Name: Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T19:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Découvrez la co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique chez Bacillus subtilis. Cette méthode utilise des souches rapporteuses fluorescentes pour visualiser les changements d'expression génique.

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L&#39;auteur remercie Roberto Kolter (Harvard Medical School) pour ses conseils et son aide lors de l&#39;élaboration de cet écran de co-culture inestimable. Elle remercie également Matthew Powers pour lire le manuscrit pour plus de clarté, et Chia-yi Cheng pour l&#39;aide à l&#39;obtention de la figure 6.

<ol><li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+microbial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
<li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li>
<li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiston%2C+DW+%22Introduction+to+Fluorescent+Proteins%22">Introduction to Fluorescent Proteins</a>. , (2013).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li>
<li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li>
<li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li>
<li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li>
<li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+%28CGG%29+genes+in+different+bacterial+genera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li>
<li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li>
<li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li>
<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7%3A+a+target+site-specific+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li>
<li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796(2012).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+culture+of+%27unculturable%27+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li>
<li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Saccharomyces+interactions%3A+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li>
<li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Une des limites inhérentes à ce protocole est qu&#39;il repose sur la cultivabilité d&#39;organismes microbiens. Comme il a été bien documenté 24, plus la vie microbienne sur la planète ne peut pas (encore) être cultivé dans les conditions de culture explorées à ce jour. Ainsi, un grand nombre d&#39;interactions entre les espèces microbiennes qui se produisent dans les milieux naturels ne soit pas détecté en utilisant cette approche. Cependant, depuis notre désir est d&#39;identifier non seulement l&#39;exist...

Nous sommes intéressés à comprendre comment les métabolites que les bactéries sécrètent affectent la physiologie et le développement des microbes voisins. De nombreux métabolites ont été caractérisés pour leurs effets bioactifs sur d&#39;autres microbes. Deux exemples bien décrits comprennent les antibiotiques, qui inhibent la croissance d&#39;autres micro-organismes et des molécules de détection de quorum, qui altèrent l&#39;expression génique globale d&#39;autres microbes. Cependant, les bactéries produisent de nombreuses autres petites molécules de produits naturels qui n&#39;ont pas de bioactivité connus 1. Nous émettons l&#39;hypothèse que les bactéries ont évolué et conservé la capacité de produire certains de ces métabolites car ils leur permettent de moduler la physiologie cellulaire de leurs voisins microbiennes dans les communautés microbiennes complexes qui existent dans la plupart des bactéries. Les types de cellules de Bacillus subtilis Nous avons concentré nos études sur les interactions microbiennes médiation chimique qui impliquent Bacilsubtilis UGB. Ce n&#39;est pas seulement en raison de son statut de bactérie modèle à Gram positif et les outils génétiques résultantes disponibles pour sa manipulation, mais aussi en raison de sa capacité à se différencier en différents types cellulaires caractérisés. Des exemples comprennent des cellules qui sont: la natation, produisant la matrice extracellulaire qui est requise pour la formation de biofilm robuste; compétentes pour absorber l&#39;ADN à partir de l&#39;environnement, et la sporulation, entre autres deux. Chacun de ces types de cellules exprime un régulon de transcription caractéristique qui les rend physiologiquement et / ou physiquement distinct de leurs frères et sœurs génétiquement identiques. Dans de nombreuses conditions de croissance, plusieurs types de cellules coexistent en tant que sous-populations différentes au sein d&#39;une seule colonie de B. cellules subtilis 3. Bien que de nombreuses espèces de bactéries peuvent présenter analogue type de cellule hétérogénéité, ce phénomène a été particulièrement bien étudié dans B. subtilis. En particulier, les gènes qui sont epuegulated à l&#39;intérieur de chacun de ceux-ci spécifique B. types de cellules subtilis ont été identifiés. L&#39;identification de ces gènes régulés à la hausse est essentiel pour le travail décrit ici parce que beaucoup de ces phénotypes microbiennes d&#39;intérêt sont difficiles ou impossibles à observer directement. Par exemple, nous ne pouvons pas détecter visuellement un trait comme la natation sur de solides (1,5%) des plaques d&#39;agar, même si une sous-population de B. cellules subtilis produisent des flagelles dans ces conditions 3. Un autre exemple est biofilm matrice-production. la production de la matrice peut être visualisée par la morphologie des colonies (comme il en résulte colonies ridées macroscopiquement), mais seulement sur ​​certains milieu de culture, et seulement après plusieurs jours de croissance 4. Cependant, en connaissant les gènes qui sont régulés à la hausse au cours de la différenciation, on peut construire reporters transcriptionnels qui agissent comme des marqueurs de différenciation cellulaire dans ces types cellulaires. constructions Reporter Ces fluorescent transcriptional reporters sont constitués par les promoteurs pour des gènes spécifiques du type cellulaire entraînant la production d&#39;un gène rapporteur, par exemple une protéine fluorescente. Les exemples incluent P hag-YFP (pour la natation cellules), P Tapa-YFP (pour les cellules de la matrice produisant biofilm), et P SSPB-YFP (pour la sporulation des cellules), où P x indique la région du promoteur pour le gène x. Ces constructions rapporteurs sont intégrés dans un locus sur le chromosome neutre (figure 1 et le voir ci-dessous) de sorte que la régulation native du phénotype est laissée intacte. Cependant, maintenant, quand une cellule exprime ce phénotype, il exprime aussi une protéine fluorescente. Ceci permet d&#39;obtenir une lecture facile à visualiser de l&#39;activation du comportement particulier phénotypique, ce qui nous permet de cribler des microbes qui activent cette réponse physiologique. Bien que de tels rapporteurs sont couramment utilisés en microbiologie, ils n&#39;ont pas été largement appliquée dans des écrans à identifinteractions métaboliques entre les microbes y avant cette méthode a été décrite 5. Il ya un certain nombre de considérations importantes dans la conception et la construction de-spécifique de type cellules souches rapporteurs. Nous avons utilisé journalistes fluorescents exclusivement transcription, bien que d&#39;autres types de constructions sont certainement possibles. Nous déconseillons l&#39;utilisation de fusions traductionnelles comme marqueurs de différenciation de type de cellule dans l&#39;écran, cependant, pour deux raisons: 1) le désir de quitter le spécifique de type cellulaire protéine native imperturbable, et 2) la reconnaissance que diffuse, cellulaire large fluorescence sera plus facile à détecter que les points lacrymaux localisée dans les cellules (commun avec fusions traductionnelles). sélection d&#39;un gène rapporteur Après avoir décidé d&#39;utiliser la transcription en-lue, le gène rapporteur doit être sélectionnée (par exemple LacZ, fluorescence, ou la luciférase). LacZ a l&#39;avantage de nécessiter le moins spécialeized matériel de détection, mais il ya un risque beaucoup plus élevé de faux positifs parmi les microbes de l&#39;environnement. Dans nos mains, le niveau du lac organismes + parmi les microbes du sol de fond était prohibitif (&gt;&gt; 10% des microbes du sol étaient bleues (Lac +) sur des plaques X-gal; données non présentées). Il est possible que la concentration en titrant de X-gal dans le milieu, ce qui pourrait être optimisé pour permettre l&#39;utilisation d&#39;un rapporteur X-gal, mais nous n&#39;avons pas cherché ce produit. Luciférase offre une grande sensibilité de détection et est le journaliste le plus orthogonal: il n&#39;y a presque aucune chance de microbes de l&#39;environnement étant intrinsèquement luminescent. Cependant, nous avons constaté qu&#39;il est difficile d&#39;identifier les instruments à notre institution qui permettait la détection de luminescence dans des boîtes de Pétri entières, comme la plupart ont été conçus pour numériser les régions ne localisées dans des plaques multi-puits. Il pourrait également y avoir des complications dans la visualisation des colonies luminescents d&#39;une manière qui a également permis à la physique simultanée estolation des organismes induisant. Tout en utilisant des fiduciaires peut avoir rendu cela possible, nous la place choisi d&#39;utiliser journalistes transcription fluorescentes, qui ont été prouvée à travailler en B. subtilis, à condition sensibilité adéquate des taux de détection et de faux positifs faibles entre les organismes du sol, et autorisés à utiliser des instruments facilement disponibles à la fois pour la visualisation et les procédures d&#39;isolement. sélection de fluorophore Le fluorophore spécifique choisi dépendra de vos espèces bactériennes, le milieu de croissance agar que vous utilisez, et le filtre de fluorescence particulier définit dont vous disposez. Avec nos instruments, nous avons constaté que les deux B. subtilis eux-mêmes et l&#39;agar ils ont été cultivés sur exposé moins de fluorescence de fond quand YFP (protéine fluorescente jaune) filtres ont été utilisés, ce qui rend ce journaliste supérieure à la GFP (protéine fluorescente verte) dans nos mains colonies. L&#39;usage des codons des protéines fluorescentes sontsouvent optimisé pour les eucaryotes, il est donc important de choisir un fluorophore soit connu de la littérature de travailler dans vos espèces bactériennes, ou pour tester explicitement l&#39;aide d&#39;un promoteur constitutif. Un grand nombre de constante évolution variantes de protéines fluorescentes sont actuellement disponibles 6, qui ont été examinés dans un certain nombre de sources 7,8, dont certains prévoient explicitement des conseils sur le choix d&#39;une protéine fluorescente correspondant à votre expérience 9. sélection de promoteur La sélection d&#39;un promoteur dépendra en grande partie sur le type de cellule ou phénotype d&#39;intérêt. Pour les organismes tels que B. subtilis, certains gènes rapporteurs spécifiques du type cellulaire ont été établies dans la littérature. Pour d&#39;autres souches bactériennes, en examinant microarray ou données transcription sera nécessaire de fournir des informations sur les gènes qui sont fortement régulés à la hausse dans les conditions où votre intérêt i cellulaires manifesté. Une étude récente a catalogué la transcription de B. subtilis moins de 104 différentes conditions de croissance à l&#39;aide de puces à ADN de carrelage 10. Ce document fournit des informations complètes sur les gènes sont fortement régulés à la hausse dans des conditions différentes, ce qui est inestimable pour les phénotypes moins bien caractérisés. Plutôt que de cartographier les régions promotrices précises pour chaque gène d&#39;intérêt, nous utilisons généralement tout simplement la séquence 200-500 pb en amont du gène en tant que promoteur. La longueur de la séquence exacte dépend du contexte génomique: les régions plus courtes sont utilisés lorsque cela est nécessaire pour éviter d&#39;inclure des régions codantes en amont du cadre de lecture ouvert voisin. Loci et l&#39;intégration neutre Comment maintenir la construction reporter dans votre souche bactérienne devient la dernière question de la conception d&#39;une souche de transcription rapporteur fluorescent. Chez les bactéries, les gènes d&#39;intérêt sont souvent maintenussur des plasmides à l&#39;aide de la sélection antibiotique. Cependant, il peut ne pas être possible d&#39;utiliser des antibiotiques au cours de la co-culture sans tuer les microbes environnementaux. Si plasmides sont maintenus de façon stable dans vos espèces bactériennes, il peut être possible cultiver vos bactéries contenant un journaliste porté par un plasmide en présence d&#39;antibiotiques pour préparer votre rapporteur pour le dépistage, puis éliminer les antibiotiques au cours de la co-culture elle-même dans l&#39;espoir que le plasmide être maintenue suffisamment pour permettre la fluorescence. Toutefois, si les plasmides sont facilement perdus dans votre bactérie, ou sont perdus dans des conditions de stress, ce ne sera pas une option viable. Dans de nombreux cas, la meilleure solution consiste à intégrer la construction de rapporteur sur le chromosome bactérien, ce qui permet le maintien stable du rapporteur, même en l&#39;absence de sélection. Pour l&#39;intégration de ne pas perturber l&#39;expression normale ou d&#39;un règlement de votre gène d&#39;intérêt, nous vous recommandons d&#39;intégrer dans un site ectopique sur le chromosome que can agir comme un «lieu neutre». Dans B. subtilis ces sites d&#39;intégration sont des gènes qui - lorsqu&#39;ils sont mutés - transmettre un phénotype dans certains médias minimale (permettant intégrants à être identifiés sans sélection antibiotique), mais ne modifient pas la croissance ou le taux de sporulation dans les médias riches, et inclure ces gènes que amyE, lacA, thrC, pyrD, GLTA, et Saca (transport de la capacité à utiliser l&#39;amidon, β-galactosides, la thréonine, l&#39;uracile, le glutamate et le saccharose, respectivement) 11-13. Bien que l&#39;intégration de ces gènes ont été utilisés de manière fiable pendant de nombreuses années à B. subtilis (en particulier au amyE et lacA), la même connaissance peut ne pas être disponible pour des gènes dans de nombreuses autres espèces bactériennes. L&#39;utilisation de sites de fixation du phage sont une bonne alternative pour les sites d&#39;intégration chromosomiques neutres: de nombreuses spécifiques à l&#39;espèce 14 à 16, ainsi que les sites d&#39;intégration généraux, tels que le site de fixation de Tn7 (att) ont Tn7été identifié et utilisé pour les insertions de gènes chez de nombreuses espèces bactériennes 17,18. Microbes de l&#39;environnement Nous utilisons le sol comme une source directe des microbes de l&#39;environnement pour l&#39;écran de co-culture. Le sol contient une grande diversité de microbes, et bon nombre de ces organismes sont riche source de produits naturels. En utilisant des suspensions liquides de sol placés directement sur des plaques avec notre souche rapporteur transcriptionnel fluorescente (sans isolement préalable des bactéries du sol), nous simplifions grandement l&#39;approche expérimentale. Le sol peut être utilisé soit immédiatement après la récolte, ou être congelé à -80 ° C pour une utilisation future. Utilisation immédiate a l&#39;avantage une plus grande diversité de microbes peut potentiellement être cultivé, y compris ceux qui ne survivra pas bien la congélation. Il présente l&#39;inconvénient que la concentration des organismes du sol cultivable partir de ces échantillons est inconnue, ce qui augmente le nombre de plaques d&#39;écran qui doit être utilisé. Delayed utilisation présente l&#39;avantage que les cfu / ml pour chaque source dans le sol peuvent être déterminés à l&#39;avance, ce qui permet un certain nombre de colonies optimisé pour être cultivée sur chaque plaque d&#39;écran. Cependant, elle nécessite que les organismes du sol soient capables de survivre à la congélation. Notez que la diversification de la piscine de l&#39;inducteur en cours d&#39;examen (c&#39;est à dire les sources de sol) semble être plus efficace dans l&#39;identification de nouveaux interspécifiques interactions que le dépistage en profondeur sur le même sol: une plus grande diversité phylogénétique a été observée dans les résultats identifiés dans notre écran matrice induction sources de sol supplémentaires ont été examinées plutôt que le dépistage des mêmes sources plus approfondie du sol (EA queue et R. Kolter, Harvard Medical School, résultats non publiés). Vue d&#39;ensemble L&#39;approche que nous décrivons ici est simple en termes de ses exigences techniques. Il s&#39;agit de: 1) la construction d&#39;une transcription rapporteur fluorescent dans B. subtilis ou uned&#39;autres espèces bactériennes d&#39;intérêt, 2) l&#39;identification des conditions dans lesquelles cette rapporteur n&#39;est pas activé, 3) la préparation d&#39;aliquotes de cette souche rapporteuse et les organismes à cribler (dans notre sol de cas, mais d&#39;autres sources peuvent être utilisées à la place), 4) le mélange de ceux-ci deux ensembles de microbes sur des milieux solides, 5) l&#39;identification et l&#39;isolement des organismes induisant putatif, et 6) qui confirme que ces micro-organismes ne activent en effet ce phénotype dans un écran secondaire. Une fois identifiés, ces organismes et de leurs métabolites nous fournissent des outils chimiques pour moduler le comportement des bactéries, pour étudier la physiologie bactérienne et interactions microbiennes, et d&#39;agir éventuellement en tant que nouveaux échafaudages pour des composés thérapeutiques futures.

<table><tbody><tr><td>Spectrophotomètre</td><td></td><td></td><td>Tout spectrophotomère capable de mesurer des valeurs de absorbance OD600.</td></tr><tr><td>Bouillon Luria, Lennox</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>D’autres sources de médias peuvent être nécessaires.</td></tr><tr><td>Perles de verre, 3 mm</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de chargement de gel, ronds</td><td>VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>Tiges de verre</td><td>VWR</td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope de dissection de fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>L’auteur a utilisé un stéréoscope de dissection Zeiss Stemi SV6 avec une source de lumière fluorescente EXFO X-cite 120, un cube de filtre YFP passe-long, un objectif achromat 0,63X, des oculaires 10X et un Appareil photo numérique Axio HRC HR. La plupart des tramages ont été effectués avec la monture de mise au point à 2,0-3,2X. Tout stéréoscope de dissection avec des capacités de fluorescence est acceptable, à condition que vous ayez les bons filtres pour le FP que vous utilisez. Il est préférable qu’il y ait un obturateur qui vous permet de basculer facilement entre le fond clair et la fluorescence, ainsi qu’une platine qui permet un éclairage par le haut et par le bas. Si vous souhaitez capturer des images, un appareil photo attaché est également nécessaire.</td></tr></tbody></table>

utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Dans la nature, les bactéries existent rarement dans l&#39;isolement, ils sont plutôt entourés d&#39;un large éventail d&#39;autres micro-organismes qui modifient l&#39;environnement local en sécrétant des métabolites. Ces métabolites ont le potentiel de moduler la physiologie et la différenciation de leurs voisins et microbiennes sont des facteurs susceptibles importants dans la création et le maintien de communautés microbiennes complexes. Nous avons développé un écran de co-culture à base de fluorescence pour identifier ces interactions microbiennes médiées par voie chimique. L&#39;écran consiste à combiner une souche rapporteur de transcription fluorescent avec des microbes de l&#39;environnement sur milieux solides et en permettant aux colonies de se développer en co-culture. Le rapporteur transcriptionnel fluorescent est conçu de telle sorte que la souche bactérienne choisie est fluorescent lorsqu&#39;il exprime un phénotype particulier d&#39;intérêt (à savoir la formation de biofilms, la sporulation, la production de facteurs de virulence, etc.) Le criblage est réalisée dans des conditions de croissance WHEre ce phénotype n&#39;est pas exprimé (et donc de la souche rapporteuse est typiquement non-fluorescent). Quand un microbe environnement sécrète un métabolite qui active ce phénotype, il diffuse à travers l&#39;agar-agar et active la construction de rapporteur fluorescent. Cela permet au-métabolite produisant induire microbe devant être détectée: ce sont les colonies non fluorescentes plus proximales des colonies fluorescentes. Ainsi, cet écran permet l&#39;identification des microbes de l&#39;environnement qui produisent des métabolites diffusibles qui activent une réponse physiologique particulier dans une souche de journaliste. Cette publication explique comment: a) sélectionner des conditions de dépistage de co-culture appropriées, b) préparer le journaliste et les microbes de l&#39;environnement pour le dépistage, c) effectuer l&#39;écran de co-culture, d) isoler putatif organismes induisant, et e) de confirmer leur activité dans un écran secondaire. Nous avons développé cette méthode pour dépister les organismes du sol qui activent biofilm matrice-production dans Bacillus subtilis </em&gt;, mais nous discutons aussi de considérations pour l&#39;application de cette approche à d&#39;autres bactéries génétiquement dociles.

Cet écran est utilisé pour identifier les organismes du sol sécrétant des composés qui modifient la physiologie de B. subtilis. Les résultats décrits ici sont axées sur le type de cellule-matrice produisant de B. subtilis, qui produit la protéine et des exopolysaccharides qui sont nécessaires pour la formation de biofilm robuste dans cette bactérie. Nous avons choisi le promoteur de l&#39;opéron Tapa-sipW-tasa pour notre construction rapporteur fluorescent (P Tapa-YFP). Cet...

Les bactéries produisent des composés sécrétés qui ont le potentiel d&#39;affecter la physiologie de leurs voisins microbiennes. Nous décrivons ici un écran de co-culture qui permet la détection de ces médiation chimiquement interspécifiques interactions en mélangeant les microbes du sol avec des souches rapporteurs fluorescents transcription de Bacillus subtilis sur milieu solide.

Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier les interactions entre différents microbes qui sont médiés par des composés sécrétés et qui entraînent des changements dans l’expression des gènes bactériens. Ceci est réalisé par la culture d’une souche bactérienne contenant un rapporteur transcriptionnel fluorescent avec des microbes environnementaux sous forme de colonies sur des plaques de Pétri gélosées. Les cercles orange représentent les colonies de microbes environnementaux.Alors que les cercles bleus sont des colonies du rapporteur, la croissance sur un milieu solide permet aux métabolites produits par ces colonies de se diffuser à travers la gélose et d’activer l’expression des gènes dans les colonies rapporteures voisines. Les coups potentiels indiqués ici avec des étoiles sont ces colonies qui peuvent sécréter des composés qui modifient l’expression des gènes chez le rapporteur. Ces organismes sont isolés des plaques de criblage de co-culture.Ces inducteurs potentiels sont testés à nouveau dans un criblage secondaire pour confirmer qu’il s’agissait des organismes sécrétant des molécules qui modifient l’expression des gènes bactériens chez le rapporteur. Bien q

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Speare, L., et al. Essai de coïncubation pour quantifier les interactions compétitives entre les isolats de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo présente un test de co-incubation utilisé pour étudier comment les souches bactériennes se font concurrence dans un environnement partagé. Il est largement utilisé en microbiologie pour identifier les mécanismes, tels que la destruction dépendante ou indépendante du contact, qui sont à l’origine de ces interactions.

Essai de coincubation pour l’étude des interactions compétitives entre souches bactériennes

Source : Nathoo, N., et al. Un système de co-culture hydroponique pour l’analyse simultanée et systématique des interactions moléculaires et de la signalisation plantes/microbes. J. Vis. Exp. (2017).Cette vidéo fait la démonstration d’un système de co-culture hydroponique pour étudier les interactions plantes-bactéries dans des conditions stériles. Les semis sont transférés dans un milieu de croissance stérile et acide, incubés et inspectés pour détecter toute contamination avant d’être...

Un système de co-culture pour étudier les réponses moléculaires des plantes hôtes et des bactéries en interaction

Source : Temkin, M. I. et al. Tests de co-culture à haut débit pour l’étude des interactions microbiennes. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre un test in vitro visant à étudier les interactions microbiennes entre Corynebacterium propinquum et Staphylococcus en coculture.

Un test in vitro pour étudier les interactions microbiennes en co-culture

Les bactéries peuvent accumuler des mutations néfastes ou bénéfiques au cours de leur vie. Dans une population de cellules, les individus qui ont accumulé des mutations bénéfiques peuvent rapidement surpasser leurs semblables. Ici, nous présentons une procédure simple pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes au fil du temps en utilisant des individus marqués par fluorescence.

Surveillance de la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes par cocultivation de souches marquées par fluorescence

Le système de cocultivation hydroponique décrit supporte des plantes intactes avec des écrans en mèches métalliques et les cocultive avec des bactéries. Les tissus végétaux, les bactéries et les molécules sécrétées peuvent ensuite être récoltées séparément pour des analyses en aval, permettant simultanément d'étudier les réponses moléculaires des hôtes de la plante et des microbes ou microbiomes en interaction.

Un système de co-culture hydroponique pour l&#39;analyse simultanée et systématique des interactions et signalisation moléculaire des plantes / microbes

Les bactéries encodent divers mécanismes pour s'engager dans la concurrence interbactérienne. Ici, nous présentons un protocole basé sur la culture pour caractériser les interactions concurrentielles entre les isolats bactériens et leur impact sur la structure spatiale d'une population mixte.

Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre Vibrio fischeri Isolates

Les tests d'interaction de co-culture présentés dans ce protocole sont peu coûteux, haut débit, et simple. Ces essais peuvent être utilisés pour observer les interactions microbiennes dans la co-culture, identifier les modèles d'interaction et caractériser le potentiel inhibiteur d'une souche microbienne d'intérêt contre les agents pathogènes humains et environnementaux.

Tests de co-culture à haut débit pour l'étude des interactions microbiennes

Ce protocole d’imagerie cellulaire bactérienne vivante permet de visualiser les interactions entre plusieurs espèces bactériennes au niveau unicellulaire au fil du temps. L’imagerie par time-lapse permet d’observer chaque espèce bactérienne en monoculture ou en coculture afin d’interroger les interactions inter-espèces dans les communautés bactériennes multi-espèces, y compris la motilité cellulaire individuelle et la viabilité.

Visualisation cinétique des interactions bactériennes interspécifiqueuses unicellulaires

Nous décrivons une approche pour détecter et capturer des sous-populations cellulaires invasives en temps réel. La conception expérimentale utilise l’analyse cellulaire en temps réel en surveillant les changements dans l’impédance électrique des cellules. Le cancer invasif, les cellules immunitaires, endothéliales ou stromales dans les tissus complexes peuvent être capturés et l’impact des co-cultures peut être évalué.

Détection et capture en temps réel de sous-populations cellulaires invasives provenant de co-cultures

Ce protocole fournit une ligne directrice complète pour la mise en place et le suivi quantitatif des co-cultures, y compris les cyanobactéries photoautotrophes sécrétant du sucre et les levures hétérotrophes.

Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

Découvrez la co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique chez Bacillus subtilis. Cette méthode utilise des souches rapporteuses fluorescentes pour visualiser les changements d'expression génique.

Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

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