Name: Une plate-forme à base de FRET haut-débit compatible pour lidentification et la caractérisation de la chaîne neurotoxine botulique de lumière modulateurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Découvrez un criblage haut-débit basé sur FRET pour identifier des inhibiteurs de la chaîne légère de la neurotoxine botulique BoNT/A. Cette méthode permet d'évaluer rapidement l'activité enzymatique et la puissance des composés.

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Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (AI082190 à T.J.D.) et du California Institute for Regenerative Medicine (TB1-01186 et CL1-00502).

Dépistage manuel ou détermination IC50
Ce protocole peut être utilisé pour déterminer la puissance relative d’un composé (valeur IC50) en préparant une série de dilutions du composé, ou pour rechercher manuellement des inhibiteurs à petites molécules à une concentration unique.
1. Préparation des tampons, des réactifs et de l’instrumentation requise
<ol>
	<li>Préparez 50 ml de tampon de dosage (40 mM HEPES, pH 7,4 et 0,01 % Tween-20) et filtrez la stérilisation. Le tampon peut être stocké à température ambiante (RT) pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Préparer une dilution de travail de 70 nM de neurotoxine botulique recombinante/chaîne légère A (LC/A (1-425))17 dans un tampon de dosage, agiter doucement et stocker sur de la glace. L’essai de chaque composé nécessite au moins 120 μl de dilution de travail LC/A.</li>
	<li>Préparer une dilution de travail du substrat BoNT/A LC à base de FRET de 7 μM dans un tampon de dosage contenant 10 % de DMSO. Diluez d’abord une solution mère de 5 mM du substrat dans un volume approprié de 100 % de DMSO, puis ajoutez lentement (goutte à goutte) le tampon de dosage tout en mélangeant doucement. Envelopper dans du papier d’aluminium et conserver sur de la glace. L’essai de chaque composé nécessite au moins 130 μl de dilution de travail du substrat.</li>
	<li>Configurez un lecteur de plaque de microtitration de fluorescence pour agiter la plaque à vitesse moyenne pendant 10 secondes, puis surveillez la fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 490 nm et 523 nm, respectivement, toutes les 5 minutes (mode cinétique) pendant 90 minutes à RT. Notez que la formation du produit (c’est-à-dire l’augmentation de la fluorescence) est linéaire tout au long de cette période de temps (Figure 1A).</li>
</ol>
2. Préparation des séries de dilution de composés
<ol>
	<li>Déterminer la plage de concentration du composé (c’est-à-dire le nombre de dilutions dans la série de dilutions et le facteur de dilution) ; la plage de concentration est choisie en fonction de la valeur IC50 attendue pour assurer un ajustement optimal de la courbe. Pour les composés dont la CI50 est inconnue, utilisez une matrice de composés non diluée comme concentration de composé la plus élevée.</li>
	<li>Étiquetez les tubes avec le nom et la concentration appropriés du composé.</li>
	<li>Aliquote 100 % DMSO sur tous les tubes pour les préparer à la dilution en série du composé. Un volume de dilution final d’au moins 2 μl est recommandé, où 1 μl de chaque concentration est utilisé par puits dans la plaque d’essai. Par exemple, une série de dilution standard 1:3 nécessite de mélanger 2 μl de composé avec 4 μl de DMSO par tube.</li>
	<li>Préparez des dilutions en série de composés et de vortex ou mélangez soigneusement manuellement entre chaque dilution ; changez les pointes de pipette entre chaque dilution. Pour la série de dilution standard 1:3, ajoutez 2 μl du composé non dilué à 4 μl de DMSO dans le premier tube de la série de dilution et mélangez bien. À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, prélever 2 μl de la première dilution et ajouter à 4 μl de DMSO dans le deuxième tube ; Bien mélanger. Répétez l’opération pour les dilutions restantes. Assurez-vous de bien mélanger les dilutions du composé pour vous assurer que les concentrations du composé sont exactes.</li>
	<li>Couvrez les tubes composés et mettez-les de côté à RT.</li>
</ol>
3. Préparation et repérage des plaques (Tableau 1)
<ol>
	<li>Obtenez une plaque noire à fond plat, opaque et de 96 puits. Voir la configuration recommandée des plaques dans le tableau 1, où chaque série de dilution de composé est formatée en rangées d’une plaque à 96 puits. Versez manuellement 1 μl de la dilution du composé concerné directement au fond de chaque puits correspondant (puits 1 à 9). Distribuer 1 μl de la concentration la plus élevée de composé à tester au puits 11 (contrôle de fluorescence intrinsèque du composé).</li>
	<li>Distribuez manuellement 1 μl d’un inhibiteur puissant connu dans le puits 12 (contrôle positif) et 1 μl de DMSO à 100 % dans le puits 10 (contrôle négatif).</li>
	<li>À l’aide d’un pipeteur automatisé, distribuez 79 μl de tampon de dosage sur le côté des puits 1-10 et 12 (dilutions du composé et contrôle positif), et 89 μl sur le côté du puits 11 (contrôle de fluorescence intrinsèque du composé). Assurez-vous de ne pas toucher l’extrémité au fond du puits où le composé est présent afin de ne pas contaminer les puits. </li>
	<li>Vortex la dilution de travail LC/A et utiliser une pipette automatisée pour ajouter 10 μl sur le côté de chaque puits, à l’exception du puits 11 (contrôle de fluorescence intrinsèque du composé). Tapotez doucement la plaque pour vous assurer que toute l’enzyme ajoutée va au fond du puits.</li>
	<li>Mélangez délicatement, couvrez et incubez la plaque pendant 5 min à RT. Cette incubation fournit une étape de pré-équilibre pour que les composés se lient à la LC/A avant l’ajout du substrat.</li>
</ol>
4. Ajout de substrat et mesure de fluorescence
<ol>
	<li>Manipulez doucement le substrat BoNT/A LC et, à l’aide d’une pipette automatisée, ajoutez 10 μl de substrat de l’autre côté de chaque puits. Assurez-vous d’ajouter le substrat du côté du puits opposé à l’endroit où l’enzyme a été ajoutée plus tôt.</li>
	<li>Tapotez doucement la plaque pour mélanger les réactifs, placez-la immédiatement dans le lecteur de plaques et commencez la mesure de fluorescence avec les paramètres précédemment spécifiés à l’étape 1.4.</li>
	<li>Les vitesses enzymatiques sont calculées à partir de la pente de la ligne générée en représentant graphiquement l’unité de fluorescence relative (RFU) en fonction du temps pendant la période linéaire de la réaction.</li>
</ol>
Table 1.Disposition suggérée de la plaque d’essai.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Eh bien #</th>
			<th>Description du puits</th>
			<th>composé</th>
			<th>Tampon d’essai</th>
			<th>substrat</th>
			<th>Lc</th>
			<th>Dmso</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Dose composée 1</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl </td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deux</td>
			<td>Dose composée 2</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Dose composée 3</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Dose composée 4</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Dose composée 5</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Dose composée 6</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Dose composée 7</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>Dose composée 8</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Dose composée 9</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Contrôle négatif 
			(100 % d’activité LC)</td>
			<td>---</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Contrôle de fluorescence intrinsèque du composé</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>89 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Contrôle positif 
			(0 % d’activité LC)</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Fonctionnement automatisé pour le criblage à haut débit
5. Préparation des tampons, des réactifs, des plaques composées, des codes-barres et de l’instrumentation requise
<ol>
	<li>Décongelez les plaques de composé scellées à température ambiante pendant au moins 1 heure.</li>
	<li>Préparez 500 ml (ou plus, selon le nombre de composés à dépister) du tampon de dosage (40 mM HEPES, pH 7,4 et 0,01 % Tween-20) et filtrez la stérilisation. Le tampon de test filtré peut être stocké chez RT pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Préparer une dilution de travail de 8,75 nM de BoNT/A LC recombinant (1-425) dans un tampon de dosage, un vortex et un stockage sur glace. Chaque puits dans une plaque de faible volume de 384 puits nécessite 8 μl. Préparez un excédent de 10 à 15 %, soit environ 3,7 ml ou chaque plaque de faible volume de 384 puits.</li>
	<li>Préparez une dilution de travail du substrat BoNT/A LC à base de FRET de 3,5 μM dans un tampon de dosage contenant 10 % de DMSO. Diluez d’abord la solution mère de 5 mM du substrat directement dans le volume approprié de 100 % de DMSO, puis ajoutez lentement (goutte à goutte) le tampon de dosage tout en mélangeant doucement. Envelopper dans du papier d’aluminium et conserver sur de la glace. Chaque puits dans une plaque de faible volume de 384 puits nécessite 2 μl. Préparez un excédent de 10 à 15 %, soit environ 1 ml pour chaque plaque de faible volume de 384 puits.</li>
	<li>Préparez des codes-barres pour chaque plaque de microtitration noire à faible volume de 384 puits et collez l’étiquette directement sur le côté de la plaque où le lecteur de codes-barres peut la lire ; assurez-vous que l’étiquette ne dépasse pas du côté de la plaque, sinon elle pourrait interférer avec la manipulation et l’empilement des plaques. Empilez les assiettes par ordre numérique et mettez-les de côté. Couvrez la plaque supérieure. Notez que cette étape est facultative, mais qu’elle facilite le suivi des résultats par rapport aux composés correspondants lorsque plusieurs plaques sont utilisées.</li>
	<li>Centrifugez les plaques de pâte décongelées et scellées à 200 x g pendant 30 secondes à RT. Retirez soigneusement le joint de la plaque, assurez-vous d’enlever tout adhésif restant et couvrez la plaque avec un couvercle en plastique propre pour éviter l’évaporation. Notez que si un adhésif est présent sur la surface de la plaque, il peut interférer avec le transfert automatisé du couvercle et l’empilage des plaques. Placez la plaque couverte dans un hôtel attaché au manipulateur de liquide. Ne gardez pas les plaques à découvert ou une évaporation se produirait.</li>
	<li>Configurez un lecteur de plaques de microtitration à fluorescence empilée pour lire la fluorescence de chaque plaque de test à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 490 nm et 523 nm, respectivement, toutes les 30 minutes (mode cinétique) pendant 3 à 6 cycles à RT.</li>
</ol>
6. Préparation de l’outil à goupille
<ol>
	<li>Inspectez visuellement l’outil à goupille à tête 384 pour détecter toute anomalie, y compris le gauchissement, l’éclatement ou les gros débris.</li>
	<li>Remplissez trois plateaux séparés avec environ 1 pouce de méthanol à 100 % (grade HPLC), de 100 % d’isopropanol (grade HPLC) et de solution de nettoyage d’outil à goupille diluée dans de l’eau ultrapure.</li>
	<li>Remplissez la station de nettoyage sur un manipulateur de liquide avec 100 % de DMSO.</li>
	<li>Empilez 2 à 3 morceaux de papier buvard propre et neuf dans un plateau. Il est important de calibrer le robot dans l’axe z de manière à ce que les broches entrent en contact avec, mais ne perforent pas, le papier buvard.</li>
	<li>Fixez un ventilateur à la zone de travail pour sécher les broches après le lavage.</li>
	<li>Fixez l’outil à goupille au bras robotique du manipulateur de liquide et pré-nettoyez les broches en les trempant dans du DMSO, en les séchant sur du papier buvard, en les faisant tremper pendant 2 minutes dans une solution de nettoyage, en les plongeant sur du papier buvard, en les trempant dans de l’isopropanol, en les séchant sur du papier buvard, en les trempant dans du méthanol, en les séchant sur du papier buvard et enfin en les séchant sur le ventilateur.</li>
</ol>
7. Préparation du distributeur de liquide à faible volume
<ol>
	<li>Fixez une cassette de faible volume (1-10 μl) au distributeur de liquide et connectez une conduite de déchets à un récipient approprié.</li>
	<li>Inspectez visuellement les buses de distribution de la cassette et vérifiez qu’elles ne sont pas déformées, déchirées ou bloquées. Il est important de garder les canaux et les buses propres, car les précipitations ou les débris influenceront la distribution du liquide.</li>
	<li>Amorcez les canaux en faisant couler 30 ml d’eau ultrapure, 30 ml d’éthanol à 70 %, puis 30 ml d’eau ultrapure directement dans le récipient à déchets.</li>
	<li>Placez une plaque de dosage à faible volume de 384 puits dans le distributeur de liquide et ajoutez un volume connu d’eau dans chaque puits. Inspectez visuellement pour vous assurer que chaque puits reçoit le bon volume et qu’il n’y a pas de déversement ou de solution distribuée entre les puits.</li>
	<li>Amorcez les tubes avec de l’air pendant environ 5 secondes pour éliminer l’eau et sécher les canaux.</li>
</ol>
8. Distribution de la chaîne légère BoNT/A dans la plaque de dosage
<ol>
	<li>Immergez la conduite d’admission du distributeur de liquide dans une solution de travail BoNT/A LC, amorcez pour éliminer tout air et distribuez 8 μl dans chaque puits d’une plaque de test à faible volume de 384 puits. Notez que les plaques peuvent être positionnées manuellement sur la zone de travail du manipulateur de liquides, ou automatiquement positionnées et réempilées à l’aide d’un hôtel à plaques attaché.</li>
	<li>Couvrez chaque assiette avec un couvercle en plastique propre et empilez-la dans une colonne différente de l’hôtel à assiettes attachée au manipulateur de liquides. Ne gardez pas les plaques descellées ou l’évaporation se produira.</li>
	<li>Nettoyez le distributeur de liquide en faisant couler 30 ml d’eau ultrapure, 30 ml d’éthanol à 70 %, 30 ml d’eau ultrapure directement dans le récipient à déchets.</li>
	<li>Amorcez les tubes avec de l’air pendant environ 5 secondes pour sécher les canaux.</li>
</ol>
9. Estampage des composés dans la plaque de dosage
<ol>
	<li>Attribuez des zones sur la plate-forme de manipulation de liquides pour les plaques composées, les plaques de dosage et les conteneurs contenant des solutions de nettoyage.</li>
	<li>Programmez le manipulateur de liquides pour qu’il place les plaques composées et les plaques de dosage dans les positions désignées et retire les couvercles des plaques avant l’emboutissage.</li>
	<li>Tamponnez 50 nl du composé directement dans la plaque de dosage contenant 8 μl de BoNT/A LC. Lors de l’étalonnage du programme d’emboutissage, assurez-vous que les broches sont immergées, mais ne rayez pas le bas de la plaque de dosage. Notez que l’ajout de composés dans 100 % DMSO peut créer une zone locale de dénaturation enzymatique lors de sa dispersion. Il faut donc prendre soin d’évaluer le niveau de dénaturation enzymatique en comparant le témoin DMSO seul au témoin non traité (c’est-à-dire l’enzyme sans ajout de DMSO).</li>
	<li>Nettoyez les broches après chaque plaque en les trempant dans du DMSO, en les séchant sur du papier buvard, en les trempant dans de l’isopropanol, en les séchant sur du papier buvard, en les trempant dans du méthanol, en les séchant sur du papier buvard et enfin en les séchant sur le ventilateur.</li>
	<li>Une fois que les composés ont été estampillés dans la plaque de dosage avec une enzyme, empilez séparément les plaques de composés de base et les plaques de dosage. Couvrez la plaque de dosage supérieure dans la pile pour éviter l’évaporation et mettez-la de côté. Assurez-vous d’incuber le LC avec des composés pendant au moins 5 min à RT ; Des temps d’incubation plus longs peuvent être utilisés lors de l’estampillage d’un grand nombre de plaques.</li>
</ol>
10. Distribution du substrat dans la plaque de dosage
<ol>
	<li>Immergez la conduite d’admission du manipulateur de liquides dans la solution de travail du substrat BoNT/A LC et protégez-la de la lumière. Vérifiez les buses de distribution pour vous assurer qu’elles sont sèches et qu’elles ne sont pas obstruées. Amorcez les canaux pour éliminer toutes les bulles d’air.</li>
	<li>Désempilez les plaques de dosage et distribuez 2 μl de dilution de travail du substrat dans chaque puits. Vérifiez que le substrat est distribué directement dans chaque puits. Empilez les plaques et placez une plaque de dosage vide sur la première plaque et une plaque vide sous la plaque inférieure de la pile pour éviter l’évaporation pendant la lecture et le réempilage dans le lecteur de plaques.</li>
</ol>
11. Mesures de fluorescence
<ol>
	<li>Chargez immédiatement la pile de plaques de test dans un lecteur de plaques de fluorescence.</li>
	<li>Commencez la mesure de fluorescence avec les paramètres précédemment spécifiés à l’étape 5.7. Le taux de dosage de chaque composé est calculé à partir d’un graphique de l’unité de fluorescence relative (RFU) au fil du temps. Notez qu’il est important d’inclure un témoin négatif (DMSO) pour obtenir un taux non inhibé ; Un témoin positif avec un inhibiteur connu peut également être ajouté à chaque plaque. La figure 2 montre un résultat représentatif d’un seul point temporel.</li>
</ol>
12. Nettoyage
<ol>
	<li>Scellez chaque plaque de crosse composée avec un scellage en aluminium à l’aide d’un rouleau et stockez-la à -80 °C.</li>
	<li>Après la lecture de chaque plaque d’essai, jeter les plaques, les éventuelles dilutions LC/A ou de substrat restantes dans les déchets biologiques.</li>
</ol>

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<li>Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+botulinum+neurotoxin+type+A+light+chain+contributes+to+solubility%2C+catalysis%2C+and+stability.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability.</a> Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+discovery+of+potent+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+A%3A+development+of+a+robust+LC+MS+based+assay+operational+from+low+to+subnanomolar+enzyme+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations.</a> Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).</li>
<li>Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+proteins+as+enhanced+FRET-based+substrates+for+botulinum+neurotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity.</a> Toxicon. 53, 392-399 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le dosage de la BoNT/A LC basé sur FRET décrit ici représente une méthode intéressante pour identifier et caractériser les petites molécules qui modulent l’activité de la BoNT/A LC. La nature axée sur la solution de l’essai rend ce protocole susceptible d’être soumis au criblage à haut débit décrit dans la section Fonctionnement automatisé du texte du protocole. Le facteur Z est souvent utilisé pour déterminer l’adéquation d’un test pour les campagnes HTS18. Déterminé comme Z = 1 – 3 (σp + σn</...

La neurotoxine botulique A (BoNT/A), la toxine la plus puissante actuellement connue (DL50 ~1 ng/kg)1, est une neurotoxine puissante produite par la bactérie Clostridium botulinum. Au sein d’un hôte affecté, la BoNT/A perturbe la neurotransmission à la jonction neuromusculaire en liant les motoneurones, en s’internalisant dans le cytosol et, finalement, en clivant les protéines neuronales essentielles à l’exocytose de l’acétylcholine. Une fois à l’intérieur d’un neurone, la BoNT/A peut persister jusqu’à plusieurs mois2. L’inhibition à long terme de la libération d’acétylcholine entrave la contraction musculaire normale et entraîne une paralysie flasque qui, dans les cas graves, peut entraîner une insuffisance cardiaque et/ou respiratoire. En raison de sa puissance extrême, de sa facilité de production et de ses effets à long terme sur l’hôte, le CDC a étiqueté tous les sérotypes BoNT comme des agents bioterroristes à haut risque.
Le mécanisme d’action de la toxine implique de nombreuses étapes, notamment la liaison aux récepteurs de surface neuronaux, l’absorption cellulaire via l’endocytose médiée par le récepteur et la translocation dans le cytosol du neurone. La BoNT/A est composée de deux chaînes, une chaîne lourde et une chaîne légère, et les deux chaînes sont nécessaires pour la toxicité. La chaîne lourde (HC) contient des domaines de liaison et de translocation, tandis que la chaîne légère (LC) est une métalloprotéase dépendante du zinc qui se déplace de l’endosome vers le cytoplasme. Une fois à l’intérieur du cytosol, la métalloprotéase LC/A se localise dans la membrane cytoplasmique interne et clive la protéine hôte SNAP-25 liée à la membrane. SNAP-25 est un membre de la famille des protéines SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor), qui joue un rôle crucial dans l’exocytose de l’acétylcholine (examiné dans la référence3). Le clivage LC/A de SNAP-25 altère la fonction du complexe SNARE, ce qui inhibe la libération de neurotransmetteurs d’acétycholine et altère la contraction musculaire.
Actuellement, le traitement du botulisme est limité et comprend souvent l’administration d’un anticorps neutralisant équin4 ; cependant, comme la toxine est rapidement internalisée dans les neurones, l’anticorps a une fenêtre temporelle d’administration étroite. Ainsi, de nombreux chercheurs pensent que le BoNT/A LC pourrait être une meilleure cible thérapeutique. Parce que le LC est une métalloprotéase dépendante du zinc, une approche pour inhiber l’activité LC/A a été de développer des composés qui chélatent l’ion zinc du site actif. Par exemple, les composés d’hydroxamate chélatent le zinc du site actif et ont une excellente puissance in vitro (Ki du meilleur inhibiteur de petites molécules BoNT/A LC à ce jour est de 77 nM)5. Cependant, de nombreuses petites molécules ne parviennent pas à progresser en tant que thérapeutiques en raison de divers problèmes ex vivo ou in vivo, notamment une faible solubilité aqueuse, un métabolisme rapide et/ou une cytotoxicité élevée. Par conséquent, de nouveaux composés aux propriétés pharmacologiques et pharmacocinétiques améliorées sont nécessaires. L’identification de composés à petites molécules implique souvent un criblage à haut débit (HTS) pour identifier de nouveaux échafaudages. Les méthodes initiales de criblage de l’activité BoNT/A LC étaient basées sur la détection par HPLC du clivage court du substrat peptidique, ce qui prend du temps et ne se prête pas aux applications HTS6-8. Par la suite, Schmidt et ses collègues9 ont mis au point un test d’activité BoNT/A LC à haut débit qui utilise un substrat peptidique marqué à la fluorescéine fixé de manière covalente à une plaque de microtitration. Le BoNT/A LC clive le substrat et libère de la fluorescéine, qui peut être quantifiée à l’aide d’un fluorimètre. Le format sur plaque de ce test permet de cribler simultanément de nombreux composés ; Cependant, le test nécessite de marquer les peptides synthétiques avec de la fluorescéine et de recouvrir les plaques de test avec des molécules de substrat dérivées, qui sont des techniques lourdes. Une méthode beaucoup plus simple de détection de l’activité BoNT/A LC à de faibles concentrations a été décrite plus tard par Schmidt et coll., où une série de substrats fluorogéniques ont été utilisés pour surveiller l’activité BoNT LC en temps réel10. D’autres techniques décrites dans la littérature comprennent un dosage basé sur la dépolarisation après transfert d’énergie par résonance pour détecter et quantifier l’activité BoNT dans les extraits bruts ; cette méthode peut être utilisée pour des applications à haut débit10,11, bien qu’elle nécessite un équipement sophistiqué pour mesurer le transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET) et les signaux de polarisation. Enfin, plusieurs modèles cellulaires d’intoxication par BoNT ont été rapportés (examinés dans la référence11) qui permettront aux chercheurs d’étudier les propriétés souvent limitatives des composés mentionnés précédemment, notamment la cytotoxicité, la perméabilité cellulaire et la stabilité. Cependant, la plupart des tests cellulaires existants ne se prêtent pas au HTS et nécessitent beaucoup de travail et de temps.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une méthode HTS qui utilise le substrat BoNT/A LC basé sur FRET disponible dans le commerce. Le substrat est basé sur la séquence de clivage SNAP-25 et est un peptide 13-mère synthétique qui contient un fluorophore terminal et un extincteur. Le clivage BoNT/A sépare le fluorophore et l’extincteur, abolissant le FRET et augmentant la fluorescence mesurée, qui peut être mesurée en continu dans un lecteur de plaques de fluorimètre. Le test est utilisé régulièrement dans nos laboratoires, ainsi que dans d’autres laboratoires, pour identifier de nouvelles classes d’inhibiteurs de BoNT/A LC ou pour déterminer la puissance relative des composés5,12-15 précédemment identifiés. Ce test est adapté aux SHD en raison de sa simplicité, de son potentiel d’automatisation, de son faible coût des matériaux et de sa capacité à cribler de nombreux composés simultanément (voir référence16 ; Caglič et al., soumis ; Bompiani et al., en préparation). En plus de l’HTS, ce test peut être utilisé pour comparer la puissance relative des composés en déterminant la valeur IC50 (concentration requise pour inhiber 50 % de l’activité BoNT/A LC) d’un composé. Le test peut être effectué manuellement dans un format à 96 puits (section Filtrage manuel du texte du Protocole) ou peut être automatisé dans un format à 384 puits pour HTS (section Opération automatisée du texte du Protocole).

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Teknova</td><td>H1021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol (qualité HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (qualité HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>96 puits Plaque de dosage noire</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>384 puits Plaque de test noire à faible volume</td><td>Substrat Greiner</td><td>788076</td><td></td></tr><tr><td>SNAPtide FITC/Dabcyl</td><td>Liste Biological Laboratories</td><td>521</td><td>Substrat BoNT/A LC à base de FRET</td></tr><tr><td>Solution de nettoyage des goupilles</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 110</td><td></td></tr><tr><td>Papier buvard non pelucheux</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 540DB</td><td></td></tr><tr><td>Biomek Seal and Sample Couvercles en feuille d’aluminium</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

une plate-forme à base de fret haut-débit compatible pour l&#39;identification et la caractérisation de la chaîne neurotoxine botulique de lumière modulateurs

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

La neurotoxine botulique (BoNT) est une toxine bactérienne puissante et potentiellement mortelle qui se lie aux motoneurones de l’hôte, est internalisée dans la cellule et clive les protéines intracellulaires essentielles à la libération des neurotransmetteurs. La BoNT est composée d’une chaîne lourde (HC), qui médie la liaison et l’internalisation de la cellule hôte, et d’une chaîne légère (LC), qui clive les protéines hôtes intracellulaires essentielles à la libération de l’acétylcholine. Alors que les thérapies qui inhibent la liaison/internalisation de la toxine ont une petite fenêtre temporelle d’administration, les composés qui ciblent l’activité intracellulaire de la LC ont une fenêtre temporelle d’administration beaucoup plus longue, particulièrement pertinente compte tenu de la demi-vie extrêmement longue de la toxine. Ces dernières années, de petites molécules ont été fortement analysées en tant qu’inhibiteurs potentiels de la LC en raison de leur perméabilité cellulaire accrue par rapport à des thérapies plus grandes (peptides, aptamères, etc.). L’identification des leads implique souvent un criblage à haut débit (HTS), où de grandes banques de petites molécules sont criblées en fonction de leur capacité à moduler la fonction thérapeutique de la cible. Nous décrivons ici un test basé sur FRET avec un substrat commercial BoNT/A LC et un LC recombinant qui peut être automatisé pour le HTS d’inhibiteurs potentiels de BoNT. De plus, nous décrivons une technique manuelle qui peut être utilisée pour le suivi du criblage secondaire, ou pour comparer la puissance de plusieurs composés candidats.

Le dosage de la LC de BoNT/A basé sur la FRET peut être effectué manuellement de manière basse performance pour caractériser des inhibiteurs connus ou cribler de petites bibliothèques ; en alternative, le protocole peut être miniaturisé et automatisé pour un criblage à haut débit (HTS) avec de grandes bibliothèques, dans le but d'identifier de nouveaux inhibiteurs de la LC de BoNT/A. Quelle que soit l'approche adoptée, une augmentation de la fluorescence doit être observée au fil du temps lorsque la LC de BoNT/A est incu...

La neurotoxine botulique de type A à chaîne légère (BoNT/A LC) est une métalloprotéase qui pénètre dans les motoneurones, clive son substrat SNAP-25 et perturbe la neurotransmission, entraînant ainsi une paralysie flasque. À l’aide d’un test basé sur le FRET compatible à haut débit, de grandes banques de petites molécules peuvent être criblées pour leur impact sur l’activité enzymatique BoNT/A LC.

Une plate-forme à base de FRET haut-débit compatible pour l&#39;identification et la caractérisation de la chaîne neurotoxine botulique de lumière modulateurs

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

L’objectif global de cette procédure est de dépister de petites molécules pour la neurotoxine botulique, une inhibition des chaînes légères. Ceci est accompli en préparant d’abord des séries de dilution de composés avec une précision et une exactitude élevées. La deuxième étape consiste à transférer les dilutions du composé dans une plaque noire à 96 puits.Ensuite, l’enzyme à chaînes légères diluée est ajoutée à la plaque et l’enzyme est incubée avec le composé pendant cinq minutes à température ambiante. La dernière étape consiste à ajouter le substrat de frette de la chaîne légère pour initier la réaction, qui est surveillée par un lecteur de plaque de fluorescence. En fin de compte, des cribles secondaires qui utilisent un substrat peptidique non fluorescent doivent être utilisés pour confirmer l’activité du composé et déterminer des constantes cinétiques plus rigoureuses telles que la constante de dissociation de l’inhibiteur ou ki.Le principal avantage de ce test par rapport aux méthodes existantes telles que les méthodes basées sur l’HPLC ou les méthodes basées sur les cellules, est qu’il est simple à réaliser, facilement automatisé et peut être utilisé pour comparer la puissance relative d’un certain nombre de composés. Les individus peuvent avoir des difficultés lorsqu’ils ne connaissent pas cette méthode lors de la préparation d’une série de dilutions de composés et du mélange correct de la plaque une fois que tous les composants sont ajoutés. Commencez cette procédure en préparant les tampons et les réactifs comme décrit dans le protocole texte.Configurez le lecteur de plaques pour qu’il secoue la plaque à vitesse moyenne pendant 10 secondes, puis pour surveiller la fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 490 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 523 nanomètres toutes les cinq minutes en mode cinétique pendant une heure 30 minutes à température ambiante. Après avoir déterminé la plage de concentration du composé, étiquetez les tubes avec le nom et la concentration appropriés du composé, Eloqua, 100 % d’oxyde de diméthylsulf ou DMSO sur tous les tubes pour les préparer à la dilution des céréales composées. Ensuite, préparez la dilution en série des composés pour la série de dilution standard de un à trois.Ajoutez deux microlitres de composé non dilué à quatre microlitres de DMSO dans le premier tube de la série de dilution, et mélangez bien avec une nouvelle pointe de pipette. Retirez deux microlitres de la première dilution et ajoutez-les à quatre microlitres de DMSO dans le deuxième mélange de tubes. Bien répéter l’opération pour les dilutions restantes.Assurez-vous de bien mélanger les dilutions du composé pour vous assurer que les concentrations du composé sont exactes. Couvrez les tubes composés et mettez-les de côté À température ambiante, obtenez une plaque à fond plat, opaque et noire à 96 puits. En utilisant la configuration de plaque recommandée qui se trouve dans le protocole texte.Distribuez manuellement un microlitre de la dilution du composé respectif directement au fond de chaque puits correspondant pour les puits un à neuf, distribuez un microlitre de la concentration la plus élevée de composé à tester au puits.11. Pour servir de composé de contrôle de fluorescence intrinsèque. Ce contrôle consiste à déterminer si les composés eux-mêmes sont fluorescents et/ou affectent l’hydrolyse du substrat.Distribuer manuellement un microlitre d’un inhibiteur puissant connu dans le puits, 12 en tant que contrôle positif et un microlitre de 100 % de DMSO dans le puits. 10 en tant que contrôle négatif avec une distribution automatisée par pipette. 79 microlitres de tampon de dosage sur le côté des puits, un à 10 et 12 et 89 microlitres sur le côté du puits, 11.Assurez-vous de ne pas toucher la pointe au fond du puits où le composé est présent pour éviter la contamination croisée des puits. Vortex, l’enzyme à chaînes légères diluée, et utilisez une pipette automatisée pour ajouter 10 microlitres de l’enzyme sur le côté de chaque puits, à l’exception du puits 11. Tapotez doucement la plaque pour vous assurer que le volume total d’enzyme ajoutée va au fond du puits, mélangez doucement, couvrez et incubez la plaque pendant cinq minutes à température ambiante.Cette incubation fournit une étape de pré-équilibre pour que les composés se lient à la chaîne légère. Avant l’ajout du substrat, vortex doucement la neurotoxine botulique dans un substrat de chaîne légère. Ensuite, à l’aide d’une pipette automatisée, ajoutez 10 microlitres de substrat sur le côté de chacun.Assurez-vous d’ajouter le substrat sur le côté du puits opposé à l’endroit où l’enzyme a été ajoutée plus tôt. Tapotez doucement la plaque pour mélanger immédiatement les réactifs. Placez la plaque dans un lecteur de plaques de microtitration à fluorescence et commencez le programme précédemment configuré.Une fois le programme terminé, calculez les vitesses enzymatiques en représentant graphiquement l’unité de fluorescence relative en fonction du temps et en calculant la pente de la ligne pendant la période linéaire de la réaction. Se préparer au fonctionnement automatisé pour le criblage à haut débit comme décrit dans le protocole de texte, La démonstration d’une partie du protocole de criblage à haut débit sera de jeune post-doctorant dans mon laboratoire. Il montrera comment les composés sont transférés dans des plaques pour un criblage à haut débit à l’aide d’un équipement d’automatisation de laboratoire après avoir distribué de la neurotoxine botulique diluée, une enzyme à chaîne légère, dans la plaque de dosage.Attribuez des zones sur la plate-forme de manipulation des liquides pour les plaques composées, les plaques de test et les conteneurs contenant des solutions de nettoyage. Programmez le manipulateur de liquides pour qu’il place les plaques composées et les plaques de dosage dans les positions désignées et retire les couvercles des plaques avant l’emboutissage. Calibrez le logiciel du programme d’estampage et assurez-vous que les goupilles d’estampage sont immergées mais ne rayent pas le bas de la plaque d’essai.Tamponnez 50 nanolitres du composé directement dans la plaque de dosage contenant huit microlitres de neurotoxine botulique. Une chaîne légère. Nettoyez les broches après chaque plaque en les trempant dans du DMSO, puis en les séchant sur du papier buvard et en répétant ce processus avec de l’isopropanol et du méthanol.Enfin, séchez les broches sur le ventilateur après que les composés aient été estampillés dans les plaques de dosage avec de l’enzyme. Séparément, empilez les plaques de composé de base et les plaques de dosage recouvrent la plaque de dosage supérieure de la pile pour éviter l’évaporation et mettez-les de côté. Assurez-vous d’incuber la chaîne légère avec des composés pendant au moins cinq minutes à température ambiante.Des temps d’incubation plus longs peuvent être utilisés lors de l’estampage d’un grand nombre de plaques. Enfin, versez le substrat dans les plaques de test et mesurez la fluorescence comme décrit dans le protocole de texte. Qu’il s’agisse d’effectuer le test de neurotoxine botulique à faible débit ou à haut débit, une augmentation de la fluorescence doit être observée au fil du temps lorsque la neurotoxine botulique, une chaîne légère, est incubée avec le substrat.Si des dilutions en série d’un composé sont testées, on obtient souvent une série de lignes avec des pentes variables. Ici. La concentration finale d’un composé à base d’hydroxyate est indiquée en unités micromolaires. Eh bien, 10 dans la disposition de la plaque décrite ici sert de contrôle négatif lorsque seul le véhicule est ajouté.Le taux de cette réaction est défini comme une activité enzymatique de 100 % et les taux en présence du composé peuvent être normalisés à ce taux pour obtenir le taux relatif ou le pourcentage d’inhibition. Lorsque le dosage est effectué avec des dilutions en série d’un composé, un graphique de la vitesse de la réaction en fonction de la concentration de l’inhibiteur peut être utilisé pour déterminer la concentration inhibitrice demi-maximale ou CI 50. La plage de dilution doit être choisie de manière à ce que le tracé apparaisse en forme de sigmoïde pour un ajustement optimal de la courbe.La valeur CI 50 est une mesure relative de la puissance mieux décrite comme une valeur KI apparente, car elle dépend de la concentration de l’enzyme présente dans le dosage. Cette valeur peut ensuite être utilisée pour comparer et classer la puissance de plusieurs composés s’ils sont testés. En parallèle, un bon mélange de la plaque après l’ajout de chaque composant est crucial pour obtenir une augmentation linéaire régulière de la fluorescence au fil du temps, ce qui est nécessaire pour déterminer avec précision les vitesses initiales.Ce graphique montre une expérience représentative où il n’y avait pas suffisamment de mélange et où le taux de formation du produit n’est pas linéaire dans le temps. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures pour un maximum de huit composés. Après cette expérience, d’autres tests peuvent être effectués avec des substrats peptidiques non fluorescents pour confirmer que les composés inhibent la neurotoxine botulique, les chaînes légères et l’activité somatique.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la puissance relative des inhibiteurs de la chaîne légère de la neurotoxine botulique. Le protocole s’est déroulé en trois étapes. Tout d’abord, la préparation d’une série de dilutions composées.Deuxièmement, l’ajout d’une enzyme de chaîne légère recombinante, et troisièmement, l’ajout d’un substrat fluorescent et la mesure ultérieure sur un lecteur de plaque fluorescente.

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