La spectrométrie de masse MALDI-TOF à cellules entières est une méthode précise et rapide pour analyser différents modes d’activation des macrophages

Cette expérience utilise la spectrométrie multi à masse de cellules entières. Pour analyser avec précision les multiples états d’activation des macrophages, il faut d’abord dériver les macrophages des monocytes positifs au CD 14, puis stimuler les cellules avec des agonistes comme les cytokines et les bactéries. Analyser les échantillons par molybdène sur une cible en acier, en séparant les protéines et en obtenant un spectre pour chaque échantillon.

Les résultats d’empreintes digitales spécifiques permettent de discriminer entre différents états d’activation d’une seule cellule eucaryote, le macrophage, sur la base d’une analyse bioinformatique des spectres obtenus par la spectrométrie de masse de Maloff de la cellule entière. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le flow est qu’elle est rapide, facile et peu coûteuse. Dans cette expérience, nous montrons que des spectres reproductibles ont été obtenus à partir de macrophages et que divers états d’activation ont été discriminés par des ov de cellules entières.

Nous obtenons également des spectres du BBMC, qui pourraient être utiles pour le diagnostic de la réponse de l’hôte à l’infection. Cette méthode peut fournir des informations sur les états d’activation des cellules immunitaires. Il pourrait également être appliqué à d’autres systèmes, tels que le profilage de concept pour remplacer, par exemple, l’analyse supplémentaire lors d’une intervention chirurgicale, isoler les cellules de l’opax dans des tubes de 50 millilitres.

Ajouter 15 millilitres de fi, diluer le sang dix fois dans une solution saline. Ensuite, séparez 30 millilitres de sang dilué sur le gradient de fol. Après avoir récupéré l’anneau des BMC P, gardez les cellules sur la glace.

Dissociez doucement les BMC P granulés en 80 microlitres de tampon de coulée. Ajouter 20 microlitres de billes magnétiques enrobées d’anticorps anti CD 14. Mélangez et incubez pendant 15 minutes.

Lavez une fois avec cinq millilitres de tampon de coulée et centrifugez à 300 G pendant cinq minutes. Dissociez doucement les cellules granulées en 500 microlitres de tampon courant. Sélectionnez la colonne appropriée pour la séparation magnétique.

Rincez la préco et la colonne avec un tampon de coulage. Chargez ensuite le pbmc sur le preco. Appliquez un champ magnétique et rincez trois fois avec un tampon de coulage.

Retirez le pré-cal et placez la colonne sur un tube de 15 millilitres. Ajoutez un tampon de fonctionnement et éluez les cellules positives du CD 14 en appliquant une pression sur la colonne. Ensuite, centrifugez.

L’ouit à 300 Gs pendant cinq minutes. Jetez le supinate. Lavez la pastille de monocyte avec 10 millilitres de culture.

Aliquote moyenne d’une fraction pour déterminer la pureté de la préparation des monocytes par cytométrie en flux à l’aide d’anticorps anti CD 14. Ensemencez les monocytes dans trois millilitres de milieu de culture contenant 10 % de sérum humain AB positif pendant quatre jours. Remplacez ensuite le milieu par un RPMI complété par 10 %FBS et identifiez la population cellulaire obtenue comme des macrophages dérivés de monocytes par cytométrie en flux.

Stimulez les échantillons selon le plan expérimental. Après avoir lavé les MDM stimulés avec du PBS, grattez les cellules avec le policier en caoutchouc et récupérez les suspensions MDM. Granulez les cellules par centrifugation, puis lavez-les une fois dans du PBS pour éliminer les traces de FBS.

Granulez les M dms par centrifugation et remettez les granulés en suspension dans 20 microlitres de PBS. Analysez les cellules immédiatement ou stockez-les dans du PBS à moins 80 degrés Celsius avant l’analyse. Pour préparer la matrice CHCA, ajoutez 500 microlitres d’acétyl nitrile, 250 microlitres d’acide tri-fluoracétique à 10 % et 250 microlitres d’eau de qualité HPLC dans un flacon.

Ajoutez ensuite 10 microlitres de mélange CHCA et sonicez la matrice pendant au moins 20 minutes. Centrifugez à 13 000 G pendant cinq minutes, conservez le surnageant et jetez la pastille. Ensuite, humidifiez la cible en acier poli avec de l’eau chaude du robinet avec du papier blanc de précision.

Ajoutez 70 % d’éthanol et frottez les RIN avec de l’eau. Ajoutez ensuite 70 % d’éthanol et frottez avec du papier de précision. Immergez la cible dans 70 % d’éthanol et sonicate pendant au moins 15 minutes.

Couvrez la cible avec 500 microlitres à un millilitre d’acide fluoré sec à 80 %, frottez et essuyez avec du papier de précision. Rincez ensuite à l’eau de qualité HPLC sans frotter. Séchez la cible à température ambiante.

Maintenant, décongelez doucement les échantillons MDM sur de la glace. Mélangez la suspension de cellules MDM par pipetage et déposez un microlitre sur la cible MALDI. Ajouter un microlitre de solution matricielle MALDI sur l’échantillon.

Pour les répliques techniques. Dépôt : 12 à 16 échantillons par test s’évaporent spontanément à température ambiante. Maintenant, insérez la cible en acier contenant des échantillons dans le spectromètre de masse.

Configurez le spectromètre de masse et exécutez l’acquisition des données. Chaque spectre se compose d’une liste de pics avec les masses et les intensités respectives indiquant une abondance relative. Utilisez la racine carrée des intensités pour améliorer la visualisation graphique des spectres.

Corrigez ensuite l’arrière-plan à l’aide d’un algorithme d’écrêtage de pic non linéaire sensible aux statistiques. Pour l’estimation de référence, appliquez un rapport signal/bruit de six pour détecter les pics. Considérez que les pics détectés sont similaires dans tous les spectres lorsque les valeurs de charge massique se situent dans une fenêtre de 2000 PM.

Dans cette expérience, des macrophages stimulés ont été préparés à partir d’échantillons de sang. Les monocytes sont bloqués pour l’expression du CD 14, mais pas du CD 68. À l’inverse, les macrophages dérivés de monocytes ont été identifiés par l’expression du CD 68, mais pas par l’expression du CD 14.

Ces données illustrent le rôle des préparations d’échantillons dans l’interprétation des résultats de MALDI toff MS. Un spectre de bonne qualité contient généralement un pic majeur d’environ cinq kilodaltons. Une concentration cellulaire minimale est nécessaire pour obtenir de bons échantillons, comme l’indique ce spectre de mauvaise qualité obtenu avec une faible concentration cellulaire.

Des résultats médiocres similaires sont obtenus lorsque l’échantillon est mélangé à la matrice avant d’être déposé sur la plaque cible. Ici, les spectres de divers échantillons sont représentés sous forme de carte thermique. L’abondance relative est codée par couleur en fonction de l’intensité du bleu.

Cette représentation virtuelle en vue gel illustre la reproductibilité des échantillons au sein de chaque classe. Une analyse non supervisée par clustering hiérarchique est résumée sous forme d’agramme. Tous les échantillons ont été regroupés en trois groupes différents.

Il est important de noter que l’analyse TOF de MALDI permet de distinguer les macrophages M1 des macrophages M deux et des MDM non stimulés. La représentation de crête d’un spectre de référence pour l’IFN gamma IL quatre, ou les MDM non stimulés montre des pics spécifiques pour chaque classe.

Des empreintes digitales spécifiques peuvent être induites par plusieurs agonistes pour illustrer la précision de la maloff à cellules entières. En effet, les spectres de tous les échantillons stimulés étaient clairement séparés de ceux des macrophages non stimulés. Les MDM présentaient également des empreintes digitales spécifiques induites par des bactéries tuées par la chaleur.

Ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle MALDI to Ms. peut être utilisé pour analyser les cellules circulantes afin d’évaluer la réponse de l’hôte à l’infection ou aux maladies inflammatoires en milieu clinique lorsque l’échantillon est prêt. Cette technique peut être complétée en une heure si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer les états d’activation d’une cellule chaotique par spectrométrie de masse OV de cellule entière.