Analyse quantitative et caractérisation des lésions d'athérosclérose dans le murin aortique Sinus

L’objectif global de cette procédure est de caractériser et de quantifier les lésions athéroscléreuses du sinus aortique de l’IM. Ceci est accompli en disséquant d’abord un cœur extrait afin de séparer la partie apicale et de localiser le sinus aortique. Ensuite, des blocs de paraffine sont préparés avec la partie apicale traitée du cœur.

Ensuite, le sinus aortique est sectionné et monté sur des lames. Enfin, les sections de tissu sont colorées. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent différentes tailles et compositions de lésions athéroscléreuses grâce à l’analyse histochimique et immunohistochimique.

La démonstration de la procédure sera assurée par Daniel Venga Penal, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Le comité d’éthique de la recherche animale de l’Université McMaster a pré-approuvé toutes les procédures décrites dans le présent document : après avoir anesthésié une souris LDLR double négatif et extrait le sang, euthanasié et réparé avant d’isoler le cœur selon le protocole textuel, utilisez un scalpel pour faire une coupe transversale sur le cœur perpendiculaire à l’aorte ascendante. Placez la partie apicale ou supérieure du cœur dans une cassette d’enrobage et immergez-la dans Formin.

Placez ensuite la cassette dans un processeur de papier tissu et traitez pendant la nuit. En utilisant le programme décrit dans le protocole de texte pour les moisissures histologiques, faites fondre la cire de paraffine pendant la nuit à 62 degrés Celsius. Placez chaque tissu de traitement dans un moule d’histologie profond, en vous assurant que l’interface du cœur touche la base du moule, puis versez de la cire de paraffine fondue pour remplir complètement le moule.

Utilisez une cassette en plastique étiquetée pour couvrir le moule. Après avoir refroidi les moules sur de la glace ou une surface froide, séparez le bloc du moule pour sectionner l’aorte. Positionnez le bloc dans le porte-échantillon du microtome de manière à ce qu’il puisse être sectionné de l’intérieur vers le haut du cœur.

Ajustez le microtome à 10 microns et sectionnez le cœur. Prélevez des sections sur une lame de verre et examinez-les au microscope optique pour déterminer la position et l’orientation. Le sinus doit apparaître sous la forme de trois bases valvulaires bipartites avec des folioles attachées.

Lorsqu’une ou deux valves du sinus aortique deviennent évidentes, ajustez l’angle du bloc si nécessaire. Lorsque les vannes sont atteintes, ajustez le microtome pour le couper de quatre à cinq microns. Montage des 10 premières sections chacune en haut de lames de verre individuelles, puis montage de chaque groupe suivant de 10 sections sur la position suivante.

Sur les diapositives. Continuez à prélever des coupes jusqu’à ce qu’aucune lésion athéroscléreuse ne soit observée. Pour colorer des sections avec de l’hématine et de l’éoin pour visualiser les lésions, mettez les lames dans un séchoir à air pendant huit minutes.

Ensuite, déparisez les sections en utilisant du xylène pour les laver quatre fois pendant trois minutes chacune. Lavez les lames à 100 % d’éthanol trois fois pendant trois minutes chacune. Puis 70 % d’éthanol et 50 % d’éthanol.

Trois fois pendant trois minutes chacune. Utilisez de l’eau distillée pour rincer les lames, puis immergez-les dedans. MA pendant 15 minutes.

Laver et couler. Eau du robinet pendant cinq minutes. Ensuite, laver et distiller de l’eau pendant cinq minutes après l’immersion dans l’eau Y pendant une à cinq minutes.

Lavez et distillez de l’eau trois fois pendant cinq minutes chacune. 50 % d’éthanol deux fois pendant deux minutes chacune. Ensuite, 70 % d’éthanol trois fois pendant deux minutes à chaque lavage, et 100 % d’éthanol.

Trois fois pendant deux minutes chacune. Ensuite, lavez et xylène quatre fois pendant deux minutes chacune. Utilisez un support de montage à base de xylène pour monter les coupes et capturer des images au microscope optique.

Utilisez un logiciel d’imagerie pour identifier et quantifier les lésions, qui peuvent être déterminées à des distances spécifiques du sinus aortique à des intervalles de 40 à 50 microns, en fonction de l’épaisseur des sections, reportez-vous au protocole texte pour la coloration immunohistochimique et immunofluorescence. LDLR de cinq semaines. Les souris positives ont été nourries avec un régime standard ou un régime riche en graisses pendant 10 semaines avant que leurs cœurs ne soient réparés, isolés et sectionnés, comme indiqué ici.

Lorsque les souris sont nourries avec un régime alimentaire standard, le développement de l’athérosclérose est très limité et peut ne pas être détectable à 15 semaines sur huit. Un régime riche en graisses accélère significativement l’athérogenèse dans ce modèle et induit la formation de grandes lésions avancées contenant des noyaux acellulaires chroniques et des coiffes fibreuses. Les lésions athéroscléreuses peuvent être caractérisées par une coloration pour la présence de types de cellules spécifiques et de facteurs qui définissent les stades de développement des lésions.

L’infiltration de monocytes dans l’intima représente l’un des premiers événements de l’athérogenèse intima. Les monocytes se différencient en macrophages qui engloutissent les débris cellulaires et les lipides. Les macrophages engorgés de lipides, connus sous le nom de cellules spumeuses, créent une traînée graisseuse dans la paroi artérielle que l’on voit ici.

Les cellules spumeuses des macrophages peuvent être détectées à tous les stades du développement des lésions par coloration avec des anticorps contre des marqueurs macrophages spécifiques tels que F quatre 80 et MAC trois. Les cellules musculaires lisses vasculaires ou CML V sont confinées à la couche médiale d’une artère saine. Les CSV sont induites à migrer et à proliférer dans l’intima lors du développement d’une lésion avancée.

Comme on peut le voir dans ce panel, les CMS V peuvent être identifiés par coloration avec un anticorps contre l’alpha-actine après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine des maladies cardiovasculaires d’explorer le développement et la progression des lésions athéroscléreuses dans les bâtonnets.