Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier les interactions entre différents microbes qui sont médiés par des composés sécrétés et qui entraînent des changements dans l’expression des gènes bactériens. Ceci est réalisé par la culture d’une souche bactérienne contenant un rapporteur transcriptionnel fluorescent avec des microbes environnementaux sous forme de colonies sur des plaques de Pétri gélosées. Les cercles orange représentent les colonies de microbes environnementaux.

Alors que les cercles bleus sont des colonies du rapporteur, la croissance sur un milieu solide permet aux métabolites produits par ces colonies de se diffuser à travers la gélose et d’activer l’expression des gènes dans les colonies rapporteures voisines. Les coups potentiels indiqués ici avec des étoiles sont ces colonies qui peuvent sécréter des composés qui modifient l’expression des gènes chez le rapporteur. Ces organismes sont isolés des plaques de criblage de co-culture.

Ces inducteurs potentiels sont testés à nouveau dans un criblage secondaire pour confirmer qu’il s’agissait des organismes sécrétant des molécules qui modifient l’expression des gènes bactériens chez le rapporteur. Bien que cette méthode donne un aperçu des interactions formant le biofilm des bacilles subtils avec les organismes du sol, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les interactions microbiennes qui affectent l’expression de la virulence chez les espèces de staphylocoques ou de pseudomones. En effet, il peut théoriquement être appliqué pour identifier les interactions microbiennes qui modifient l’expression génique de tout rapporteur dans n’importe quel microbe génétiquement traitable Après avoir généré des constructions rapporteures fluorescentes pour l’organisme de votre choix, selon le protocole de texte, collectez le sol en retirant les 0,5 centimètre supérieurs du sol de surface exposé avant d’utiliser une spatule pour collecter le sol et les tubes coniques, Ajoutez 0,85 % de solution saline stérile dans un rapport de 10 millilitres par gramme de sol pour faire une boue de sol et agitez-la pendant une minute pour déloger les bactéries des particules de sol.

Après avoir laissé la boue de sol se déposer pendant une minute, transférez la couche aqueuse supérieure dans un tube frais, diluez le rapporteur et les échantillons de sol selon le protocole textuel et placez 50 microlitres de chacun au centre des plaques de criblage de co-culture dans des conditions qui n’activeront pas la construction du rapporteur seule. Appliquez également un échantillon de sol seul et un rapporteur seul comme témoins. Ajoutez environ 23 millimètres de billes de verre stériles sur chaque plaque et étalez les cellules en maintenant les plaques sur le dessus de la paillasse et en les secouant d’avant en arrière.

Tout en tournant jusqu’à ce que le liquide soit absorbé, retournez les plaques et jetez les billes dans un bécher à déchets contenant de l’éthanol. Après avoir incubé les plaques de co-culture à l’aide de la fluorescence et en commençant par le haut de la plaque, déplacez lentement la plaque d’avant en arrière dans le champ de vision jusqu’aux points lumineux. Après un balayage complet, tournez la plaque de 90 degrés et répétez le processus.

Lorsqu’un point fluorescent est détecté, allumez lentement l’éclairage en fond clair et déterminez si la fluorescence est associée à une colonie bactérienne. Isoler les organismes inducteurs présumés, qui seront les colonies non fluorescentes à proximité des colonies fluorescentes. Positionnez-les au centre du champ de vision et accessibles par votre main dominante, en laissant la lampe fluorescente allumée.

Allumez lentement Brightfield pour identifier par forme et positionner la colonie fluorescente et les organismes inducteurs environnants À l’aide d’une tige de verre, prenez une pointe de chargement de gel ronde stérile de 200 microlitres et tenez-la comme un crayon. Posez votre paume extérieure contre la platine pour la stabiliser sur le plan de travail. Placez ensuite votre autre main sur le côté intérieur du pouce de votre main pour stabiliser l’outil de cueillette, en maintenant la pointe de la pipette au-dessus de la surface de la plaque.

Déplacez-le dans le champ de vision et centrez-le au-dessus de la colonie que vous souhaitez choisir. Le conseil sera hors de portée. À l’aide du bord extérieur de votre main, faites pivoter lentement la pointe de la pipette vers la colonie à prélever.

Touchez-le très légèrement en essayant de minimiser le nombre d’autres colonies avec lesquelles la pointe entre en contact sans tourner l’outil de cueillette. Passez la pointe sur une section d’une assiette fraîche. Après avoir cueilli les colonies, incuber les plaques selon les directives de dosage.

Lorsque les colonies sont visibles, utilisez un stéréoscope pour déterminer si un ou plusieurs types d’organismes se développent sur la plaque de repère Chaque type de morpho sur une plaque fraîche et incubez jusqu’à ce qu’il grandisse. Pour vérifier si les inducteurs présumés sont de véritables inducteurs, préparez des pelouses de souches parentales rapporteures et non fluorescentes. Une fois les plaques sèches, utilisez des cure-dents stériles pour prélever des cellules dans les colonies d’essai.

Patchez sur une assiette vierge, puis sur les deux plaques de pelouse. Alternativement, réisolez, suspendez les organismes inducteurs présumés dans un millilitre de milieu liquide dans un vétérinaire en plastique stérile, et mesurez la DO 600 des suspensions après avoir normalisé la DO de chaque suspension pour arriver à une DO 600 de 0,5 point, un microlitre de chaque suspension sur chacune des trois plaques. Enfin, après avoir laissé les organismes se développer, utilisez la fluorescence sous un microscope à dissection pour identifier les organismes inducteurs présumés qui activent la souche rapporteure fluorescente, mais pas la souche témoin parentale.

L’écran a été utilisé pour identifier les organismes du sol sécrétant des composés qui modifient l’expression génique d’un composant structurel de la matrice du biofilm en subtiles b à l’aide d’un rapporteur transcriptionnel fluorescent. Idéalement, chaque plaque de coculture devrait contenir un rapport de un pour un entre les colonies rapporteures et les colonies de sol qui sont des colonies individuelles rapprochées. Ici, nous illustrons comment le fait d’avoir un rapport élevé de colonies rapporteures représentées par des cercles bleus par rapport aux colonies de sol représentées par des cercles bruns augmente la confiance dans la localisation de l’organisme inducteur réel à partir des plaques de co-culture.

Les organismes du sol inducteurs sécrètent des composés qui activent le rapporteur. Plusieurs colonies rapporteures seront induites sur la plaque, le rapport rapporteur/sol le plus élevé facilitant l’identification des vrais inducteurs indiqués en rouge par rapport aux autres inducteurs présumés indiqués par des étoiles. La teneur en éléments nutritifs contrôle l’étendue de la formation des colonies de croissance, tandis que la dilution de l’inoculum détermine si les colonies résultantes sont correctement dispersées.

Comme on le voit dans cette co-culture, l’image B produit subtilement une matrice de biofilm fluorescent en réponse à de nombreux microbes du sol. Pour les sols que nous avons examinés, nous avons eu un taux de réussite élevé pour le rapporteur matriciel YFP Ptap A. Cela contraste avec nos résultats non publiés provenant de criblures analogues.

En utilisant la sporulation et la compétence, les journalistes étaient peu ou pas de résultats ont été identifiés. Ainsi, les taux IH pour différents types de cellules sont très variables et peuvent être difficiles à prévoir à l’avance. Voici deux exemples de plaques de criblage de co-culture avant et après que les colonies inductrices potentielles ont été sélectionnées pour l’isolement.

Les résultats négatifs et positifs de la méthode du patch et du spot sont présentés ici, environ 50 % des colonies examinées dans notre dépistage secondaire étant de vrais positifs. Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être mises en œuvre pour répondre à des questions supplémentaires, par exemple le séquençage de l’ADN 16 s SR pour déterminer l’identité phylogénétique de l’organisme inducteur, ou l’utilisation de la spectrométrie de masse HPLC en RMN pour déterminer l’identité chimique du composé actif.