Une plate-forme à base de FRET haut-débit compatible pour l'identification et la caractérisation de la chaîne neurotoxine botulique de lumière modulateurs

L’objectif global de cette procédure est de dépister de petites molécules pour la neurotoxine botulique, une inhibition des chaînes légères. Ceci est accompli en préparant d’abord des séries de dilution de composés avec une précision et une exactitude élevées. La deuxième étape consiste à transférer les dilutions du composé dans une plaque noire à 96 puits.

Ensuite, l’enzyme à chaînes légères diluée est ajoutée à la plaque et l’enzyme est incubée avec le composé pendant cinq minutes à température ambiante. La dernière étape consiste à ajouter le substrat de frette de la chaîne légère pour initier la réaction, qui est surveillée par un lecteur de plaque de fluorescence. En fin de compte, des cribles secondaires qui utilisent un substrat peptidique non fluorescent doivent être utilisés pour confirmer l’activité du composé et déterminer des constantes cinétiques plus rigoureuses telles que la constante de dissociation de l’inhibiteur ou ki.

Le principal avantage de ce test par rapport aux méthodes existantes telles que les méthodes basées sur l’HPLC ou les méthodes basées sur les cellules, est qu’il est simple à réaliser, facilement automatisé et peut être utilisé pour comparer la puissance relative d’un certain nombre de composés. Les individus peuvent avoir des difficultés lorsqu’ils ne connaissent pas cette méthode lors de la préparation d’une série de dilutions de composés et du mélange correct de la plaque une fois que tous les composants sont ajoutés. Commencez cette procédure en préparant les tampons et les réactifs comme décrit dans le protocole texte.

Configurez le lecteur de plaques pour qu’il secoue la plaque à vitesse moyenne pendant 10 secondes, puis pour surveiller la fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 490 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 523 nanomètres toutes les cinq minutes en mode cinétique pendant une heure 30 minutes à température ambiante. Après avoir déterminé la plage de concentration du composé, étiquetez les tubes avec le nom et la concentration appropriés du composé, Eloqua, 100 % d’oxyde de diméthylsulf ou DMSO sur tous les tubes pour les préparer à la dilution des céréales composées. Ensuite, préparez la dilution en série des composés pour la série de dilution standard de un à trois.

Ajoutez deux microlitres de composé non dilué à quatre microlitres de DMSO dans le premier tube de la série de dilution, et mélangez bien avec une nouvelle pointe de pipette. Retirez deux microlitres de la première dilution et ajoutez-les à quatre microlitres de DMSO dans le deuxième mélange de tubes. Bien répéter l’opération pour les dilutions restantes.

Assurez-vous de bien mélanger les dilutions du composé pour vous assurer que les concentrations du composé sont exactes. Couvrez les tubes composés et mettez-les de côté À température ambiante, obtenez une plaque à fond plat, opaque et noire à 96 puits. En utilisant la configuration de plaque recommandée qui se trouve dans le protocole texte.

Distribuez manuellement un microlitre de la dilution du composé respectif directement au fond de chaque puits correspondant pour les puits un à neuf, distribuez un microlitre de la concentration la plus élevée de composé à tester au puits.11. Pour servir de composé de contrôle de fluorescence intrinsèque. Ce contrôle consiste à déterminer si les composés eux-mêmes sont fluorescents et/ou affectent l’hydrolyse du substrat.

Distribuer manuellement un microlitre d’un inhibiteur puissant connu dans le puits, 12 en tant que contrôle positif et un microlitre de 100 % de DMSO dans le puits. 10 en tant que contrôle négatif avec une distribution automatisée par pipette. 79 microlitres de tampon de dosage sur le côté des puits, un à 10 et 12 et 89 microlitres sur le côté du puits,

11.Assurez-vous de ne pas toucher la pointe au fond du puits où le composé est présent pour éviter la contamination croisée des puits. Vortex, l’enzyme à chaînes légères diluée, et utilisez une pipette automatisée pour ajouter 10 microlitres de l’enzyme sur le côté de chaque puits, à l’exception du puits 11. Tapotez doucement la plaque pour vous assurer que le volume total d’enzyme ajoutée va au fond du puits, mélangez doucement, couvrez et incubez la plaque pendant cinq minutes à température ambiante.

Cette incubation fournit une étape de pré-équilibre pour que les composés se lient à la chaîne légère. Avant l’ajout du substrat, vortex doucement la neurotoxine botulique dans un substrat de chaîne légère. Ensuite, à l’aide d’une pipette automatisée, ajoutez 10 microlitres de substrat sur le côté de chacun.

Assurez-vous d’ajouter le substrat sur le côté du puits opposé à l’endroit où l’enzyme a été ajoutée plus tôt. Tapotez doucement la plaque pour mélanger immédiatement les réactifs. Placez la plaque dans un lecteur de plaques de microtitration à fluorescence et commencez le programme précédemment configuré.

Une fois le programme terminé, calculez les vitesses enzymatiques en représentant graphiquement l’unité de fluorescence relative en fonction du temps et en calculant la pente de la ligne pendant la période linéaire de la réaction. Se préparer au fonctionnement automatisé pour le criblage à haut débit comme décrit dans le protocole de texte, La démonstration d’une partie du protocole de criblage à haut débit sera de jeune post-doctorant dans mon laboratoire. Il montrera comment les composés sont transférés dans des plaques pour un criblage à haut débit à l’aide d’un équipement d’automatisation de laboratoire après avoir distribué de la neurotoxine botulique diluée, une enzyme à chaîne légère, dans la plaque de dosage.

Attribuez des zones sur la plate-forme de manipulation des liquides pour les plaques composées, les plaques de test et les conteneurs contenant des solutions de nettoyage. Programmez le manipulateur de liquides pour qu’il place les plaques composées et les plaques de dosage dans les positions désignées et retire les couvercles des plaques avant l’emboutissage. Calibrez le logiciel du programme d’estampage et assurez-vous que les goupilles d’estampage sont immergées mais ne rayent pas le bas de la plaque d’essai.

Tamponnez 50 nanolitres du composé directement dans la plaque de dosage contenant huit microlitres de neurotoxine botulique. Une chaîne légère. Nettoyez les broches après chaque plaque en les trempant dans du DMSO, puis en les séchant sur du papier buvard et en répétant ce processus avec de l’isopropanol et du méthanol.

Enfin, séchez les broches sur le ventilateur après que les composés aient été estampillés dans les plaques de dosage avec de l’enzyme. Séparément, empilez les plaques de composé de base et les plaques de dosage recouvrent la plaque de dosage supérieure de la pile pour éviter l’évaporation et mettez-les de côté. Assurez-vous d’incuber la chaîne légère avec des composés pendant au moins cinq minutes à température ambiante.

Des temps d’incubation plus longs peuvent être utilisés lors de l’estampage d’un grand nombre de plaques. Enfin, versez le substrat dans les plaques de test et mesurez la fluorescence comme décrit dans le protocole de texte. Qu’il s’agisse d’effectuer le test de neurotoxine botulique à faible débit ou à haut débit, une augmentation de la fluorescence doit être observée au fil du temps lorsque la neurotoxine botulique, une chaîne légère, est incubée avec le substrat.

Si des dilutions en série d’un composé sont testées, on obtient souvent une série de lignes avec des pentes variables. Ici. La concentration finale d’un composé à base d’hydroxyate est indiquée en unités micromolaires. Eh bien, 10 dans la disposition de la plaque décrite ici sert de contrôle négatif lorsque seul le véhicule est ajouté.

Le taux de cette réaction est défini comme une activité enzymatique de 100 % et les taux en présence du composé peuvent être normalisés à ce taux pour obtenir le taux relatif ou le pourcentage d’inhibition. Lorsque le dosage est effectué avec des dilutions en série d’un composé, un graphique de la vitesse de la réaction en fonction de la concentration de l’inhibiteur peut être utilisé pour déterminer la concentration inhibitrice demi-maximale ou CI 50. La plage de dilution doit être choisie de manière à ce que le tracé apparaisse en forme de sigmoïde pour un ajustement optimal de la courbe.

La valeur CI 50 est une mesure relative de la puissance mieux décrite comme une valeur KI apparente, car elle dépend de la concentration de l’enzyme présente dans le dosage. Cette valeur peut ensuite être utilisée pour comparer et classer la puissance de plusieurs composés s’ils sont testés. En parallèle, un bon mélange de la plaque après l’ajout de chaque composant est crucial pour obtenir une augmentation linéaire régulière de la fluorescence au fil du temps, ce qui est nécessaire pour déterminer avec précision les vitesses initiales.

Ce graphique montre une expérience représentative où il n’y avait pas suffisamment de mélange et où le taux de formation du produit n’est pas linéaire dans le temps. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures pour un maximum de huit composés. Après cette expérience, d’autres tests peuvent être effectués avec des substrats peptidiques non fluorescents pour confirmer que les composés inhibent la neurotoxine botulique, les chaînes légères et l’activité somatique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la puissance relative des inhibiteurs de la chaîne légère de la neurotoxine botulique. Le protocole s’est déroulé en trois étapes. Tout d’abord, la préparation d’une série de dilutions composées.

Deuxièmement, l’ajout d’une enzyme de chaîne légère recombinante, et troisièmement, l’ajout d’un substrat fluorescent et la mesure ultérieure sur un lecteur de plaque fluorescente.