Amélioration de la méthode pour la préparation d'une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

Cette procédure vise à simuler in vitro la barrière hémato-encéphalique par coculture d’astrocytes et de cellules endothéliales sur les côtés opposés d’une membrane poreuse. Enduire d’abord la surface luminale de la membrane poreuse d’une matrice extracellulaire. Les protéines comme le collagène s’adaptent à l’insert inversé avec un tube externe en silicone et un bouchon interne en silicone pour créer un puits amovible au-dessus de la surface abluminale de la membrane.

Ensemencez maintenant les cellules astrocytaires sur l’insert inversé afin qu’elles adhèrent à la surface abluminale. Retirez ensuite le tube et placez l’insert dans son orientation normale à l’intérieur d’un puits rempli de moyen. Ensuite, ensemencez les cellules endothéliales dans le compartiment luminal de l’insert et co-cultivez avec les astrocytes opposés.

En fin de compte, le passage de traceurs fluorescents ou l’enregistrement de la résistance électrique transendothéliale est utilisé pour mesurer les changements de perméabilité de la BHE in vitro en réponse à divers agents stimulants. La démonstration de cette procédure sera assurée par M. Barry Nigo, post-doctorant dans mon laboratoire, qui, au cours de sa thèse, a développé ce protocole d’ensemencement modifié que nous avons utilisé pour simuler la barrière hémato-encéphalique. Nous avons d’abord eu une idée de cette procédure après avoir testé des méthodes d’assise plus rudimentaires et éprouvé une grande frustration avec les fuites de fluide à travers la pause, ainsi que les petits volumes moyens.

Cela a dicté des périodes d’assise des astrocytes courtes et insuffisantes, que nous essayons de résoudre dans notre procédure. Placez les inserts de culture tissulaire dans les puits d’une plaque de 24 puits. Ajoutez ensuite 50 microlitres de collagène de rat à 132 microgrammes par millilitre, un pour enrober la surface luminale des inserts, incubez pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius afin d’éliminer tout acide résiduel, lavez les côtés abluminal et luminal des inserts avec de l’eau distillée doublement.

Ensuite, inversez les inserts et ajustez doucement un petit morceau de tube en silicone élastique autour du bord de la membrane poreuse. Essentiellement, il s’agit de créer un nouveau puits au-dessus de la surface abluminale. Pour sceller le dessous.

Préparez un bouchon en tube de silicone scellé à une extrémité avec l’embout coupé d’un tube PCR de 0,2 millilitre. Maintenant, à l’aide d’une pince stérile, insérez le bouchon en silicone dans la cavité luminale et faites-le avancer jusqu’à ce qu’il atteigne jusqu’à environ un à deux millimètres de la membrane. Ensuite, grainez, 40 000 astrocytes dans 200 microlitres de leur milieu d’entretien directement dans le silicone bien au-dessus de la surface de la membrane abluminale.

Pour surveiller l’état d’adhérence des astrocytes, utilisez une plaque standard à 96 puits car elle a la même surface que l’insert de 6,5 millimètres et le permet. Visualisation plus facile des cellules par microscopie à contraste de phase graine, un volume identique de la suspension de cellules astrocytaires dans la plaque huit à 96 puits. Cela sera surveillé au fil du temps pour déterminer quand les astrocytes dans le puits 96 et par extension dans la membrane d’insertion ont suffisamment adhéré pour maintenir la stérilité.

Transportez les inserts assemblés entre deux plaques à six puits pour minimiser l’exposition à l’air non filtré. Placez les cellules dans l’incubateur pour permettre aux astrocytes d’adhérer. Placez également la plaque de contrôle 96 Well dans l’incubateur à ce moment-là.

Après environ quatre heures, vérifiez bien le contrôle 96 pour voir si les astrocytes ont adhéré. Si c’est le cas, transférez l’ensemble d’insertion dans le capot de culture tissulaire. Retirez délicatement le tube et les bouchons externes en silicone.

Remettez ensuite les inserts à l’orientation verticale normale dans des puits contenant 800 microlitres par puits de milieu d’entretien des cellules endothéliales. Observez 20 000 cellules endothéliales cérébrales dans 200 microlitres sur la co-culture de surface luminale recouverte de collagène pendant trois jours dans un milieu BEC sans aucun changement de milieu. Avant l’expérimentation.

Lavez les tubes et les bouchons en silicone dans de l’éthanol avant l’autoclave pour une utilisation ultérieure. Pour stimuler la barrière hémato-cérébrale in vitro, remplacez d’abord les milieux abluminal et luminal par 600 microlitres et 100 microlitres de milieu becs sans sérum respectivement. Aspirez le nettoyant luminal et remplacez-le par 100 microlitres de milieu sans sérum contenant des agents stimulants.

Si vous induisez la BHE in vitro à partir du compartiment astrocytaire, aspirez le milieu abluminal et remplacez-le par 600 microlitres de sérum libre. Les milieux contenant des agents stimulants poursuivent les tests de perméabilité paracellulaires ou transcellulaires standard des traceurs de marquage afin d’établir un modèle de barrière hémato-encéphalique par contact humain. Les astrocytes et les cellules endothéliales du cerveau immortalisés par l’homme sont cultivés sur des membranes poreuses de trois microns qui permettent le passage des astrocytes et des pieds pour le contact avec les cellules endothéliales.

La méthode a permis une période d’ensemencement ininterrompue optimale des astrocytes et des becs, qui à leur tour se fixent fortement à la surface poreuse avec une perte de cellules minimale et atteignent une co-fluidité en trois jours. Après l’ensemencement. Les deux types de cellules conservent leurs marqueurs cellulaires spécifiques sur les membranes poreuses, comme l’indiquent les profils d’expression de la protéine acide fibrillaire gliale GFAP dans les SVG et le facteur von Vand VWF NEC.

Conformément à la caractéristique la plus fondamentale d’un modèle de BHE de contact, le NFE astrocytaire peut passer à travers les pores de trois microns dans le compartiment luminal. Ainsi, un contact peut potentiellement exister entre les SVG et les BES assis sur des pores de cette dimension. De plus, l’imagerie MEB indique que les SVG et les BBC étaient capables de se développer directement sur les pores de la membrane, un phénomène qui contribue artificiellement à la fonction de barrière physique des modèles de contact de BHE in vitro.

Dans cette étude, le modèle de la BHE par contact humain est utilisé pour explorer l’effet de l’agent fibrinolytique TPAA sur la BHE. Ces études in vitro confirment que le TPA a effectivement augmenté la perméabilité de la BHE intacte en fonction de la concentration et du temps, qui se situaient toutes deux dans une plage pharmacologique pertinente. Des changements morphologiques spectaculaires des astrocytes SVG sont évidents sur les membranes poreuses après l’exposition à la TPA, ce qui suggère que la réponse astrocytaire à la TPA sous-tend l’ouverture de la BHE induite par la TPA.

Cette méthode a joué un rôle clé dans notre recherche, qui visait à étudier comment la barrière hémato-encéphalique réagit au médicament thrombolytique TPAA utilisé chez les patients victimes d’un AVC pour dissoudre les caillots sanguins. C’est la première démonstration de cette méthode dans la littérature, et nous espérons que d’autres chercheurs pourront l’adopter à leurs propres fins.