Name: Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Découvrez la transplantation sous-rétinienne de précurseurs de photorécepteurs purifiés par MACS dans la rétine de souris adulte. Cette méthode permet d'étudier l'intégration cellulaire pour la régénération rétinienne.

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Nous tenons à remercier Anand Swaroop pour avoir fourni des souris Nrl-GFP, Jochen Haas pour son soutien technique et Sindy Böhme et Emely Lessmann pour l’élevage.	
	Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, le CRTD Seed Grant Program, le SFB 655 et le ProRetina e.V. fondation, le programme d’études supérieures DIGS-BB dresde et la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Énoncé sur l’utilisation éthique et les soins des animaux :
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées en stricte conformité avec les lois de l’Union européenne et allemandes (Tierschutzgesetz) et ont adhéré à la déclaration ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la TU Dresde et de la Landesdirektion Dresden (numéro d’approbation : 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Avant de commencer la dissociation des cellules et le tri des cellules
<ol><li>Étiqueter trois tubes réactionnaires de 15 ml avec : Wash (W), Fraction positive (+) et Fraction négative (-).</li>
</ol>2. Dissociation de la rétine
<ol><li>Décapitez les chiots PN 4 à l’aide d’un ciseau.</li>
	<li>Rincer la tête des petits peu de temps après avec de l’éthanol à 70 % et les laver dans du PBS.</li>
	<li>Transférer la tête à HBSS froid et énucléer l’œil (répétez cette étape pour toutes les têtes). Pour énucléer, ouvrez les paupières et fixez l’œil avec une pince incurvée au niveau de la région du nerf optique. Ensuite, tirez l’œil soigneusement hors de l’orbite.</li>
	<li>Après avoir énucléé tous les yeux, isolez la rétine: introduisez un ciseau fermé dans le nerf optique et ouvrez les lames. Peal le RPE / chorid out. Retirez les lentilles et les vaisseaux sanguins à l’aide d’une pince incurvée.</li>
	<li>Transférer les rétines isolées dans un tube réactionnel de 1,5 ml contenant la solution de papaïne (fournie par le kit de dissociation de la papaïne).</li>
	<li>Incuber les rétines dans la solution de papaïne pendant 30-60 min dans un bain-marie ou un shaker (400 rpm) à 37 °C.<ol>
<li>Pendant que les rétines couvent dans la solution de papaïne, pipetter 1 ml de solution d’ovomucoïde dans un tube réactionnel de 15 ml (étiquette « 1 »).</li>
			<li>Ajouter 60 μl de DNase I (10 mg/ml) + 60 μl de solution d’ovomucoïde (fournie par le kit) + 520 μl d’EBSS dans un tube de réaction de 15 ml (étiquette « 2 »).</li>
		</ol>
</li>
	<li>Après incubation de la papaïne, transférer la solution de papaïne contenant les rétines partiellement digérées dans le tube réactionnel « 2 ».</li>
	<li>À l’aide d’une pipette polie au feu, effectuez une dissociation mécanique (10x de haut en bas).</li>
	<li>Pipetter la suspension à cellule unique au tube de réaction « 1 ». Essayez de générer 2 couches en superposant doucement la suspension cellulaire sur la solution ovomucoïde.</li>
	<li>Centrifuger pendant 5 min à 300 x g (environ 1 300 tr/min).</li>
	<li>Jetez le surnageant et ressuscitez les cellules dans 500 μl de tampon MACS.</li>
</ol>3. Tri des cellules à l’aide du tri des cellules associées magnétiques (MACS)
<ol><li>Ajouter x μl d’anticorps anti-CD73 pour le rat aux 500 μl afin d’atteindre une concentration finale de 10 μg/ml.</li>
	<li>Incuber 5 min sur la glace.</li>
	<li>Remplissez le tube de réaction de 15 ml à 10 ml avec un tampon MACS et centrifugez-le pendant 5 min à une vitesse de 300 x g.</li>
	<li>Retirez le surnageant.</li>
	<li>Ressusciter la pastille dans un tampon MACS de 480 μl et ajouter 120 μl de microbilles d’IgG anti-rat de chèvre.</li>
	<li>Incuber 15 min sur la glace; ne pas agiter, secouer ou mélanger.</li>
	<li>Remplissez le tube de réaction de 15 ml à 5 ml avec un tampon MACS et centrifugez-le pendant 5 min à 300 x g.</li>
	<li>Lorsque le tube de réaction est centrifugé:<ol>
<li>Ajustez une colonne LS dans le support magnétique.</li>
			<li>Placez le filtre de préséparation au-dessus de la colonne LS.</li>
			<li>Hydrater le filtre de préséparation et la colonne LS avec un tampon MACS de 3 ml et recueillir le tampon MACS dans le tube de lavage (W).</li>
		</ol>
</li>
	<li>Retirez le surnageant.</li>
	<li>Ressusciter la pastille dans un tampon MACS de 500 μl.</li>
	<li>Chargez la suspension cellulaire de 500 μl dans le filtre, puis ajoutez 1 ml de tampon MACS au filtre et collectez la fraction négative dans le tube de réaction de fraction négative (-).</li>
	<li>Ensuite, ajoutez 3 x 3 ml de tampon MACS à la colonne pour laver les cellules qui ne sont pas liées à la colonne</li>
	<li>Une fois que ces 9 ml sont à travers la colonne LS, retirez la colonne du support magnétique et installez-la sur le dessus du tube de réaction de fraction positive (+).</li>
	<li>Chargez rapidement 5 ml de tampon MACS dans la colonne LS et placez le piston dans la colonne LS et appuyez dessus jusqu’à ce que la mémoire tampon entière soit à travers la colonne.</li>
	<li>Centrifuger le tube réactionnel contenant la fraction positive pendant 5 min à 300 x g.</li>
	<li>Retirer le surnageant, le ressusciter dans 500 μl de tampon MACS et le maintenir à 4 °C.</li>
	<li>Comptez la quantité totale de cellules à l’aide d’un dispositif de comptage de cellules commun.</li>
	<li>Préparer une suspension cellulaire à partir de la fraction triée positive contenant 2 x 105 cellules/μl dans un tampon MACS et la maintenir à 4 °C</li>
</ol>4. Transplantation de cellules précurseurs de photorécepteurs triées par MAC dans la rétine de la souris
<ol><li>Assurez-vous d’avoir toutes les solutions suivantes prêtes : 1 ml de PBS ou d’HBSS stérile, 10 μl de DNAse I, 1-2 ml stérile désioniséH2O,aliquotes des fractions de suspension cellulaire à 4 °C.</li>
	<li>Anesthésier la souris adulte(c.-à-d. âgée de 2 à 4 mois) avec une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de médetomidine (0,01 mg/10 g de poids corporel), de kétamine (0,75 mg/10 g de poids corporel). Ensuite, faites une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) pour soulager la douleur.</li>
	<li>Dilater les pupilles avec une goutte de phényléphrine 2,5%-Tropicamide 0,5%.</li>
	<li>Fixez la souris dans le support de tête de souris et placez-la au microscope stéréoscopique.</li>
	<li>Appliquez une goutte de gel visidique pour éviter le dessèchement de l’œil.</li>
	<li>Faire un petit trou à la frontière entre la sclérotique et la cornée (respectivement ora serrata)à l’aide d’une aiguille stérile de 30 G 1/2.</li>
	<li>Coupez une glissière de couverture commune en petits morceaux (environ 5 mm x 5 mm) à l’aide d’un stylo diamant, placez l’une de ces pièces sur le dessus de la cornée, permettant une visualisation directe de la rétine.</li>
	<li>Rincer la seringue microlitres préstérisée plusieurs fois avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Chargez la seringue microlitre avec 1 μl de suspension cellulaire, dirigez l’aiguille tangentiellement à travers la conjonctive et la sclérotique et placez-la sous contrôle visuel dans la moitié nasale de la rétine.</li>
	<li>Percer doucement un trou dans la rétine jusqu’à atteindre l’espace sous-rétinien, injecter la suspension cellulaire dans l’espace sous-rétinien.</li>
	<li>Observez le décollement bulleux de la rétine, qui doit être uniforme, couvrant environ 1/4 de l’espace rétinien sans aucun saignement.</li>
	<li>Retirez doucement la seringue, le trou rétinien scelle automatiquement.</li>
	<li>Rincer la seringue microlitre plusieurs fois avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Relâchez la souris du porte-tête.</li>
	<li>Réveillez la souris en injectant du chlorhydrate d’atipamozole pour inverser l’effet chlorhydrate de médétomidine.</li>
	<li>Placez la souris pour le temps de réveil dans une chambre sombre et chaude (environ 25 °C).</li>
	<li>Les 2 prochains jours après la transplantation, la buprénorphine (0,05 mg/kg de poids corporel) doit être administrée par injection sous-cutanée le matin et l’après-midi pour soulager la douleur.</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs représente un outil fiable pour réaliser l’intégration de ces cellules sensibles à la lumière dans les rétines de l’hôte en nombres significatifs1,2. Cela pourrait permettre la mise en place d’une thérapie cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine à l’avenir6. La population donneuse de cellules, actuellement isolée des rétines PN 4, est un mélange de différents types de cellules, à partir de laquelle seules les cell...

La vision est l’un des principaux sens de l’homme. La dégradation de ce sens et la cécité sont l’une des principales raisons du handicap dans les pays industrialisés. La cause prédominante de déficience visuelle ou de cécité est la dégénérescence rétinienne, caractérisée par une perte de cellules photorécepteurs, comme on peut l’observer dans la dégénérescence maculaire, la rétinite pigmentaire, la dystrophie cononique-tige et d’autres conditions. À ce jour, il n’existe pas de thérapie efficace pour restaurer la vision perdue. En 2006 et 2008, deux laboratoires différents ont signalé, indépendamment l’un de l’autre, une transplantation réussie de cellules précurseurs de photorécepteurs de tiges dans des rétines adultes de souris de type sauvage1,2. Ainsi, surgissant la possibilité de transplantation de cellules de précurseur de photorécepteur également dans une rétine dégénérée, pour remplacer les photorécepteurs dégénérés et restaurer la vision. En effet, il a été démontré récemment, que de telles cellules précurseurs photoréceptrices transplantées suscitent des critères morphologiques de photorécepteurs matures de type sauvage, tels que des segments externes correctement développés3, desbornes synaptiques à proximité immédiate de cellules bipolaires endogènes et d’un corps cellulaire rond situé dans la couche nucléaire externe2-4,ainsi que la capacité à s’intégrer fonctionnellement dans les circuits neuronaux de l’hôte5-7. L’un des grands principes de cette stratégie est l’utilisation des rétines de jeunes souris du jour postnatal 4 (PN 4, PN0 est défini comme le jour de la naissance), ce qui entraîne un mélange de différents types de cellules pour la transplantation. Sur le fond d’une future application thérapeutique, ce mélange doit être purifié pour les cellules précurseurs de photorécepteurs. CD73 a été décrit comme le premier marqueur de surface cellulaire spécifique pour les jeunes photorécepteurs dans la rétine8-10. Ici, nous démontrons une méthode de purification de cellules précurseurs de photorécepteurs basée sur ce marqueur de surface cellulaire et avec l’utilisation de la technique de tri cellulaire magnétique associé (MACS). Macs pourrait avoir des avantages par rapport aux techniques de tri cellulaire fluorescent-activé, en raison des temps de tri rapides et de l’ajustement plus facile aux conditions GMP. Nous pourrions démontrer un enrichissement d’environ 90% et un taux d’intégration jusqu’à 3 fois plus élevé lors de la transplantation de la population enrichie dans l’espace sous-rétinien chez les rétines adultes de type sauvage. Ainsi, l’enrichissement de cellules précurseurs de photorécepteurs à base de MACS et la transplantation sous-rétinienne sont des techniques fiables et prometteuses pour le développement d’une stratégie thérapeutique régénératrice pour le traitement de la dégénérescence rétinienne.

<table><tbody><tr><td>Système de dissociation de la papaïne</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>fourni DNase I n’est pas utilisé dans la méthode</td></tr><tr><td>Rat purifié Anti-souris CD73, clone TY/23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>Concentration stock 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Rat IgG MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>Volume total de 2 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Utilisé pour compter le nombre total de cellules</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td>Utilisé pour la dissociation des rétines</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>Utilisé pour compter le nombre total de cellules</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine 10 %</td><td>Ratiopharm</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>Phényléphrine 2,5 %-Tropicide 0,5</td> % <td>Cliniques universitaires Dresde Pharmacie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtres de préséparation</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonnes</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur QuadroMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre poli au feu</td><td>Marque</td><td>74777 20</td><td>La pipette' Les pointes doivent être polies au feu et autoclavées.</td></tr><tr><td>MACS Porte-tubes 15 ml</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage cellulaire</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubes stériles de 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD</td><td>Leica</td><td>M651 MSD</td><td>peut être utilisé à la place de l’Olympus SZX10</td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td>peut</td><td></td><td>être utilisé à la place du Leica M651 MSD</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope inversé Olympus CKX41</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Hotte de culture cellulaire Thermo Scientific MSC-Advance</td><td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tube à réaction</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Tube à réaction</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>Support de tête de souris</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 in</td><td>BD Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton microlitre seringue 5 &micro ; l, 75RN</td><td>Hamilton</td><td>065-7634-01</td><td>livré sans aiguilles</td></tr><tr><td>Hamilton RN aiguille spéciale 34 G</td><td>Hamilton</td><td>065-207434</td><td>émoussée, longueur 12 mm</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml ; bingen Ciseaux à ressort - Lames de 5 mm Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #7 - Titane Biologie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Diamond pen</td><td>Tools-tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 15 mm Cover slips</td><td>Sparks</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par macs dans la rétine adulte de la souris

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

La déficience visuelle et la cécité due à la perte des cellules de détection de la lumière de la rétine, c’est-à-dire des photorécepteurs, représentent la principale raison de l’invalidité dans les pays industrialisés. Le remplacement des photorécepteurs dégénérés par la transplantation de cellules représente une option de traitement possible dans de futures applications cliniques. En effet, des études précliniques récentes ont démontré que les photorécepteurs immatures, isolés de la rétine néonatale de souris au jour postnatal 4, ont le potentiel de s’intégrer dans la rétine de souris adulte après une transplantation sous-rétinienne. Les cellules de distributeur ont généré une morphologie mûre de photorécepteur comprenant les segments intérieurs et externes, un corps rond de cellules situé à la couche nucléaire externe, et les bornes synaptiques à proximité des cellules bipolaires endogènes. En effet, des rapports récents ont démontré que les photorécepteurs donneurs s’intègrent fonctionnellement dans les circuits neuronaux des souris hôtes. Pour une future application clinique d’une telle approche de remplacement cellulaire, des suspensions purifiées des cellules de choix doivent être générées et placées à la position correcte pour une intégration appropriée dans l’œil. Pour l’enrichissement des précurseurs de photorécepteurs, le tri doit être basé sur des antigènes de surface cellulaire spécifiques afin d’éviter la modification du rapporteur génétique des cellules donneuses. Ici, nous montrons le tri cellulaire magnétique-associé (MACS) - enrichissement des précurseurs transplantables de photorécepteur de tige isolés de la rétine néonatale des souris rapporteurs photoréceptrices-spécifiques basées sur le marqueur de surface cellulaire CD73. L’incubation avec des anticorps anti-CD73 suivis des anticorps secondaires conjugués de micro-perle a permis l’enrichissement des précurseurs de photorécepteur de tige par MACS à approximativement 90%. Par rapport à la cytométrie en flux, macs a l’avantage qu’il peut être plus facile d’appliquer aux normes GMP et que des quantités élevées de cellules peuvent être triées dans des périodes relativement courtes. L’injection de suspensions cellulaires enrichies dans l’espace sous-rétinien de souris adultes de type sauvage a entraîné un taux d’intégration 3 fois plus élevé par rapport aux suspensions cellulaires non triées.

Afin d’évaluer la capacité des photorécepteurs de tige à s’intégrer dans la rétine de la souris, une ligne de rapporteur de souris a été utilisée, dans laquelle GFP est entraîné par la fermeture à glissière de leucine de la rétine neurale (Nrl, Nrl-GFP) promoteur11. Nrl est le premier marqueur de photorécepteurs de tige commençant son expression à E12.5 tout au long de l’âge adulte, permettant un étiquetage spécifique des cellules photoréceptrices de tige de donneur.
Pn 4 Nrl-GFP ch...

La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénération rétinienne caractérisée par la perte de photorécepteur. Ici nous décrivons une méthode pour l’enrichissement des photorécepteurs transplantables et de leur greffe sous-rétinienne chez les souris adultes.

Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de transplanter des cellules souches précurseurs de photorécepteurs enrichies dans une rétine de souris receveuse. Cela est réalisé en isolant d'abord l'œil rétinien de jeunes animaux donneurs. Dans une deuxième étape, les cellules précurseurs de photorécepteurs postnatales sont isolées de la population cellulaire rétinienne par tri cellulaire associé à un champ magnétique fondé sur le CD 73.Ensuite, les précurseurs de photorécepteurs sont transplantés dans l'espace sous-rétinien d'animaux receveurs afin de favoriser leur intégration dans la rétine du receveur. En fin de compte, le potentiel d'intégration et le comportement des cellules précurseurs de photorécepteurs transplantées peuvent être analysés par microscopie en immunofluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération rétinienne, comme quelle est la capacité des photorécepteurs transplantés à s'intégrer dans le circuit neural de l'hôte pour la restauration de la vision.Les implications de cette technique vont au-delà du traitement des maladies dégénératives de la rétine. Une fois que l'installation et l'enrichissement des précurseurs des photorécepteurs par max pourront être facilement adaptés à des conditions de bonnes pratiques de fabrication (GMP), la démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de transplantation sont difficiles à apprendre et la manipulation subtile ainsi que le positionnement précis de l'aiguille dans l'espace sous-rétinien sont cruciaux pour garantir un succès maximal et une bonne reproductibilité. Pour dissocier les rétines, commencez par rincer brièvement les têtes de souriceaux du quatrième jour postnatale dans de l'éthanol à 70 %, puis effectuez un lavage au PBS.Ensuite, transférez les têtes dans du HBSS froid pour isoler les yeux un par un. Commencez par ouvrir la paupière. Puis, à l’aide d’une paire de forceps courbes.Saisir l'organe au niveau de la région du nerf optique et retirer délicatement l'œil de son orbite. Ensuite, pour isoler la rétine, introduire la pointe d'une paire de ciseaux fermés dans le nerf optique et écarter les lames. Détacher la pigmentation rétinienne, l'épithélium et la choroïde, puis utiliser une pince courbe pour enlever le cristallin et les vaisseaux sanguins.Incuber les rétines isolées dans un tube à réaction de 1,5 millilitre contenant une solution de papaine pendant 30 à 60 minutes, dans un agitateur à 400 tr/min et à 37 degrés Celsius. Pendant l'incubation des rétines, distribuer un millilitre de solution OVO MOID dans un tube à réaction de 15 millilitres, étiqueté un, puis dans un tube à réaction de deux millilitres étiqueté deux, 60 microlitres de DNAs un, 60 microlitres de solution OVO MOID et 520 microlitres de EBSS. Après l'incubation, transférer la solution de papaine contenant les rétines partiellement digérées vers le tube à réaction deux, puis homogénéiser les rétines 10 fois à l’aide d’une pipette à embout feuilleté.Déposer délicatement la suspension de cellules uniques au-dessus de la solution OVO MOID dans le tube à réaction numéro un et centrifuger la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 300 G et à température ambiante. Ensuite, jeter le surnageant et resuspendre les cellules dans 500 microlitres de tampon max. Pour trier selon max, incuber d'abord les cellules avec 10 microgrammes par millilitre d'anticorps anti-CD 73 de rat sur de la glace.Après cinq minutes, lavez les cellules dans 10 millilitres de tampon max. Ensuite, resuspendez le culot dans 480 microlitres de tampon max, puis incubez les cellules dans 120 microlitres de microbilles magnétiques anti-RET IgG-go sur de la glace, sans agitation, ni agitation mécanique, ni mélange. Après 15 minutes, lavez les cellules dans cinq millilitres de tampon max ; lors du lavage, placez une colonne LS sur un aimant max et positionnez un filtre de préséparation sur le dessus de la colonne.Ensuite, hydratez le filtre et la colonne avec trois millilitres de tampon max. Recueillez le tampon dans un tube de 15 millilitres étiqueté W pour le lavage. Lorsque les cellules ont terminé leur centrifugation, resuspendez le culot dans 500 microlitres de tampon max et chargez les cellules dans le filtre.Ajoutez un millilitre de tampon max au-dessus des cellules, puis récupérez la fraction négative dans un tube à réaction de 15 millilitres étiqueté « minus » pour négatif. Ensuite, ajoutez trois millilitres de tampon max sur la colonne trois fois de suite pour la laver. Retirez maintenant la colonne du support magnétique.Installez-le au-dessus d'un tube à réaction de 15 millilitres étiqueté « plus » pour le témoin positif. Introduisez rapidement 5 millilitres de tampon max dans la colonne. Faites passer tout le tampon à travers la colonne, puis, après avoir centrifugé la fraction positive, remettez en suspension le culot dans 500 microlitres de tampon max.Placer les cellules à quatre degrés Celsius et les compter. Ensuite, ajuster la concentration à deux fois 10 puissance cinq cellules par microlitre dans du tampon max, en maintenant les cellules à quatre degrés Celsius pour la transplantation des précurseurs de photorécepteurs isolés. Dilater les pupilles d'une souris adulte sédatée à l'aide d'une goutte de phényléphrine et de tropicamide, pendant que les pupilles se dilatent. Utiliser un stylo diamanté pour découper une lame de couverture en morceaux d'environ cinq par cinq millimètres.Placez la souris sous un microscope stéréo, immobilisez l’animal dans un support crânien pour souris, puis appliquez une goutte de gel ICIC sur chaque œil afin d’éviter le dessèchement. Utilisez ensuite une aiguille de calibre 30 et de demi-pouce pour percer un petit trou au niveau de la limite entre la sclérotique et la cornée. Placez alors l’un des morceaux de lame de couverture de cinq millimètres sur cinq millimètres sur la cornée, ce qui permet une visualisation directe de la rétine.Ensuite, rincez plusieurs fois une seringue microlitrique pré-stérilisée avec de l'eau déionisée stérile, puis chargez la seringue avec l'une des suspensions cellulaires triées. Orientez l'aiguille diagonalement à travers la conjonctive et la sclère, en la plaçant dans la moitié nasale de la rétine. Percez ensuite délicatement la rétine pour atteindre l'espace sous-rétinien et injectez les cellules.Confirmez le détachement kystique uniforme de la rétine, qui doit couvrir environ un quart de la surface rétinienne sans aucun saignement. Ensuite, retirez doucement la seringue et rincez-la plusieurs fois supplémentaires avec de l'eau ionisée. Enfin, relâchez la souris du dispositif de contention.Injecter l'animal avec du chlorure d'aamaz pour inverser les effets de l'anesthésie et le laisser récupérer dans une chambre sombre à 25 degrés Celsius afin d'évaluer la capacité des photorécepteurs en bâtonnets à s'intégrer dans la rétine de la souris. Une lignée rapporteuse de souris a été utilisée, dans laquelle l'expression de la GFP est contrôlée par le promoteur du gène NRL (neural retina leucine zipper), comme illustré dans ces histogrammes. La suspension initiale de cellules rétiniennes contenait 30,4 % de photorécepteurs en bâtonnets GFP positifs.Après le tri et l'enrichissement fondés sur CD 73, un taux d'enrichissement allant jusqu'à 86,9 % des précurseurs de photorécepteurs positifs pour GFP a été observé dans la fraction positive pour CD 73, contre seulement 9,9 % des cellules positives pour GFP dans la fraction négative pour CD 73. L'enrichissement des cellules positives pour N-R-L-G-F-P après tri fondé sur CD 73 est également observé.Après la mise en culture in vitro, les cellules donneuses demeurent au site d'injection défini par la rétine hôte détachée en bulle et s'intègrent dans la couche nucléaire externe de la rétine hôte, en acquérant la morphologie de photorécepteurs matures. Le tri cellulaire magnétique associé maître peut être réalisé en moins de deux heures si les manipulations sont correctes. Cette procédure peut également être adaptée pour l'enrichissement de photorécepteurs dérivés de cellules souches ou même d'autres cellules souches rétiniennes.Étant donné la disponibilité d'anticorps spécifiques permettant de répondre à des questions supplémentaires concernant la restauration ou le sauvetage par transmutation cellulaire de la rétine, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de transplanter des cellules souches précurseurs photoréceptrices enrichies en photo max dans l'espace sous-rétinien de souris receveuses.

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