris ou les cellules nourricières de méthamphétamine par sélection négative basée sur leur expression de CD 90.2 pe de souris.

Réglez la démarche négative du TG 30 G CTM à deux en fonction de l’autofluorescence de fond pour les cellules non colorées ainsi que des contrôles d’isotype. La fraction HESC viable isolée exempte de méthamphétamine peut ensuite être fractionnée en TG 30 négatif : GCT M, deux négatifs TG 30, GCT M faibles : deux TG 30 faibles, GC TM deux moyens et TG 30 GCTM élevés ; deux sous-populations élevées. Après avoir installé le cytomètre en flux, ajoutez un millilitre de milieu conditionné à la méthamphétamine dans chacun des deux tubes à essai à fond rond en polystyrène de cinq millilitres et placez-les sur de la glace.

Récupérez ensuite 400 000 cellules chacune à partir du TG 30 négatif différencié, du GC TM deux négatifs et du pluripotent TG 30 élevé GCTM deux sous-fractions cellulaires élevées. Après avoir fait tourner les tubes collecteurs, suspendez chaque pastille de cellule dans un millilitre de milieu conditionné MEF pré-équilibré. Ensuite, ensemencez un flacon T 75 pré-équilibré d’un tiers de densité MEF avec les HESC de chaque fraction dans un milieu conditionné à la méthamphétamine, incubez les cultures cellulaires à 37 degrés Celsius à 5 % de CO2, en rafraîchissant le milieu quotidiennement pendant environ deux semaines.

Les cultures de cellules pluripotentes TG 30 high GCTM two montrent des colonies de type souche humaine après une semaine et atteignent environ 80 % de fluidité au bout de neuf à 11 jours. Les cultures de cellules TG 30 négatives GC TM deux négatives se développent principalement comme une pelouse de fibroblastes comme des cellules qui atteignent la co-fluidité à 11 à 13 jours. La détection combinée des antigènes de surface cellulaire TG 30 et GC TM deux permet la discrimination d’un certain nombre de sous-ensembles cellulaires au stade pluripotent et à divers stades de la différenciation précoce des HESC, comme l’indiquent leur expression de marqueurs de cellules souches et de facteurs de transcription spécifiques à la lignée en accord avec les rapports précédents, le TG 30 GC TM deux négatifs faibles, Les sous-fractions moyennes et élevées peuvent être discriminées au sein de la lignée de cellules souches embryonnaires humaines mâles utilisée pour cette étude ici, les pourcentages des différentes sous-populations fermées typiques d’une analyse de cytométrie à deux flux TG 30 GCTM sont montrés dans l’expérience présentée ici.

Un nombre défini de cellules TG 30 négatives GCT M deux négatives a été cultivé consécutivement après le tri pendant environ deux semaines, puis a eu recours à la collecte uniquement de la fraction négative TG 30 GCT M deux négatifs avant le replacage. A chaque passage, les résultats indiquent que la sous-fraction initiale TG 30 négative gct M deux négatifs enrichit pour TG 30 négative GCT M deux cellules différenciées négatives après conditionnement consécutif. Une population mineure de cellules TG 30 à GCT M élevé à deux cellules est détectée lors du passage initial, mais finit par disparaître avec un emballage ultérieur, ne laissant que des échantillons de cellules souches pluripotentes exemptes de cellules souches.

Ici, la morphologie typique de la pelouse de TG 30 négatif différencié GCT M deux cellules négatives après 14 jours est montrée. Notez que les colonies sporadiques de type HESC observées après 14 jours se sont mêlées avec le TG 30 négatif GC TM deux cellules négatives qui sont très probablement générées par le contaminant TG 30 élevé GCT M deux cellules hautes. Notez que cela ne se produit que rarement et dans le passage initial post-faits basé sur les observations précédentes à l’aide de ce test, il est prévu que la collecte et la culture de TG 30 high GCTM deux cellules élevées devraient enrichir pour former des colonies formant des CSH pluripotentes.

Par conséquent, l’emballage consécutif de cellules pluripotentes TG 30 high GCTM two high après tri par cytométrie en flux a également été étudié dans ces cultures représentatives, les cellules ont été triées par fax à l’aide de TG 30 et G CT M deux, remplaçant uniquement le TG 30 high G CTM deux cellules hautes à chaque passage. De cette façon, il a été observé que la majorité des cellules étaient situées dans les sous-fractions associées à la pluripotence, indiquant une population enrichie de cellules pluripotentes qui maintient également une capacité à différencier et à régénérer un petit pourcentage de cellules TG 30 négative G CTM deux cellules négatives. De plus, des cultures consécutives de cellules TG 30 à G CTM élevé deux cellules à haut tri présentent un grand nombre de colonies similaires à HESC après le passage, indiquant également le maintien de l’état de pluripotence.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’étalonner le télécopieur avant utilisation à chaque fois afin de garantir la reproductibilité des résultats Après cette procédure. D’autres méthodes telles que les microréseaux, le séquençage du génome entier ou les tératomes peuvent être effectuées pour répondre à des questions telles que : ces cellules sont-elles vraiment pluripotentes après son développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des cellules souches pluripotentes induites pour explorer la sécurité et la stabilité de ces cellules par rapport aux cellules souches embryonnaires humaines.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de colorer soigneusement des cultures mixtes de cellules souches humaines afin de les enrichir pour les cellules péritaires. N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines peut être extrêmement dangereux et que les précautions telles que le port de gants et le travail avec une enceinte de sécurité de classe deux doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.