Name: Enrichissement et purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d’antigènes de surface cellulaire à l’aide des anticorps monoclonaux TG30 et GCTM-2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Découvrez l'enrichissement et la purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d'antigènes de surface avec les anticorps monoclonaux TG30 et GCTM-2 via FACS. Cette méthode permet d'isoler les cellules pluripotentes et d'éliminer les cellules différenciées.

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Nous remercions l’installation StemCore de l’Université Monash pour la fourniture de lignes hESC et l’installation FlowCore de l’Université Monash pour les services FACS. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de l’Australian Stem Cell Centre, du New South Wales and Victorian Government Stem Cell Research Grant Program à ALL. ALL est chercheur partenaire de l’Initiative de recherche spéciale en science des cellules souches de l’Australian Research Council (ARC), Stem Cells Australia.

Le protocole suivant a été réalisé à l’aide de cultures en vrac standard hESC-MEL111 fournies par l’installation StemCore de l’Université Monash (Melbourne). Cette lignée cellulaire est systématiquement cultivée sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) inactivés mitotiquement dans des milieux hESC/KOSR complétés par bFGF7 et est maintenue avec dissociation enzymatique (collagénase) tous les 5-7 jours8. Les cultures de cseh cultivées à une confluence d’environ 80 % dans des fioles de 75 cm2 (T75) sont utilisées comme populations d’entrée pour ce protocole. Toutes les procédures de manipulation cellulaire décrites ci-dessous doivent être effectuées dans des conditions aseptiques dans une enceinte de biosécurité de classe II filtrée par HEPA.
Deux jours avant d’effectuer un essai TG30/GCTM-2 FACS, préparer les plaques de culture T75 (décrites à la section 1) qui doivent être utilisées pour la reculture des cellules récupérées après le FACS (décrites à la section 4).
1. Ensemencement des CMF et préparation du milieu conditionné par le MEF
1.1 JOUR -2: Placage des CGEM dans des fioles T75
<ol><li>Pipetter 10 ml de gélatine à 0,1 % p/v dans chaque fiole T75 et incliner la surface uniformément.</li>
	<li>Incuber pendant 30 min à température ambiante dans une armoire de biosécurité.</li>
	<li>Aspirer la solution de gélatine.</li>
	<li>Ajouter 20 ml de milieu MEF dans le ballon et pré-équilibrer à 37 °C/5 % deCO2 pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire.</li>
	<li>Plaque mitotiquement inactivée MEFs sur fiole(s) préparée(s) aux densités suivantes. Pour 1/3 MEF densité graine 1,4 x 104 cellules/cm2 (T75= 1 x 106 MEF). Pour les semences MEF pleine densité 5,3 x 104 cellules/cm2 (T75 = 4 x 106 MEF).</li>
</ol>Remarque: Nous utilisons par habitude les MEFs qui ont été mitotically inactivés par γ-irradiation. Un protocole pour la préparation des CMF irradiés par γ se trouve dans Michalska12.
<ol start="6"><li>Incuber les cultures de MEF irradiées à 37 °C/5 % deCO2 pendant la nuit. Les fioles 1/3 peuvent être incubées pendant 1-4 jours sans changement mef-moyen. Ces fioles sont utilisées pour la reformulation des cellules post-FACS (comme dans le protocole 4). Les fioles pleines de MEF sont incubées pendant la nuit pour générer du CM comme suit à l’étape 1.2 ci-dessous.</li>
</ol>1.2 JOUR -1: Préparation du milieu conditionné par le MEF (CM)
<ol><li>Aspirer le milieu MEF à partir de fioles T75 pleines de MEF.</li>
	<li>Ajouter un milieu hESC/KOSR prééquilibré de 25 ml complété par 5 ng/ml de FGF-2 humain par fiole T75. Incuber à 37 °C/5 % deCO2 pendant 24 heures.</li>
	<li>Recueillir le milieu conditionné par le MEF (CM) dans un tube de culture de tissu stérile, compléter fraîchement le CM avec 10 ng/ml de FGF-2 humain et filtrer à l’aide d’un filtre en polyéthersulfone de 0,22 μm.</li>
	<li>Pour produire un CM supplémentaire, répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 quotidiennement sur la même culture MEF pendant une semaine.</li>
</ol>Le jour de l’exécution d’un essai TG30/GCTM-2, remplacer le milieu MEF dans des fioles T75 1/3 MEF par du CM et pré-équilibrer pendant au moins 30 min avant d’ensemencer les CSEh ou les cellules dérivées du CSEh récupérés de la procédure décrite ci-dessous. Le CM est utilisé frais ou conservé à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Cm est utilisé dans ce protocole car dans nos mains il augmente la viabilité des cellules post-FACS par rapport aux milieux non conditionnés (résultats non montrés).
2. Exécution d’un test FACS TG30/GCTM-2 : Dissociation de cultures en vrac de cseh en cellules individuelles
Remarque : Prechill 20 % FBS/DMEM-F12 milieu à 4 °C.
<ol><li>Aspirer le support hESC/KOSR à partir de deux fioles T75 avec une ligne hESC cultivée.</li>
	<li>Rincer les cellules de chaque T75 avec 10 ml de DPBS et aspirer à les éliminer.</li>
	<li>Ajouter 3 ml de solution de dissociation TrypLE Express dans chaque fiole T75. Incuber à 37 °C/5 % deCO2 pendant 5 min.</li>
	<li>Heurter le côté des fioles pour obtenir un délogement complet des cellules. Vérifier au microscope. Si les cellules ne se délogent pas facilement, incuber pendant encore 2-3 min à 37 °C/5 % deCO2.</li>
	<li>Ajouter 10 ml à 20 % de FBS/DMEM-F12 (maintenus à 4 °C) dans chaque fiole T75. À l’aide d’une pipette stérile de 10 ml, triturer doucement les cellules dissociées plusieurs fois contre la paroi du ballon pour obtenir une suspension principalement unicellulaire.</li>
	<li>Placer une passoire cellulaire de 70 μm sur un tube stérile en polypropylène de 50 ml. Utilisez une pipette stérile de 10 ml pour forcer les suspensions monocellulaires hESC regroupées à partir des deux fioles T75 à travers la passoire.</li>
	<li>Jetez la passoire cellulaire, remplacez le couvercle du tube et centrifugez la suspension hESC en commun à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver les cellules en remettez doucement le culot dans 10 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C).</li>
	<li>Effectuer une deuxième centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant, ajouter 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (préchilled à 4 °C) et triturer doucement pour ressusciter les cellules. Placez le tube de 50 ml sur de la glace. Ce tube sera utilisé pour la procédure d’immunomarquage de l’échantillon de tri décrite ci-dessous.</li>
	<li>Prendre 20 μl de la suspension monocellulaire hESC (étape 2.10) pour compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Vous devriez vous attendre à un rendement de 10-15 millions de cellules par flacon T75.</li>
</ol>Remarque: Fbs est employé dans cette partie du protocole pour augmenter la viabilité de cellules post-FACS.
3. Coloration immunofluorescente des antigènes de surface cellulaire TG30 et GCTM-2
<ol><li>Aliquote de 150 μl (~100 000 cellules) d’une suspension monocellulaire hESC (à partir de l’étape 2.11) dans chacun des six tubes microcentrifugés de 1,5 ml. Ces six aliquotes seront utilisées pour les contrôles de coloration nécessaires à l’étalonnage de l’essai sur la machine FACS. La suspension cellulaire restante d’environ 9 ml sera votre échantillon de tri dans lequel la culture dissociée sera cosinté pour la détection de TG30 et GCTM-2, selon les tableaux 1 et 2.</li>
	<li>Effectuer des réactions de liaison des anticorps primaires dans 20% FBS/DMEM-F12. Les volumes de réaction finaux doivent être d’environ 9 ml pour l’échantillon de tri et de 200 μl pour les témoins. Inclure les témoins d’isotypes comme anticorps primaires. Placez les tubes horizontalement sur la glace et mélangez doucement pendant 30 min sur une plate-forme à bascule.</li>
	<li>Centrifuger les réactions d’anticorps primaires à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Jetez le surnageant et lavez les cellules en ressuscitant le culot dans 20 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C) pour l’échantillon de tri et 200 μl pour les contrôles.</li>
	<li>Effectuer un deuxième tour à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Effectuer des réactions de liaison d’anticorps secondaires dans 20% FBS/DMEM-F12. Les volumes de réaction finaux doivent être de 2,5 ml pour l’échantillon de tri et de 200 μl pour les témoins. Préparez le tube de réaction PE-anti-souris CD90.2 à ce stade. Placez les tubes horizontalement sur la glace et mélangez doucement pendant 30 min sur une plate-forme à bascule.</li>
</ol>Remarque: Pendant cette période d’incubation, il est pratique de collecter le CM et de préparer 1/3 de fioles MEF T75 avec du CM comme dans la section 1.2.
<ol start="7"><li>Centrifuger les réactions d’anticorps secondaires à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver les cellules DEUX FOIS en ressuscitant le culot dans 20 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C) pour l’échantillon de tri et 200 μl pour les contrôles.</li>
	<li>Effectuer un spin à 1 000 x g pendant 2 min après chaque lavage et placer des tubes sur de la glace.</li>
	<li>Jeter les surnageants et les pastilles cellulaires remises en suspension dans 20 % de FBS/DMEM-F12 complétés par de l’iodure de propidium (IP) à 0,3 μg/ml. Utilisez 2-3 ml pour l’échantillon de tri et 300 μl pour les contrôles.</li>
</ol>Remarque: NE PAS ajouter PI au tube de commande avec des cellules non colorées.
<ol start="11"><li>Utilisez une micropipette P1000 pour forcer chaque suspension cellulaire individuelle à travers une passoire de cellule de couvercle de 35 μm, couplée à des tubes à essai ronds en polystyrène à tube de 5 ml.</li>
	<li>Centrifuger à 50 g/min pour forcer à travers la suspension cellulaire résiduelle sur les couvercles de la crépine.</li>
	<li>Ressusciter chaque suspension à cellule unique en tapotant les côtés des tubes et la placer sur de la glace. Vos cellules sont maintenant prêtes pour le FACS. Je vous en prie, continuez tout de suite.</li>
</ol>4. Culture post-FACS de cellules de subfraction TG30/GCTM-2 dans des fioles de 75 cm2 (T75)
<ol><li>Nous avons précédemment rapporté comment mettre en place une machine FACS pour l’immunoprofilage TG30 /GCTM-2 7. La procédure permet la récupération de css uniques viables, exempts de CEM, et à l’intérieur des portes de P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)et P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)- voir figure 1E. Configurez la machine FACS pour le FACS TG30/GCTM-2 comme dans notre rapport précédent pour récupérer les sous-propriétés cellulaires à utiliser ensuite.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de CM, préparé comme à l’étape 1.2, à chacun des deux tubes à essai ronds de fond en polystyrène de 5 ml avant de prélever les cellules de la machine FACS. Placer sur la glace.</li>
	<li>Récupérez 400 000 cellules chacune à partir de sous-fractions de cellules P4 différenciées (TG30Neg-GCTM-2Neg)et pluripotentes P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)à l’aide de TG30/GCTM-2 FACS.</li>
	<li>Centrifuger les tubes de collecte à 1 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirez les surnageants. Ajouter 1 ml préquilibré à 37 °C/5 % deCO2 CM pour ressusciter chaque pastille cellulaire à l’aide d’un micropipettor P1000. Ensemencer les cellules de chaque fraction sur une fiole prééquilibrée de 1/3 MEF T75 avec cm (préparée conformément à l’étape 1.2)</li>
	<li>Culture à 37 °C/5 % deCO2 pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire.</li>
	<li>Aspirer le CM tous les jours et le remplacer par du CM fraîchement préparé (comme à l’étape 1.2) pendant environ deux semaines. Les cultures de cellules P7 pluripotentes (TG30Hi-GCTM-2Hi)montrent des colonies humaines ressemblant à des tiges après une semaine et atteignent une confluence d’environ 80% à 9-11 jours. Les cultures de cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)se développent principalement comme une pelouse de cellules ressemblant à des fibroblastes qui atteint la confluence à 11-13 jours. À ce stade, si nécessaire, les cultures cellulaires P4 et P7 peuvent être utilisées pour la reculture consécutive médiée par TG30/GCTM-2 FACS de sous-propriétés P4 ou P7 (voir les figures 2 et 3).</li>
</ol>

<ol><li>Pera, M. F., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+regulation+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrinsic regulation of pluripotent stem cells.</a> Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).</li>
<li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li>
<li>Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+safety+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).</li>
<li>Polanco, J. C., Laslett, A. L. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolanco%2C+JC+%22Pluripotent+Stem+Cells%22">Pluripotent Stem Cells</a>. Lenka, N. , InTech. (2013).</li>
<li>Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+analysis+of+early+lineage+commitment+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells.</a> BMC Dev. Biol. 7, 12(2007).</li>
<li>Kolle, G., Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+defined+human+embryonic+stem+cell+populations+for+transcriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7(2010).</li>
<li>Stem Cell Protocols - WiCell. , WiCell. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx">http://www.wicell.org/home/support/stem-cell-protocols/stem-cell-protocols.cmsx</a> (2013).</li>
<li>Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+SSEA-4+and+TRA-1-60+labelled+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+from+a+heterogeneous+cell+population+using+magnetic-activated+cell+sorting+%28MACS%29+and+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).</li>
<li>Schriebl, K., Satianegara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+removal+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+using+magnetic+activated+cell+sorting+followed+by+a+cytotoxic+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody.</a> Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).</li>
<li>Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Michalska, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+mouse+embryonic+fibroblasts+and+preparation+of+mouse+embryonic+feeder+layer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3(2007).</li>
<li>Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuum+of+cell+states+spans+pluripotency+and+lineage+commitment+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 4, e7708(2009).</li>
<li>Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+is+coupled+to+changes+in+the+cell+cycle+regulatory+apparatus+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).</li>
<li>Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O'Brien, C., Laslett, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unsafe+human+IPSC+lines+using+a+robust+surrogate+assay+for+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).</li>
<li>Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclinical+safety+strategies+for+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nonclinical safety strategies for stem cell therapies.</a> Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).</li>
</ol>

Rien à divulguer.

Dans le contexte clinique, les types de cellules somatiques différenciés sont le produit final souhaité pour la transplantation et les applications thérapeutiques, et les hPSC sont une source auto-renouvelée et évolutive pour générer ces cellules somatiques ou leurs progéniteurs en laboratoire. La présence de CSEh indifférenciés résiduels avec un potentiel inhérent pour la formation de tératome est un risque pour la sécurité en considérant les cellules somatiques hESC-dérivées pour la transplantation dans les patients. Pour un examen de ce risque et d’autres risques associés à la thérapie cellulaire, veuillez consulter Sharpe et coll. 16 Par conséquent, pour réaliser de telles applications, il est impératif que les chercheurs visent à générer des populations de cellules cibles qui sont également exemptes de cellules souches pluripotentes. À cette fin, nous démontrons ici qu’en utilisant notre méthodologie FACS TG30/GCTM-2, il est possible de surveiller la présence de cellules pluripotentes (TG30Hi-GCTM-2Hi)dans une population de cellules différenciantes et d’obtenir des dérivés viables différenciés par hESC qui peuvent être enrichis et recultures post-FACS. Bien qu’il ne soit pas possible d’obtenir des échantillons 100% sans cellules souches pluripotentes avec un seul passage de notre protocole, les dérivés hESC enrichis peuvent être recultured et après un passaging consécutif 100% pureté des cellules somatiques est atteint. La viabilité démontrée des cellules somatiques pour l’expansion post-FACS permet également potentiellement la production d’un nombre adéquat de cellules adaptées aux thérapies de transplantation potentielles.
Les résultats encourageants de cette étude pilote nous ont incités à effectuer une enquête plus complète en utilisant notre protocole TG30/GCTM-2 dans une étude comparative avec plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC)15. Dans cette étude, nous avons constaté que les échantillons sans cellules souches pluripotentes obtenus à l’aide de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 ne généraient pas de tératomes lorsqu’ils étaient transplantés chez des souris privées d’immunité. Par conséquent, nous pouvons affirmer avec confiance qu’avec l’utilisation de ce protocole in vitro, les cultures cellulaires de différenciation à un stade précoce déterminées comme étant exemptes de cellules pluripotentes TG30 Hi-GCTM-2Hi ne développent pas de teratomas in vivo. Cela soutient fortement la robustesse de notre test, fournissant une approche potentielle pour éliminer le risque de formation de tératomes avant l’utilisation de cellules dérivées de hPSC dans des applications cliniques.
A l’inverse, nous montrons également que le test FACS TG30/GCTM-2 peut être utilisé pour récupérer une populationcellulaire pluripotente avec un niveau d’expression élevé de ces deux antigènes de surface (TG30 Hi-GCTM-2Hi). Des études antérieures ont montré que les cellules TG30Hi-GCTM-2Hi présentent la corrélation la plus élevée avecl’expression de l’oct4 hi et forment le plus grand nombre de colonies de type hESC5,6,13,15. Nous pensons donc que le réseau de pluripotence estactivé à ses niveaux maximaux dans les cellules exprimant TG30 Hi-GCTM-2Hi. Nous considérons que l’utilisation de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 et la récupération des cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)pourraient permettre une purification à grande échelle des cultures hESC vivantes enrichies, en tant qu’entrées dans les tests de différenciation.
En conclusion, nous démontrons ici la potentialité de nos essais FACS basés sur l’expression combinée des antigènes de surface TG30 et GCTM-2 pour la purge et l’enrichissement des cseh. Les études futures avec des protocoles pour la différenciation dirigée des hPSCs sont susceptibles d’être également informatives concernant cette potentialité. Nous sommes conscients que dans certains essais où les dérivés hESC différenciés expriment temporellement TG30 (CD9) ou GCTM-2, ces deux anticorps pourraient ne pas être appropriés ou suffisants pour purger les cellules pluripotentes d’une population différenciée à un moment donné dans l’essai6. Par conséquent, il existe un besoin continu de trouver de nouveaux anticorps qui reconnaissent spécifiquement les CSEh vivants pour surmonter la limitation possible de la réaction croisée avec certains types de cellules différenciées.

Les CHP (CSEh) comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes d’origine humaine (CSEh). Le HPSC peut s’auto-renouveler indéfiniment dans des conditions de culture appropriées sans perdre sa capacité connue sous le nom de « pluripotence ». La pluripotence est définie comme le potentiel d’une cellule à se différencier en essentiellement n’importe quelle lignée cellulaire somatique, y compris les cellules représentatives de chacune des trois couches de cellules germinales embryonnaires. Le potentiel remarquable de l’hPSC fournit un moyen pour une grande variété d’applications cellulaires, y compris des options thérapeutiques. Par exemple, il existe des troubles impliquant la mort cellulaire et la dégénérescence, où la fonctionnalité normale des cellules dans le corps humain est compromise, comme dans l’insuffisance cardiaque, les blessures à la colonne vertébrale, le diabète, la maladie de Parkinson, certains cancers et d’autres pathologies cliniques. Les patients souffrant de ces conditions pourraient potentiellement être traités en transplantant des cellules somatiques saines et fonctionnelles qui ont été dérivées de l’hPSC en laboratoire. Cependant, les protocoles actuels de différenciation hPSC ne sont pas efficaces à 100% et donnent un mélange de types de cellules cibles et hors cible différenciés, ainsi que de hPSCs résiduels qui n’ont pas subi de différenciation, continuant plutôt à s’auto-renouveler1-3. La présence même d’un petit nombre de hPSC dans un échantillon de cellules somatiques hPSC-dérivées destinées à la transplantation dans les patients constitue un risque clinique sérieux car ces cellules par leur nature inhérente pour former des tissus des trois couches germinales embryonnaires, pourraient potentiellement former in vivo un type de tumeur connu sous le nom de teratoma. Par conséquent, seules les populations de cellules cibles jugées exemptes de cellules souches pluripotentes peuvent être considérées comme sûres pour la transplantation chez les patients. Plusieurs approches ont été signalées pour réaliser potentiellement la purge des CSHS résiduelles après la différenciation (pour un examen, voir Polanco et Laslett4). Nous avons précédemment rapporté l’utilisation des anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 couplés au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour identifier les cellules souches pluripotentes et les distinguer des cellules subissant un stade précoce de différenciation dans les cultures de lignéeshESC 5-7.
L’un des avantages de l’utilisation d’anticorps pour détecter les antigènes de surface cellulaire est que les cellules cibles sont généralement viables après la liaison et/ou le marquage des anticorps. Par conséquent, les cellules cibles peuvent être collectées après le marquage des anticorps et reculture pour l’expansion et d’autres applications avant la transplantation. Une mise en garde pour les antigènes de surface cellulaire exprimés sur hPSC est qu’ils ne sont pas exclusifs au stade pluripotent et sont dans de nombreux cas ré-exprimés temporellement pendant le développement et seront donc détectés dans certains types de cellules différenciées. Par conséquent, si l’objectif est d’utiliser des anticorps pour détecter des cellules pluripotentes humaines et les purger d’un échantillon de cellules dérivées de l’hPSC, les anticorps sélectionnés ne devraient pas également réagir avec des antigènes sur les types de cellules différenciés spécifiques destinés à la transplantation. Malheureusement, il existe un nombre limité d’anticorps qui détectent les marqueurs de surface cellulaire sur les hPSCs vivants 4, ce qui limite les options de sélection. En outre, quelques études ont souligné que la détection d’un seul marqueur de surface cellulaire n’est pas suffisante pour éliminer toutes les HPSC, suggérant que toute tentative d’éliminer toutes les sous-populations pluripotentes hPSC devrait s’appuyer sur des méthodes qui utilisent deux anticorps ou plus détectant différents épitopes exprimés par hPSCs 9-10. Comme mentionné ci-dessus, seules les cellules dérivées du CHSP qui pourraient être déterminées comme des populations de cellules souches pluripotentes exemptes de cellules sont appropriées pour la transplantation humaine. Atteindre ce niveau de rigueur peut ne pas être atteint avec un seul passage à travers une technologie de tri cellulaire à médiation anticorps. La reculture de la population enrichie de cellules cibles différenciées et les cycles ultérieurs de tri cellulaire peuvent être nécessaires pour obtenir définitivement des échantillons pluripotents sans cellules souches.
Dans notre laboratoire, nous avons largement caractérisé deux anticorps hES de surface cellulaire, TG30 (CD9) et GCTM-2, pour la détection de cellules pluripotentes vivantes. Nos études ont montré que la détection combinée de TG30 et GCTM-2 est fortement corrélée avec l’expression de gènes associés à la pluripotence canonique dans les lignées hESC 5-7. L’immunoprofilage TG30/GCTM-2 FACS a constamment montré que les cultures hESC constituent un gradient continu quantitatif de l’expression TG30/GCTM-2 5-7. Nous avons arbitrairement établi quatre populations (P) de cellules dans ce gradient TG30/GCTM-2 : P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)et P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Notre caractérisation de ces populations de cellules P4, P5, P6 et P7 a montré que les sous-fractions P6 et P7 expriment un grand nombre de gènes associés à la pluripotence et forment efficacement des colonies en forme de tige lorsqu’elles sont recultured post-FACS 2-3. D’autre part, les cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)expriment un grand nombre de marqueurs de différenciation et constituent les types de cellules spontanément différenciés qui se produisent généralement dans les cultures en expansion des lignées hESC 5-6. Nous avons décidé de tester la potentialité de notre FACS TG30/GCTM-2 pour l’élimination sélective des hPSCs résiduels suite à une différenciation précoce, et aussi pour l’enrichissement des populations de cellules souches pluripotentes. Le protocole décrit ci-dessous montre comment collecter et reculturer des cellules P4 différenciées (TG30Neg-GCTM-2Neg)post-FACS pour accomplir la purge de P7 pluripotent (TG30Hi-GCTM-2Hi). En outre, nous expliquons également la collecte et la reculture de cellules pluripotentes P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)pour obtenir une culture enrichie de cellules pluripotentes, qui pourraient ensuite être utilisées comme population d’entrée définie pour augmenter potentiellement l’efficacité et la cohérence des tests de différenciation.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td>Nom long : Dulbecco’s Modified Eagle Medium :Mélange de nutriments F-12</td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>Nom long : Knockout Serum Replacement</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Nom long : GlutaMAX</td></tr><tr><td>supplement Nonessential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>Nom long : MEM Solution d’acides aminés non essentiels</td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td>Nom long : 2-Mercaptoethanol</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td>Nom long : Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, sans calcium, sans magnésium</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604039</td><td>Nom long : TrypLE Express (1x), sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>AF-488</td><td>Life Technologies</td><td>A21131</td><td>Nom long : Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG2a</td></tr><tr><td>AF-647</td><td>Life Technologies</td><td>A21238</td><td>Nom long : Alexa Fluor 647 chèvre anti-souris IgM</td></tr><tr><td>PE-anti IgG2a</td><td>Life Technologies</td><td>P21139</td><td>Nom long : R-Phycoérythrine chèvre anti-souris IgG2a (&gamma ; 2a) Conjugué</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Nom long : Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high glucose</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Nom long : Pénicilline-streptomycine, eau distillée</td></tr><tr><td></td><td>liquide Life Technologies</td><td>15230-089.</td><td>Nom long : Eau distillée stérile</td></tr><tr><td>PI</td><td>SIGMA</td><td>P4864</td><td>Nom long : Solution d’iodure de propidium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>SIGMA</td><td>12203C</td><td>Nom long : Gélatine sérique bovine fœtale</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>Nom long : Gélatine de peau porcine</td></tr><tr><td>Humain FGF-2</td><td>Millipore</td><td>GF003AF-100UG</td><td>Nom long : Facteur de croissance des fibroblastes basique, recombinant humain, sans animaux</td></tr><tr><td>Filtre 0.22 &mu ; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>Nom long : Stericup-GP, 0.22 &mu ; M, polyéthersulfone, 250 ml, radio-stérilisé</td></tr><tr><td>70 &mu ; m Cell Strainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>Nom long : Cell strainer avec 70 &mu ; m Maille de nylon</td></tr><tr><td>35 &mu ; m Filtre à cellules de couvercle, tube de 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>Nom long : Tube à essai à fond rond en polystyrène de 5 ml, avec un capuchon de filtre à cellules (35 &mu ; m)</td></tr> <tr><td>5 ml Tube à essai à fond rond en polystyrène</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>Nom long : 5 ml Tube à essai à fond rond en polystyrène,</td></tr><tr><td>stérile IgG2a Contrôle de l’isotype</td><td>Becton Dickinson</td><td>554126</td><td>Nom long : Souris purifiée IgG2a, &kappa ; Contrôle des isotypes</td></tr><tr><td>IgM Contrôle des isotypes</td><td>Becton Dickinson</td><td>553472</td><td>Nom long : IgM de souris purifiée, &kappa ; Contrôle d’isotype</td></tr><tr><td>PE-CD90.2</td><td>Becton Dickinson</td><td>553014</td><td>Nom long : PE Rat Anti-Mouse CD90.2</td></tr><tr><td>8-peaks calibration</td><td>Becton Dickinson</td><td>559123</td><td>Nom long : Rainbow Calibration Particles (8 pics)</td></tr><tr><td>Tube stérile en polypropylène de 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Nom long : Tube en polypropylène de 50 ml à fond conique,</td></tr><tr><td>fiole stérile T75</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Nom long : CELLSTAR Filter Cap Culture cellulaire 75 cm2 Fioles</td></tr><tr><td>TG30</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB4427</td><td>Nom long : TG30 Anticorps clone TG30</td></tr><tr><td>GCTM-2</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB4346</td><td>Nom long : GCTM-2 n’est pas disponible dans le commerce, mais TG343 et l’anticorps monoclonal équivalent le sont</td></tr><tr><td colspan="4">Tableau 4. Liste des matériaux et</td></tr> <tr><td>réactifsMachine FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>FACSVantage SE avec option FACSDiva</td></tr><tr><td>Microscope inversé Olympus</td><td></td><td></td><td>IX71</td></tr><tr><td colspan="4">Tableau 5. Liste des équipements.</td></tr></tbody></table>

enrichissement et purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d’antigènes de surface cellulaire à l’aide des anticorps monoclonaux tg30 et gctm-2

Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) peuvent s’auto-renouveler indéfiniment in vitroet, avec les indices appropriés, peuvent être induites pour se différencier en potentiellement toutes les lignées cellulaires somatiques. Les dérivés différenciés de hESC peuvent potentiellement être utilisés dans les thérapies de transplantation pour traiter une variété de maladies cellulaires dégénératives. Cependant, les protocoles de différenciation hESC produisent généralement un mélange de types de cellules cibles et hors cible différenciés ainsi que de cellules indifférenciées résiduelles. Pour la traduction des dérivés hESC différenciés du laboratoire à la clinique, il est important de pouvoir distinguer les cellules indifférenciées (pluripotentes) et différenciées, et de générer des méthodes pour séparer ces populations. L’application sûre des types hESC-dérivés de cellules somatiques peut seulement être accomplie avec les populations cellules-libres de tige pluripotentes, car les hESCs résiduels pourraient induire des tumeurs connues sous le nom de teratomas après la transplantation. Vers cette fin, nous décrivons ici une méthodologie pour détecter la pluripotence associée aux antigènes de surface cellulaire avec les anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’identification des CSEh TG30 pluripotentsHi-GCTM-2Hi en utilisant la sélection positive. En utilisant la sélection négative avec notre méthodologie TG30/GCTM-2 FACS, nous avons pu détecter et purger les CSEh indifférenciés dans les populations subissant une différenciation à un stade très précoce (TG30Neg-GCTM-2Neg). Dans une autre étude, des échantillons pluripotents sans cellules souches de cellules TG30Neg-GCTM-2Neg différenciées sélectionnées à l’aide de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 n’ont pas formé de teratomes une fois transplantés chez des souris immunodéprimées, ce qui a soutenu la robustesse de notre protocole. D’autre part, le passaging consécutif médié par le TG30/GCTM-2 FACS du TG30Hipluripotent enrichi -GCTM-2Hi hESCs n’a pas affecté leur capacité à s’auto-renouveler in vitro ou leur pluripotence intrinsèque. Par conséquent, les caractéristiques de notre méthodologie FACS TG30/GCTM-2 fournissent un test sensible pour obtenir des populations hautement enrichies de hPSC comme intrants pour les tests de différenciation et pour débarrasser les hESC potentiellement tumorigènes (ou résiduels) des populations de cellules dérivées.

Les dérivés hESC qui sont exempts de cellules souches pluripotentes peuvent être obtenus par passaging consécutif de cellules de la sous-fraction P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg).
Des rapports précédents ont établi que dans les cultures standard hESC coexistent un mélange de sous-populations présentant un gradient d’expression de gènes associés à la pluripotence5,6,13. La détection combinée d’antigènes de surface cellulaire comme TG30 (CD9) et GCTM-2 permet la discrimination d’un certain nombre de sous-ensembles de cellules au stade pluripotent et à divers stades de différenciation précoce, comme l’indique leur expression de marqueurs de cellules souches et de facteurs de transcription spécifiques à la lignée5,6,13. En accord avec les rapports précédents, nous avons pu distinguer les cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)et P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)dans la ligne hESC-MEL1 utilisée pour cette étude(figure 1). Avec ce résultat, nous avons procédé à la collecte différenciée P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)cellules et pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)cellules pour la culture ultérieure dans les études décrites ci-dessous.
Nous avons étudié si, en utilisant une approche de sélection négative, nous pouvions purger les CSEh indifférenciés des populations cellulaires subissant une différenciation à un stade très précoce (TG30Neg-GCTM-2Neg). Nous avons utilisé un nombre défini de cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)qui ont été successivement cultivées post-FACS(figure 2A)pendant environ deux semaines, et réanalysées à l’aide de TG30/GCTM-2 FACS avant de replater à chaque passage. Les résultats ont montré que la P4-subfraction enrichie pour TG30Neg-GCTM-2Neg différenciait les types de cellules après passaging consécutif, et une présence mineure de cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)au passage initial(Figure 2A,Passage 1) a finalement disparu après un nouveau passaging, devenant des échantillons pluripotents sans cellules souches(Figure 2A,Passage 3).
L’enrichissement des cellules hESC pluripotentes peut être réalisé par la collecte des cellules TG30Hi-GCTM-2Cellules Hi.
Sur la base d’observations antérieures utilisant ce test, nous nous attendrions à un enrichissement des CSEh pluripotents en collectant des cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)qui devraient former des colonies de CSEh. Par conséquent, nous avons également étudié le passaging consécutif facs-négocié par TG30/GCTM-2 des cellules pluripotentes P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Dans ces cultures P7, TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling a été exécuté avant de replating des cellules à chaque passage et seulement des cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)ont été recultured. De cette façon, nous avons observé que la majorité des cellules étaient situées dans les sous-fractions associées à la pluripotence (P6 et P7), indiquant un enrichissement des cellules pluripotentes qui maintenaient également une capacité à différencier et à générer un petit pourcentage de cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)(Figure 3A). En outre, les cultures de cellules P7 ont montré un grand nombre de colonies de type hESC pendant le passaging(figure 3B),indiquant également le maintien de l’état de pluripotence.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig1.jpg"> Figure 1. Stratégie de tri représentative pour obtenir des sous-fractions FACS TG30/GCTM-2. (A): Les suspensions de cellules hES dissociées sont triées comme des cellules simples et les touffes ou doublets potentiels sont fermées avec la dispersion vers l’avant pour la hauteur et la surface (FSC-H et FSC-A). (B) : Les débris potentiels sont éliminés avec FSC-A et SSC-A, et seules les cellules intactes sont triées. C) : Les cellules non viables sont exclues en fonction de la fluorescence de l’iodure de propidium (PI) (FSC-A et FL3-A). (D) : Des cellules d’alimentation de MEF ont été fermées par sélection négative basée sur l’expression de cd90.2-PE de souris (FL2-A et SSC-A). (E) : La fraction hESC viable isolée, exempte de mangeoires MEF, est finalement fractionnée en sous-populations P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)et P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). La porte négative (TG30Neg-GCTM-2Neg,nommée P4) a été réglée en fonction de l’autofluorescence de fond pour les cellules non souillées et également des contrôles d’isotype. (F) : Pourcentages des différentes sous-populations fermées typiques d’une analyse cytométrique en flux TG30/GCTM-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la silhouette.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig2.jpg"> Figure 2. Cultures consécutives représentatives de cellules P4 spontanément différenciées (TG30Neg-GCTM-2Neg)de la ligne hESC-MEL1. (A) : Graphiques facs représentatifs TG30/GCTM-2 montrant des sous-ensembles de cellules fermées (P4, P5, P6 et P7) discriminés par le niveau d’expression détecté des marqueurs de surface cellulaire TG30 et GCTM-2. Une population initiale de 400 000 dérivés hESC présentant une immunoprofilage P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)est recueillie à partir de cultures en vrac de la lignée hESC-MEL1. Ces cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)sont successivement passageées post-FACS dans des conditions favorables au renouvellement du cseh dans les fioles T75, jusqu’à atteindre la confluence (11-13 jours). Avant chaque passage, le FACS TG30/GCTM-2 est effectué pour collecter et reculturer uniquement les types de cellules différenciés P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg). (B) : Morphologie typique de la pelouse des cellules différenciées P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)après 14 jours. C) : Des colonies sporadiques de type hESC vues après 14 jours mélangées à la pelouse des cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)au passage 1 seulement, sont très probablement générées par la contamination des cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la silhouette.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig3.jpg"> Figure 3. Les cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)dérivées de raies hESC peuvent être successivement passées post-FACS sans perdre leurs propriétés pluripotentes intrinsèques. Immunoprofilage représentatif TG30/GCTM-2 FACS des différents passages consécutifs, montrant les sous-ensembles discriminés de cellules (P4, P5, P6 et P7) selon le niveau d’expression de TG30 et GCTM-2. (A) : Une population de départ de 400 000 cellules montrant des caractéristiques P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)est récupérée à partir de cultures en vrac de la lignée hESC-MEL1. Les cellules P7 pluripotentes (TG30Hi-GCTM-2Hi)sont successivement croisées après facs dans des conditions favorables au renouvellement de la CSEh dans les fioles T75, jusqu’à atteindre une confluence d’environ 80 % (9 à 11 jours). L’immunoprofilage TG30/GCTM-2 FACS est effectué avant de replater les cellules à chaque passage et seules les cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)sont recultures. Les résultats montrent que les cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)conservent leurs caractéristiques pluripotentes avec un passaging ultérieur, y compris la conservation de l’expression (TG30Hi-GCTM-2Hi),formant des colonies de type hESC (montrées en B)et maintenant la capacité de différencier comme on peut le déduire de la récapitulation d’une petite fraction de P4 différencié (TG30Neg-GCTM-2Neg)dans chacun des gradients FACS. Barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la silhouette.</a>
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Échantillon (volumes de réaction)</td>
			<td>Anticorps primaires</td>
			<td>Anticorps secondaire</td>
			<td>PE Rat Anti-Souris CD90.2 b</td>
			<td>Iodure de propidium c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Échantillon de tri (~ 9 ml pour les ABs primaires, 2,5 ml pour les ABs secondaires)</td>
			<td>(TG30 + GCTM-2) a
</td>
			<td>AF 488 chèvre anti-souris IgG2a + AF 647 chèvre anti-souris IgM</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Témoin 1 : TG30 (200 μl)</td>
			<td>TG30</td>
			<td>AF 488 chèvre anti-souris IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Témoin 2 : GCTM-2 (200 μl)</td>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>AF 647 chèvre anti-souris IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Contrôle-3 : CD90.2 anti-souris (200 μl)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Témoin 4 : Phycoérythrine (EP) (200 μl)</td>
			<td>Isotype IgG2a de souris</td>
			<td>R-phycoérythrine chèvre anti-souris IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Contrôle 5 : Isotype de l’immunoglobuline de souris (200 μl)</td>
			<td>Isotype IgG2a de souris + isotype IgM</td>
			<td>AF 488 chèvre anti-souris IgG2a + AF 647 chèvre anti-souris IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Témoin 6 : Cellules non colorées (200 μl)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Exemple de tri et contrôles pour le tri FACS. a L’échantillon de tri est immunostained simultanément avec des anticorps TG30 et GCTM-2. b PE-anti-souris CD90.2 est utilisé pour reconnaître les cellules de souris et supprimer les MEF des hESCs au cours de FACS14. c Les cellules non viables sont exclues à l’aide d’iodure de propidium à une concentration finale de 0,3 μg/ml. Réactif ajouté (+), non ajouté (-) au tube de réaction.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>anticorps </td>
			<td>hôte</td>
			<td>Isotype</td>
			<td>Dilution de travail</td>
		</tr>
<tr>
<td>TG30 (1,4 mg/ml)</td>
			<td>souris</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>GCTM-2 (hybridome surnageant)</td>
			<td>souris</td>
			<td>Igm</td>
			<td>1:5 ~ 1:10 a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 488 chèvre anti-souris IgG2a</td>
			<td>chèvre</td>
			<td>Polyclonale</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 647 chèvre anti-souris IgM</td>
			<td>chèvre</td>
			<td>Polyclonale</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-phycoérythrine (PE) chèvre anti-souris IgG2a</td>
			<td>chèvre</td>
			<td>Polyclonale</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD90.2 anti-souris</td>
			<td>rat</td>
			<td>IgG2b</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Souris purifiée IgG2a, κ Contrôle d’isotype</td>
			<td>souris</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM de souris purifiée, κ Contrôle d’isotype</td>
			<td>souris</td>
			<td>Igm</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2. Détails et dilutions d’anticorps pour le tri FACS. a En raison de l’expression extrêmement très élevée de GCTM-2 sur la surface cellulaire des CSEh, il n’est pas possible d’atteindre la saturation avec cet anticorps. Chaque lot de surnageant d’hybridome GCTM-2 doit être titré par rapport à un témoin standard ou à un lot précédent afin d’obtenir des résultats similaires avec des CSEh à l’échelle et d’éviter les taches excessives.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Nom du support</td>
			<td>composition</td>
		</tr>
<tr>
<td>hESC/KOSR moyen</td>
			<td>Milieu Eagle modifié de Dulbecco: Mélange de nutriments F-12 (DMEM / F-12) complété par 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Acides aminés non essentiels, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ ml facteur de croissance des fibroblastes humains 2 (FGF-2) et Pen / Strep à 1x.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu MEF</td>
			<td>Le produit Modified Eagle Medium, high glucose (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de GlutaMAX et Pen /Strep à 1x.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3. Composition des milieux de culture.

Nous décrivons l’utilisation des anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 pour la détection combinée des antigènes de surface cellulaire par l’intermédiaire du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’identification et l’enrichissement des cellules souches embryonnaires humaines vivantes (hESC) utilisant la sélection positive et également l’utilisation de la sélection négative pour purger hESCs d’une population mélangée de cellules.

Enrichissement et purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d’antigènes de surface cellulaire à l’aide des anticorps monoclonaux TG30 et GCTM-2

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

L’objectif global de cette procédure est de trier les sous-ensembles de cellules souches embryonnaires humaines en fonction de leur liaison à l’antigène de surface cellulaire des deux anticorps monoclonaux TG 30 et GC TM. Ceci est accompli en dissociant d’abord des cultures de cellules souches embryonnaires humaines ou HESC en suspensions unicellulaires. Dans la deuxième étape, les HESC sont colorés avec les anticorps monoclonaux, TG 30 et GCTM deux.Enfin, les cellules sont séparées par un tri cellulaire activé par fluorescence et renvoyées en culture. En fin de compte, la capacité de formation de colonies des cellules triées peut être évaluée par cytométrie en flux et microscopie à contraste de phase. L’image principale de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’observation visuelle, est qu’elle fournit une mesure objective de la pluripotence cellule par cellule pour un grand nombre de cellules, ce qui facilite la séparation des cellules souches embryonnaires des cellules différenciées.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pluripotence, telles que la façon dont les changements dans les conditions de culture affectent quantitativement différentes lignées de cellules souches embryonnaires humaines et de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Pour fabriquer une suspension unicellulaire Hess, commencez par aspirer le milieu de culture Hess à partir de deux flacons T 75 contenant une lignée cellulaire Hess cultivée. Lavez chaque flacon avec 10 millilitres de DPBS, puis incubez chaque culture avec trois millilitres de solution de dissociation exprimée en triple E à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.Au bout de cinq minutes, cognez le côté du ballon pour déloger les cellules, puis confirmez le détachement au microscope. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture froid dans chaque flacon à l’aide d’une pipette stérile de 10 millilitres. Tritrate doucement les cellules dissociées plusieurs fois contre la paroi du ballon pour obtenir une suspension principalement unicellulaire.Mélangez maintenant les suspensions unicellulaires hes à travers une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube stérile en polypropylène de 50 millilitres pour colorer les antigènes de surface cellulaire Hess. Tout d’abord, Eloqua a réuni environ 100 000 cellules dans 150 microlitres de milieu dans chacun des six microtubes de centrifugation de contrôle de 1,5 millilitre. Ensuite, incubez les tubes de contrôle et l’échantillon de tri restant avec les anticorps primaires d’intérêt dans des volumes de réaction finaux de 200 microlitres et d’environ neuf millilitres respectivement dans des milieux de culture, y compris les contrôles d’isotype.Placez les tubes horizontalement sur de la glace et mélangez-les doucement pendant 30 minutes sur une plate-forme à bascule. Après avoir fait tourner les cellules, jetez le surnageant, puis lavez l’échantillon de tri dans 20 millilitres de milieu de culture froid et les échantillons de contrôle dans 200 microlitres du même. Maintenant, incubez l’échantillon de tri dans un volume final de 2,5 millilitres avec les anticorps secondaires appropriés dans un milieu de culture froid et les témoins dans un volume final de 200 microlitres du même ajoutez, ajoutez l’anticorps PE anti-US CD 90.2 fraîchement préparé dans le tube de contrôle approprié à ce moment-là également.Encore une fois, mélangez délicatement les tubes horizontalement sur de la glace pendant 30 minutes sur une plate-forme à bascule. Après avoir fait tourner les cellules, remettez à nouveau l’échantillon de tri en suspension dans 20 millilitres de milieu de culture froid et les témoins dans 200 microlitres et lavez les cellules deux fois dans le milieu. Remettre en suspension l’échantillon de tri dans deux à trois millilitres de milieu de culture froid complété par de l’iodure de propidium et chacun des témoins, à l’exception des cellules non colorées, dans 300 microlitres de même.Ensuite, filtrez chaque suspension cellulaire individuelle à travers une crépine à couvercle de 35 microns couplée à des tubes à essai à fond rond en polystyrène de cinq millilitres et centrifugez les tubes pour forcer toute suspension cellulaire résiduelle sur les couvercles de la crépine dans les tubes. Tapotez ensuite les côtés des tubes pour remettre en suspension chaque cellule unique et placez les cellules sur de la glace. Configurer le cytomètre en flux pour le tri cellulaire activé par fluorescence TG 30 GCTM à deux fins afin que les suspensions de cellules Hess dissociées soient contrôlées comme des cellules uniques afin d’éliminer les amas et les doublets potentiels.Ensuite, éliminez les débris potentiels à l’aide des portes de diffusion avant et latérale afin que seules les cellules intactes soient triées. Ensuite, excluez les cellules non viables en fonction de leur expression d’iodure de propidium. Éliminez les fibroblastes embryonnaires de souris ou les cellules nourricières de méthamphétamine par sélection négative basée sur leur expression de CD 90.2 pe de souris.Réglez la démarche négative du TG 30 G CTM à deux en fonction de l’autofluorescence de fond pour les cellules non colorées ainsi que des contrôles d’isotype. La fraction HESC viable isolée exempte de méthamphétamine peut ensuite être fractionnée en TG 30 négatif : GCT M, deux négatifs TG 30, GCT M faibles : deux TG 30 faibles, GC TM deux moyens et TG 30 GCTM élevés ; deux sous-populations élevées. Après avoir installé le cytomètre en flux, ajoutez un millilitre de milieu conditionné à la méthamphétamine dans chacun des deux tubes à essai à fond rond en polystyrène de cinq millilitres et placez-les sur de la glace.Récupérez ensuite 400 000 cellules chacune à partir du TG 30 négatif différencié, du GC TM deux négatifs et du pluripotent TG 30 élevé GCTM deux sous-fractions cellulaires élevées. Après avoir fait tourner les tubes collecteurs, suspendez chaque pastille de cellule dans un millilitre de milieu conditionné MEF pré-équilibré. Ensuite, ensemencez un flacon T 75 pré-équilibré d’un tiers de densité MEF avec les HESC de chaque fraction dans un milieu conditionné à la méthamphétamine, incubez les cultures cellulaires à 37 degrés Celsius à 5 % de CO2, en rafraîchissant le milieu quotidiennement pendant environ deux semaines.Les cultures de cellules pluripotentes TG 30 high GCTM two montrent des colonies de type souche humaine après une semaine et atteignent environ 80 % de fluidité au bout de neuf à 11 jours. Les cultures de cellules TG 30 négatives GC TM deux négatives se développent principalement comme une pelouse de fibroblastes comme des cellules qui atteignent la co-fluidité à 11 à 13 jours. La détection combinée des antigènes de surface cellulaire TG 30 et GC TM deux permet la discrimination d’un certain nombre de sous-ensembles cellulaires au stade pluripotent et à divers stades de la différenciation précoce des HESC, comme l’indiquent leur expression de marqueurs de cellules souches et de facteurs de transcription spécifiques à la lignée en accord avec les rapports précédents, le TG 30 GC TM deux négatifs faibles, Les sous-fractions moyennes et élevées peuvent être discriminées au sein de la lignée de cellules souches embryonnaires humaines mâles utilisée pour cette étude ici, les pourcentages des différentes sous-populations fermées typiques d’une analyse de cytométrie à deux flux TG 30 GCTM sont montrés dans l’expérience présentée ici.Un nombre défini de cellules TG 30 négatives GCT M deux négatives a été cultivé consécutivement après le tri pendant environ deux semaines, puis a eu recours à la collecte uniquement de la fraction négative TG 30 GCT M deux négatifs avant le replacage. A chaque passage, les résultats indiquent que la sous-fraction initiale TG 30 négative gct M deux négatifs enrichit pour TG 30 négative GCT M deux cellules différenciées négatives après conditionnement consécutif. Une population mineure de cellules TG 30 à GCT M élevé à deux cellules est détectée lors du passage initial, mais finit par disparaître avec un emballage ultérieur, ne laissant que des échantillons de cellules souches pluripotentes exemptes de cellules souches.Ici, la morphologie typique de la pelouse de TG 30 négatif différencié GCT M deux cellules négatives après 14 jours est montrée. Notez que les colonies sporadiques de type HESC observées après 14 jours se sont mêlées avec le TG 30 négatif GC TM deux cellules négatives qui sont très probablement générées par le contaminant TG 30 élevé GCT M deux cellules hautes. Notez que cela ne se produit que rarement et dans le passage initial post-faits basé sur les observations précédentes à l’aide de ce test, il est prévu que la collecte et la culture de TG 30 high GCTM deux cellules élevées devraient enrichir pour former des colonies formant des CSH pluripotentes.Par conséquent, l’emballage consécutif de cellules pluripotentes TG 30 high GCTM two high après tri par cytométrie en flux a également été étudié dans ces cultures représentatives, les cellules ont été triées par fax à l’aide de TG 30 et G CT M deux, remplaçant uniquement le TG 30 high G CTM deux cellules hautes à chaque passage. De cette façon, il a été observé que la majorité des cellules étaient situées dans les sous-fractions associées à la pluripotence, indiquant une population enrichie de cellules pluripotentes qui maintient également une capacité à différencier et à régénérer un petit pourcentage de cellules TG 30 négative G CTM deux cellules négatives. De plus, des cultures consécutives de cellules TG 30 à G CTM élevé deux cellules à haut tri présentent un grand nombre de colonies similaires à HESC après le passage, indiquant également le maintien de l’état de pluripotence.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’étalonner le télécopieur avant utilisation à chaque fois afin de garantir la reproductibilité des résultats Après cette procédure. D’autres méthodes telles que les microréseaux, le séquençage du génome entier ou les tératomes peuvent être effectuées pour répondre à des questions telles que : ces cellules sont-elles vraiment pluripotentes après son développement ? Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des cellules souches pluripotentes induites pour explorer la sécurité et la stabilité de ces cellules par rapport aux cellules souches embryonnaires humaines.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de colorer soigneusement des cultures mixtes de cellules souches humaines afin de les enrichir pour les cellules péritaires. N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines peut être extrêmement dangereux et que les précautions telles que le port de gants et le travail avec une enceinte de sécurité de classe deux doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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