A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes

L’objectif global de cette procédure est de mettre en place un système de culture qui récapitule étroitement le microenvironnement cellulaire et intracellulaire de la moelle osseuse humaine. Tout d’abord, la surface d’un puits de culture tissulaire est recouverte de la matrice industrielle. Ensuite, les cellules mononucléées de la moelle osseuse, ou d’autres cellules d’intérêt, sont mélangées à la matrice de la moelle osseuse.

Plus tard, la matrice industrielle est retirée et le mélange de matrice cellulaire est ajouté au puits. Une fois que la matrice s’est gélifiée, elle est recouverte d’un milieu de croissance. En fin de compte, les cellules peuvent être visualisées directement dans la matrice ou peuvent être isolées pour des analyses en aval par rapport aux méthodes existantes de culture des cellules.

Par exemple, les méthodes standard de culture tissulaire ou les modèles de co-culture où les cellules sont cultivées sur du plastique. Le principal avantage de l’utilisation d’une méthode de culture 3D est que les cellules sont cultivées dans le microenvironnement physiologique et vous permet donc d’étudier les cellules dans les conditions natives du tissu. Préparez une plaque de 48 puits dans laquelle les cellules seront plaquées.

En ajoutant d’abord 65 microlitres de solution de revêtement industriel dans chacun, répartissez uniformément la solution pour couvrir toute la surface du puits. Cette méthode est également adaptable à d’autres surfaces. Laissez les plaques incuber à température ambiante pendant au moins 30 minutes.

Pendant ce temps, préparez la suspension cellulaire de 50 000 cellules par microlitre de PBS. Préparez suffisamment pour ajouter 10 microlitres dans chaque puits, puis dans un tube einor, mélangez la suspension cellulaire avec 100 microlitres de matrice osseuse reconstruite par. Bien mélanger doucement et éviter d’introduire des bulles.

Gardez le mélange sur de la glace afin que la matrice ne se gélifie pas lorsque la plaque est terminée. Pendant l’incubation, retirer toute la solution d’enrobage liquide et dote par aspiration. Ajoutez ensuite 100 microlitres de suspension cellulaire bien mélangée avec matrice à chacun.

Inclinez rapidement la plaque à l’aide d’une pipette pour couvrir uniformément toute la surface du puits. Continuez à mélanger la suspension entre les remplissages de puits car les cellules s’agglutineront une fois complètement chargées. Incuber la plaque pendant 30 à 60 minutes sans agitation jusqu’à ce que la matrice se solidifie.

Ensuite, préchauffez le milieu de croissance de la moelle osseuse dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes d’incubation, vérifiez que la matrice a bien pris. Une bonne matrice forme une couche molle semblable à du gel qui ne bouge pas lorsque la plaque est inclinée.

Lorsque la matrice est prête, superposez-la délicatement d’un millilitre de goutte à goutte à l’aide d’une pipette sérologique. Ensuite, retournez la culture de matrice osseuse reconstruite assemblée dans l’incubateur jusqu’à 30 jours sans modification du milieu. Si un changement de support est nécessaire, ne changez que la moitié du support à la fois.

Retirez le milieu doucement sans perturber la couche de matrice. Inclinez la plaque et égouttez doucement le milieu à l’aide d’une pipette. N’aspirez pas le support sur la matrice ultérieurement.

Lors de la coloration des cellules. Utilisez cette technique pour les changements de solution. Pour retirer des médias des puits d’une culture 3D, il est très crucial qu’ils soient retirés du côté du puits.

Sinon, la matrice sera perturbée et les cellules risquent d’être perdues en s’en tenant à la même technique. Lavez les cellules deux fois avec un XPBS stérile. Ajoutez ensuite un demi-millilitre de solution de récupération de cellules glacées à chacun.

Eh bien, retirez toute la couche de matrice ainsi que les cellules en pipetant vigoureusement de haut en bas. Pour chacun, transférez bien la collection dans un micro tube à centrifuger et placez-la sur de la glace. Ajoutez ensuite un demi-millilitre supplémentaire de solution de récupération dans le même puits et récupérez tout le matériau restant.

Vortex toutes les collections, et incubez-les pendant une heure sur glace. Pendant l’heure, faites tourbillonner les tubes toutes les 15 minutes pour faciliter la libération des cellules de la matrice. Au bout d’une heure, vérifiez que le mélange ne présente pas d’amas de matrice visibles.

Il ne doit y en avoir aucun, mais s’il y en a, transférez le mélange dans un tube plus grand et ajoutez deux à cinq millilitres supplémentaires de solution de récupération cellulaire. Ensuite, incubez les cellules pendant encore 30 à 60 minutes. Vortex périodiquement, et vérifiez à nouveau l’absence d’amas de matrice.

Lorsque la matrice n’est plus agglomérée. Centrifugez le mélange à 1000 tr/min pendant cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez ensuite le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de XPBS froid.

Répétez la centrifugation. Remplacez le surnageant par du PBS frais et répétez le lavage. Une troisième fois.

Après le troisième lavage PBS, récupérez les cellules dans la solution appropriée pour la procédure suivante. Des cellules de moelle osseuse ont été cultivées dans une matrice osseuse reconstruite pendant 30 jours et imagées périodiquement par microscopie optique à un grossissement de 200 fois. Les éléments stromaux ont été détectés pour la première fois le cinquième jour, mais ils étaient clairement évidents le 14e jour.

Au cours de la période de culture, les cellules ont migré à travers la matrice et se sont agrégées en grappes distinctes. Des masses de cellules malignes se sont développées au fil du temps pour évaluer la composition des composants stromaux qui se développent dans la RBM. La morphologie des cellules à la transition entre la RBM et le revêtement industriel a été évaluée.

Les cellules ont été colorées pour la fibronectine, l’actine et les noyaux. Les cellules de visualisation avec une morphologie stromale se sont révélées être des ostéoblastes avec des niveaux élevés d’activité phosphatase alcaline. Ils étaient capables de minéraliser le calcium, comme déterminé par la coloration au rouge de zarine Les cellules avec une présence visible de gouttelettes lipidiques ont été identifiées comme des adipocytes sur la base d’une coloration positive à l’huile.

Les globules rouges avec des noyaux multiples occasionnels ont été reconnus comme des pré-ostéoclastes et étaient positifs pour la phosphatase acide résistante au tartrate. Après l’isolement de cellules à partir d’une culture 3D, vous pouvez faire une variété de choses. Par exemple, vous pouvez étudier les phénotypes cellulaires de diverses cellules cultivées dans le microenvironnement.

Vous pouvez étudier l’expression des gènes et des protéines et vous pouvez même déterminer quel type de molécules sont sécrétées par ces cellules dans des conditions 3D.