Analyse quantitative et caractérisation des lésions d'athérosclérose dans le murin aortique Sinus

L'objectif général de cette procédure est de caractériser et de quantifier les lésions athéroscléreuses dans le sinus aortique du cœur infarctus. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant un cœur prélevé afin de séparer la portion apicale et de localiser le sinus aortique. Ensuite, des blocs de paraffine sont préparés à partir de la portion apicale du cœur traitée.

Ensuite, le sinus aortique est sectionné et monté sur des lames. Enfin, les coupes tissulaires sont colorées. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant des tailles et des compositions différentes des lésions athéroscléreuses par analyse histochimique et immunohistochimique.

La procédure sera démontrée par Daniel Venga penal, étudiant diplômé de mon laboratoire. Le comité d'éthique de la recherche sur les animaux de l'Université McMaster a approuvé préalablement toutes les procédures décrites ici après avoir anesthésié une souris LDLR double négative, prélevé le sang, euthanasié et fixé l'animal avant d'isoler le cœur selon le protocole décrit. À l'aide d'un scalpel, effectuez une incision transversale sur le cœur perpendiculairement à l'aorte ascendante. Placez la portion apicale ou supérieure du cœur dans une cassette d'inclusion et immergez-la dans du Formin.

Ensuite, placer la cassette dans un appareil de traitement des tissus et effectuer le traitement toute la nuit. À l’aide du programme décrit dans le protocole écrit, faire fondre les moules d’histologie avec de la paraffine à 62 degrés Celsius toute la nuit. Placer chaque tissu traité dans un moule d’histologie profond, en veillant à ce que l’interface du cœur touche le fond du moule, puis verser de la paraffine fondue afin de remplir complètement le moule.

Utilisez une cassette en plastique étiquetée pour recouvrir le moule. Après refroidissement des moules sur de la glace ou une surface froide, séparez le bloc du moule afin de découper l'aorte. Placez le bloc dans le porte-échantillon du microtome de manière à ce qu'il puisse être sectionné de l'intérieur vers le sommet du cœur.

Régler le microtome sur 10 micromètres et sectionner le cœur. Déposer les sections sur une lame de verre et les examiner au microscope optique afin de déterminer leur position et leur orientation. Le sinus doit apparaître comme trois bases valvulaires bipartites avec des feuillets attachés.

Lorsqu'une ou deux valvules du sinus aortique deviennent visibles, ajuster l'angle du bloc au besoin. Une fois les valvules atteintes, régler le microtome pour effectuer des coupes de quatre à cinq micromètres. Monter les 10 premières sections chacune au sommet de lames en verre individuelles, puis monter chaque groupe subséquent de 10 sections sur l'emplacement suivant.

Sur les lames. Continuer à prélever des sections jusqu'à ce qu'aucune lésion athéroscléreuse ne soit observée. Pour colorer les sections à l'hématine et à l'éosine afin de visualiser les lésions, placer les lames dans un séchoir à air pendant huit minutes.

Ensuite, déparaffinez les sections en utilisant du xylène pour les laver quatre fois pendant trois minutes chacune. Lavez les lames dans de l'éthanol à 100 % trois fois pendant trois minutes chacune. Puis dans de l'éthanol à 70 % et à 50 %.

Trois fois pendant trois minutes chacune. Utiliser de l'eau distillée pour rincer les lames, puis les immerger dans l'hématine de MA pendant 15 minutes.

Laver et faire couler. Eau du robinet pendant cinq minutes. Puis laver à l'eau distillée pendant cinq minutes après avoir immergé dans l'éosine Y pendant une à cinq minutes.

Laver avec de l'eau distillée trois fois pendant cinq minutes chacune. 50 % éthanol deux fois pendant deux minutes chacune. Ensuite, 70 % éthanol trois fois pendant deux minutes par lavage, et 100 % éthanol.

Trois fois pendant deux minutes chacune. Puis laver et traiter au xylène quatre fois pendant deux minutes chacune. Utiliser un milieu de montage à base de xylène pour monter les coupes et capturer les images au microscope optique.

Utilisez un logiciel d'imagerie pour identifier et quantifier les lésions, qui peuvent être déterminées à des distances spécifiques du sinus aortique par intervalles de 40 à 50 microns, selon l'épaisseur des sections ; reportez-vous au protocole écrit pour les colorations immunohistochimiques et par immunofluorescence. Des souris LDLR positives âgées de cinq semaines ont reçu une alimentation standard ou une alimentation riche en lipides pendant 10 semaines avant que leurs cœurs ne soient fixés, isolés et sectionnés comme illustré ici.

Lorsque les souris reçoivent une alimentation standard en pain d'élevage, le développement de l'athérosclérose est très limité et peut ne pas être détectable à 15 semaines d'âge. Un régime riche en graisses accélère considérablement l'athérogenèse dans ce modèle et induit la formation de grandes lésions avancées contenant des cœurs acellulaires néoformés et des capes fibreuses. Les lésions athéroscléreuses peuvent être davantage caractérisées par une coloration permettant la détection de types cellulaires spécifiques et de facteurs définissant les stades du développement des lésions.

L'infiltration des monocytes dans l'intima représente l'un des premiers événements de l'athérogenèse de l'intima. Les monocytes se différencient en macrophages qui englobent les débris cellulaires et les lipides. Les macrophages chargés de lipides, appelés cellules mousses, forment une stries graisseuse dans la paroi artérielle visible ici.

Les cellules en mousse macrophagiques peuvent être détectées à tous les stades du développement de la lésion par coloration avec des anticorps dirigés contre des marqueurs macrophagiques spécifiques tels que F four 80 et MAC three. Les cellules musculaires lisses vasculaires, ou v SMCs, sont confinées à la couche médiale d'une artère saine. Les VSCs sont induites à migrer et à proliférer dans l'intima au cours du développement d'une lésion avancée.

Comme on peut le voir dans ce panneau, les cellules musculaires lisses vasculaires peuvent être identifiées par une coloration avec un anticorps dirigé contre l'actine alpha après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies cardiovasculaires pour explorer le développement et la progression des lésions athéroscléreuses chez les rongeurs.