Name: Flux de travail sans taches V3 pour un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale en protéines dans Western Blotting (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Découvrez le flux de travail V3 pour le western blot utilisant des gels sans colorant TGX. Cette méthode offre un contrôle de charge fiable en protéines totales et améliore la quantification des protéines cibles.

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Les auteurs remercient le Dr Wolf-Dieter Stalz, le Dr Arnaud Remy, le Dr Anton Posch, la Dre Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi et Jeff Durban pour leur examen critique et leur édition de ce manuscrit. Les auteurs remercient également Allison Schwartz pour son soutien technique.

1. Préparation de l’échantillon de protéines
(Une procédure typique pour extraire des protéines de la culture cellulaire est décrite)
<ol><li>Placez le plat de culture cellulaire HeLa dans de la glace et lavez les cellules avec une solution saline tamponnée tris glacée (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM).</li>
	<li>Aspirer le TBS, puis ajouter 1 ml par tampon RIPA glacé de 100 mm (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% de désoxycholate de sodium, 0,1% SDS) complété par des inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase.</li>
	<li>Gratter les cellules adhérentes du plat à l’aide d’un grattoir à cellules en plastique froid; transférer doucement la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation pré-cool.</li>
	<li>Maintenir une agitation constante pendant 30 min à 4 °C sur un rotateur.</li>
	<li>Tourner à 16 000 x g pendant 20 min dans une centrifugeuse pré-recolée à 4 °C.</li>
	<li>Retirez délicatement le tube de la centrifugeuse et placez-le sur de la glace. Transférer le surnageant dans un tube frais conservé sur la glace et jeter le culot.</li>
	<li>Retirer un petit volume (10-20 μl) de lysat pour effectuer un dosage protéique. Déterminer la concentration en protéines pour chaque échantillon à l’aide de la trousse d’analyse RC DC.</li>
	<li>Si nécessaire, aliquotez les échantillons de protéines pour un stockage à long terme à -20 °C. Les cycles répétés de gel et de dégel provoquent la dégradation des protéines et doivent être évités.</li>
	<li>Prélever environ 20 μg de chaque échantillon, ajouter un volume égal de 2x tampon d’échantillon Laemmli (4 % de FDS, 10 % de 2-mercaptoéthanol, 20 % de glycérol, 0,004 % de bleu de bromophénol, 125 mM de Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Chauffer chaque lysat cellulaire dans un tampon d’échantillon à 95 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Centrifuger à 16 000 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min.</li>
</ol>2. Électrophorèse sur gel avec des gels sans taches (~ 30 min)
<ol><li>Prenez un critère TGX Tout gel préfabriqué sans tache KD (un gel au format midi), retirez le peigne et le ruban adhésif du bas de la cassette.</li>
	<li>Placer la cassette dans la cellule Criterion et remplir la chambre tampon supérieure intégrée avec un tampon de fonctionnement de 60 ml (Tris 25 mM, glycine 190 mM, SDS à 0,1%, pH 8,3). Rincez les puits avec un tampon en cours d’exécution.</li>
	<li>Remplissez chaque moitié du réservoir tampon inférieur avec un tampon de fonctionnement de 400 ml jusqu’à la ligne de remplissage marquée.</li>
	<li>Chargez les échantillons de protéines et les marqueurs protéiques appropriés.</li>
	<li>Placez le couvercle sur le réservoir, en alignant les bouchons banane à code couleur avec les prises correspondantes sur le couvercle.</li>
	<li>Exécutez le gel pendant ~ 30 min à 200 V ou 20 min à 300 V.</li>
</ol>3. Imagerie en gel sans tache à l’aide du système Chemidoc MP pour vérifier la qualité de la séparation des protéines (~ 5 min)
<ol><li>Retirez la cassette de gel de la cellule. Utilisez l’outil d’ouverture de la cassette de gel dans le couvercle de Criterion Cell pour ouvrir la cassette et libérer le gel.</li>
	<li>Appliquez quelques millilitres d’eau au centre du plateau d’échantillonnage UV de l’imageur ChemiDoc MP. Soulevez soigneusement le gel de la cassette et placez-le sur le plateau.</li>
	<li>Lancez le logiciel Image Lab et capturez l’image de gel sans tache (Figure 1A) avec les paramètres suivants : Application: gel sans taches Temps d’activation du gel: 1 min Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image : optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses</li>
	<li>Retirez le gel du bac à échantillons et passez immédiatement à l’étape de transfert.</li>
</ol>4. Transfert de protéines avec le système Turbo Trans-Blot (~ 10 min)
<ol><li>Ouvrez un Pack de transfert Pvdf Turbo Midi Trans-Blot; placez la pile inférieure (qui comprend la membrane) sur la base de la cassette de transfert.</li>
	<li>Placez le gel sur le dessus de la membrane, placez la pile supérieure sur le gel et déroulez des bulles.</li>
	<li>Placez le couvercle sur la base de la cassette et tournez le cadran pour le verrouiller.</li>
	<li>Insérez la cassette dans la baie du buvard.</li>
	<li>Démarrez le transfert en sélectionnant un programme Turbo prédéfini et en choisissant la taille de gel Criterion (midi), puis appuyez sur EXÉCUTER. Une course typique ne prend que 7 min.</li>
	<li>Lorsque le transfert est terminé, démontez le sandwich buvard et placez le transfert et le gel dans un récipient contenant de l’eau désionisée.</li>
</ol>5. Imagerie gel et tache sans tache à l’aide du système Chemidoc MP pour vérifier l’efficacité et la qualité du transfert de protéines (~ 5 min)
<ol><li>Placez le gel post-transfert sur le plateau d’échantillonnage de l’imageur ChemiDoc MP.</li>
	<li>Lancez le logiciel Image Lab et capturez l’image sans tache du gel post-transfert (Figure 1B) avec les paramètres suivants : Application: gel sans taches Temps d’activation du gel: aucun Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image: identique au temps d’exposition pour l’image de gel prétransfert</li>
	<li>Retirez le gel du bac d’échantillonnage, puis imaginez la tache(Figure 1C)avec les réglages suivants. Gardez la tache humide avec quelques gouttes d’eau ou TBST lors de l’imagerie. Application: tache sans taches Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image : optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses</li>
	<li>Retirez la membrane buvarde du bac d’échantillonnage et placez-la dans un récipient contenant tbst (0,1% Tween 20 dans tbs).</li>
</ol>6. Incubation des anticorps
<ol><li>Bloquer en plaçant la tache dans une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3% dans TBST à température ambiante pendant 1 heure.</li>
	<li>Incuber la tache pendant une nuit à 4 °C dans la solution contenant de l’anticorps primaire de souris élevé contre la première protéine cible et de l’anticorps primaire de lapin élevé contre la deuxième protéine cible.</li>
	<li>Versez la solution contenant l’anticorps primaire. Ensuite, lavez la tache en agitant dans 20 ml de TBST pendant 5 min. Répétez 4x pour un total de 5 lavages.</li>
	<li>Incuber pendant 1 heure à température ambiante dans la solution d’anticorps secondaire contenant un anticorps conjugué Dylight 650 goat-anti-mouse et un anticorps conjugué Dylight 549 goat-anti-rabbit.</li>
	<li>Versez la solution contenant l’anticorps primaire. Ensuite, lavez la tache en agitant dans 20 ml de TBST pendant 5 min. Répétez 4x pour un total de 5 lavages.</li>
</ol>7. Imagerie et analyse des données par le logiciel Image Lab - Normalisation des protéines totales (~ 5 min)
<ol><li>Acquérir une image fluorescente multiplexante du transfert(Figure 1E)en ouvrant un nouveau protocole multicanal, configurer trois canaux fluorescents et exécuter le protocole. Canal 1 : Application: blot Dylight 650 Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image : optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses Canal 2 : Application: tache Dylight 549 Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image : optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses Canal 3 : Application: tache sans taches Zone d’imagerie: gel critère Temps d’exposition de l’image: optimisé automatiquement pour les bandes les plus intenses</li>
	<li>Cliquez sur l’icône Normalisation dans la zone Outil Analyse (Analysis Tool Box) et cliquez sur Oui pour détecter les voies et les bandes.</li>
	<li>Sélectionnez et utilisez « Outils voies et bandes » pour apporter des ajustements aux voies et aux bandes au besoin.</li>
	<li>Sélectionnez l’image sans tache comme canal de normalisation.</li>
	<li>Sélectionnez Outils d’analyse MW et attribuez les voies standard MW en cochant les cases en dessous.</li>
	<li>Pour afficher les volumes normalisés, cliquez sur la table d’analyse dans la barre d’outils. Tous les calculs seront effectués automatiquement par le logiciel, y compris le facteur de normalisation et les volumes normalisés. Les valeurs d’intensité de la bande protéique cible sont maintenant ajustées pour tenir compte de la variation de la charge protéique. Cela permettra des comparaisons précises des protéines cibles parmi les échantillons.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond et Ning Liu sont des employés de Bio-Rad Laboratories, Inc.

Le protocole V3 sans taches décrit ci-dessus est pour multiplexer le buvard occidental fluorescent. Il peut également être appliqué dans le western blotting en utilisant la détection chemiluminescente. Dans le protocole western de tache fluorescent multiplex, les images de tache-libre de tache sont acquises à deux points de temps : 1) juste après le transfert de protéine ; 2) à l’étape d’imagerie fluorescente multiplex après incubation d’anticorps. La première image sans tache est utilisée pour calculer l’efficacité de transfert et la seconde image sans tache est utilisée comme contrôle de chargement. Lorsque la méthode chemiluminescente est appliquée, il n’est pas possible de prendre une image multiplex pour les signaux sans tache et les protéines cibles, car le signal chimioluminescent apparaîtra également dans le canal sans tache. Dans ce cas, nous recommandons d’utiliser l’image sans tache prise juste après l’étape de transfert de protéine pour le contrôle de chargement et l’analyse de normalisation.
Le flux de travail western V3 offre les avantages uniques suivants par rapport au flux de travail western blot traditionnel qui utilise des protéines de gestion interne comme contrôles de chargement :
Tout d’abord, le flux de travail V3 fournit un contrôle de chargement pratique, pratique et plus fiable pour valider les changements dans le niveau de la protéine d’intérêt. Le protocole V3 utilise un contrôle de charge totale en protéines pour normaliser le niveau de la protéine d’intérêt mesurée dans chaque échantillon. Il évite deux pièges de l’utilisation des protéines d’entretien ménager comme contrôles de charge: immunodétection saturée et niveaux d’expression de protéines de ménage incohérents parmi les échantillons dans certaines conditions expérimentales. Il n’est plus nécessaire de décaper et de réprouiller les étapes avec des anticorps dirigés contre l’entretien ménager. En utilisant la technologie sans tache, il n’est pas nécessaire de tacher et de détaper une tache avec des taches telles que Coomassie ou Sypro Ruby pour la mesure des protéines totales. Il ne faut que quelques secondes pour acquérir une image de tache et environ 5 minutes pour effectuer la normalisation totale des protéines à l’aide du logiciel Image Lab.
Deuxièmement, le flux de travail V3 permet aux scientifiques de mieux contrôler la procédure occidentale car il rend la procédure plus transparente et introduit plusieurs points de contrôle pour le contrôle de la qualité. Avec l’aide de la technologie sans taches, les chercheurs peuvent visualiser leurs échantillons de protéines sur le gel et la tache. Les scientifiques peuvent évaluer l’intégrité des échantillons de protéines (dégradées ou non), la qualité de la séparation (précipitée ou non), l’efficacité du transfert et la qualité du transfert (même le transfert ou non). Ces points de contrôle aident les recherches à mettre fin à l’expérience lorsqu’elles voient de gros défauts dans le processus et évitent de perdre du temps sur de mauvais échantillons et des taches. Cette technologie aide également les scientifiques à évaluer s’il y a une quantité importante de perte de protéines après le décapage de la membrane et si le transfert convient pour réprouillar une cible différente 4.
Voici quelques conseils pour garantir une bonne expérience et des données de qualité à l’aide du flux de travail V3 western.
<ol><li>Imagez le gel immédiatement après la course du gel. Ne trempez pas le gel dans un tampon avant la première imagerie de la procédure, car il pourrait laver le composé de coloration.</li>
	<li>Utilisez la même zone d’imagerie pour acquérir toutes les images du protocole. Cela permettra au logiciel de superposer des images pour l’analyse de données telles que la normalisation des protéines totales.</li>
	<li>Gardez le temps d’exposition cohérent lors de l’imagerie des gels prétransfert et post-transfert. Cela permettra au logiciel de mesurer quantitativement l’efficacité du transfert.</li>
	<li>Gardez la membrane humide avec quelques gouttes d’eau ou tbst lors de l’acquisition de l’image de tache. Cela évitera d’éventuels problèmes de fond sales pour la détection des protéines cibles.</li>
	<li>Utilisez une membrane PVDF à faible fluorescent pour multiplexer le buvard occidental fluorescent.</li>
</ol>Il est important de noter que la molécule sans tache après activation UV est irréversiblement liée aux résidus de tryptophane. Cette modification irréversible peut potentiellement affecter la reconnaissance d’antigène lors de l’utilisation d’anticorps monoclonaux si l’épitope contient du tryptophane. Il est peu probable que les anticorps polyclonaux soient affectés parce qu’ils reconnaissent des épitopes multiples sur l’antigène. Les molécules non liées sans tache sont facilement lavées du gel et de la membrane et n’interféreront donc pas avec les interactions anticorps-antigène.
En conclusion, le flux de travail western V3 rend le processus western blot plus rapide, plus transparent, quantitatif et plus fiable. Les chercheurs peuvent maintenant facilement appliquer le contrôle de la charge totale en protéines dans une expérience western blot pour rendre leurs données plus fiables. Le flux de travail sans taches V3 a été adopté par un certain nombre de laboratoires, et leurs publications ont démontré que les revues acceptent les données sans taches comme contrôle de chargement dans western blot22,17,7,8,5,23,18,15.

Western blot est une technique très utile9, cependant, il y a deux défis majeurs avec western blotting: processus long et laborieux et la qualité des données. Un protocole traditionnel nécessite environ 2 jours. Il implique de nombreuses étapes, y compris la préparation de l’échantillon, la coulée de gel, l’électrophorèse et le transfert de protéines, le blocage de la membrane suivi de l’incubation d’anticorps, l’imagerie et, bien souvent, le décapage, la réprobation et enfin l’analyse des données. Tout au long de ce processus, il n’y a pas d’outils fiables et flexibles pour le contrôle des processus. En tant que tel, des erreurs peuvent être introduites à chaque étape, et ces erreurs ont le potentiel de générer des artefacts de données ; par conséquent, les contrôles de chargement sont essentiels dans le western blotting pour identifier et corriger les erreurs. Le contrôle de la charge se fait généralement en vérifiant le niveau de protéines d’une protéine de référence dans chaque échantillon pour voir si elle est présentée de manière égale. Les gens utilisent souvent des protéines d’entretien ménager, telles que la β-actine, la β-tubuline, le GAPDH, comme contrôle de la charge. 
La qualité des données sur le transfert western dépend d’un contrôle fiable du chargement. Mais il y a deux préoccupations légitimes lors de l’utilisation de protéines de ménage pour les contrôles de charge : 1) l’immunodétection à base d’anticorps des bandes de protéines de ménage sont souvent saturées et donc on ne peut pas distinguer les différences de charge entre les échantillons30; 2) le niveau d’expression des protéines d’entretien ménager peut varier dans les échantillons dans certaines conditions expérimentales, par exemple, le traitement de l’ARNsi, la mort cellulaire, la différenciation cellulaire, etc.11,28,3,6,10,21. En raison de ces préoccupations, les revues scientifiques exigent maintenant que « pour les comparaisons quantitatives, des réactifs, des contrôles et des méthodes d’imagerie appropriés avec des plages de signaux linéaires devraient être utilisés » (ligne directrice sur la nature). De même, les rédacteurs en chef du Journal of Clinical Investigation demandent des contrôles de chargement plus fiables24. Pour ces raisons, une protéine d’entretien doit être validée afin d’être utilisée comme contrôle de charge. Tout d’abord, il faut s’assurer qu’il est mesuré dans la plage dynamique linéaire de la méthode d’immunodétection14,29. Deuxièmement, il faut s’assurer qu’il est exprimé de manière cohérente dans tous les échantillons26,31,25,19,20.
Une solution alternative à un contrôle de charge fiable consiste à utiliser la mesure des protéines totales à partir de la tache. Certains chercheurs ont taché les taches avec des taches de protéines totales, telles que Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S, et la technologie sans taches, pour mesurer le signal de protéines totales dans chaque voie comme contrôle de charge16,20,13,27,1,4,12. Le contrôle de la charge totale en protéines évite les pièges associés aux protéines d’entretien ménager. Tout d’abord, c’est un reflet fidèle de la quantité de protéines chargée pour chaque échantillon. Deuxièmement, la coloration protéique totale présente une excellente plage dynamique linéaire dans la plage de charge commune pour l’analyse western blot (protéine 10-50 μg d’un lysat cellulaire complexe) et différencie avec précision la différence de charge entre les échantillons12.
La technologie sans tache est une nouvelle méthode de coloration des protéines totales où un composé unique est mélangé dans une solution de gel d’acrylamide et distribué uniformément dans le gel coulé. Une fois l’électrophorèse terminée, le gel est exposé à la lumière UV pendant au moins 1 min afin que le composé de coloration réagisse avec les résidus de tryptophane dans la protéine. Les protéines deviennent excitables sous la lumière UV pour donner un signal fluorescent fort qui peut être visualisé et quantifié dans un imageur sans tache tel que le système ChemiDoc MP. Le composé sans tache lui-même, cependant, n’absorbe pas la lumière UV, ce qui entraîne un faible fond de l’image du gel. La modification des résidus de tryptophane est irréversible et les protéines peuvent être visualisées non seulement dans le gel, mais aussi sur la tache à tout moment après le transfert de protéines.
La technologie sans taches est appliquée dans le flux de travail V3 Western (Figure 1) pour répondre aux principales plaintes concernant le flux de travail traditionnel, en particulier les préoccupations liées à l’utilisation de protéines d’entretien ménager comme contrôles de chargement. En utilisant ce flux de travail, on pourrait: 1) exécuter un gel en environ 20-30 min, 2) vérifier l’intégrité de l’échantillon et la qualité de la séparation des protéines en 5 min après l’exécution du gel; 3) transférer des protéines en 3-10 min; 4) vérifier quantitativement l’efficacité du transfert; et 5) plus important encore, valider les changements dans le niveau de la protéine d’intérêt en utilisant le contrôle de la charge totale en protéines.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>4-20 % Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>567-8093</td><td>Choisissez une taille et un pourcentage de gel qui répondent au besoin spécifique dans une expérience</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4157</td><td>Choisissez soit du PVDF, soit de la nitrocellulose et adaptez la taille de la membrane au gel taille</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrat, 500 ml </td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Criterion Cell </td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr><tr><td>Système de démarrage par transfert turbo Trans-Blot </td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>Système ChemiDoc MP </td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

flux de travail sans taches v3 pour un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale en protéines dans western blotting

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Le western blot est une technique de laboratoire très utile et largement adoptée, mais son exécution est difficile. Le flux de travail est souvent caractérisé comme une « boîte noire » parce qu’un expérimentateur ne sait pas s’il a été effectué avec succès jusqu’à la dernière de plusieurs étapes. De plus, la qualité des données sur le transfert western est parfois mise à l’épreuve en raison d’un manque d’outils efficaces de contrôle de la qualité en place tout au long du processus de western blotting. Nous décrivons ici le flux de travail occidental V3, qui applique la technologie sans tache pour répondre aux préoccupations majeures associées au protocole western blot traditionnel. Ce flux de travail permet aux chercheurs: 1) d’exécuter un gel en environ 20-30 min; 2) visualiser la qualité de séparation de l’échantillon dans les 5 minutes suivant l’exécution du gel; 3) transférer des protéines en 3-10 min; 4) vérifier quantitativement l’efficacité des transferts; et surtout 5) pour valider les changements dans le niveau de la protéine d’intérêt en utilisant le contrôle de la charge totale en protéines. Cette nouvelle approche élimine le besoin de décaper et de réprouillant la tache pour les protéines d’entretien ménager telles que la β-actine, la β-tubuline, le GAPDH, etc. Le flux de travail sans tache V3 rend le processus western blot plus rapide, transparent, plus quantitatif et plus fiable.

1. Évaluation de l’intégrité de l’échantillon, de la qualité de la séparation des protéines et de l’efficacité du transfert avec des images de gel sans taches.
L’extrait de protéine des cellules de HeLa ont été séparés à 300 V pendant la minute 20 sur un gel sans tache du critère anyKD TGX de 18 puits. Les échantillons de protéines ont été chargés 3 fois à quatre quantités différentes (voies 1-3, 40 μg; Voies 4-6, 30 μg; Voies 7-9, 20 μg; Voies 10-12, 10 μg). Le gel a été activé sous la lumière UV pendant 1 min. La figure 2A montre l’image du gel acquise juste après la séparation des protéines. L’intégrité de l’échantillon de protéines(p. ex. dégradation) et la qualité de la séparation(p. ex. précipitation des protéines) peuvent être évaluées visuellement avec cette image de gel. Les protéines ont ensuite été transférées pendant 7 minutes dans une membrane de nitrocellulose à l’aide de Trans-Blot Turbo. La figure 2B montre l’image sans tache du gel post-transfert. Les deux images ont été acquises avec le même temps d’exposition (6.8 sec). Les voies 3 et 12 ont été choisies pour mesurer l’efficacité du transfert. À l’aide de l’outil de volume du logiciel Image Lab, une boîte rectangulaire (bleue) a été dessinée pour couvrir les voies 3 et 12 sur les deux images de gel. Le calcul basé sur les valeurs de volume de ces boîtes a indiqué que l’efficacité de transfert des deux voies était de 80 %(figure 2C). Dans cette expérience, le gel AnyKD TGX a été sélectionné pour étudier les protéines cibles de petite à moyenne taille et il n’a pas été optimisé pour le transfert de grandes protéines. L’optimisation de l’efficacité du transfert nécessiterait l’utilisation d’un pourcentage de gel inférieur(par exemple 4-20%) et/ou un ajustement du temps de transfert pour faciliter le transfert de grosses protéines. 2. Le contrôle de la charge totale en protéines sans tache est une alternative fiable au contrôle de la charge d’entretien ménager dans le western blotting pour quantifier un petit changement dans le niveau de protéines d’intérêt.
MCM-7 est un facteur de réplication d’autorisation d’ADN dont le niveau diminue de 20-50% dans les lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) après traitement par irradiation. Dans cette expérience, les lysats (30 μg chacun) de quatre cultures de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) témoins et traitées par irradiation ont été séparés sur un gel sans coloration AnyKD TGX à 12 puits. Le gel a été activé pendant 1 minute sous la lumière UV et transféré par Trans-Blot Turbo à une membrane PVDF pour immunoblotting. La protéine d’entretien ménager GAPDH (vert) a été sondée avec un anticorps de lapin (Cell Signaling Technology, Etats-Unis, 1:2.500) et un anticorps conjugué de chèvre-anti-lapin Dylight 549 (Rockland, Etats-Unis, 1:20.000). La protéine d’intérêt MCM-7 (rouge) a été sondée à l’aide d’un anticorps de souris (Abcam, États-Unis, 1:1 000) et d’un anticorps conjugué goat-anti-souris Dylight 649 (Rockland, 1:10 000).
La figure 3A montre une image fluorescente multiplex de protéines totales (bleu), MCM-7 (rouge) et GAPDH (vert) détectées dans quatre échantillons de LCL traités par contrôle et irradiation. La figure 3B est une image sans tache du même transfert montrant les profils de protéines totales dans chaque échantillon (30 μg). Le logiciel de laboratoire d’images a sélectionné les voies d’échantillonnage (boîtes bleues) pour mesurer le MCM-7, le GAPDH et le volume total de protéines dans chaque voie. Les niveaux MCM-7 ont été normalisés contre la mesure totale sans tache de protéine ou contre GAPDH. Les niveaux normalisés de protéine MCM-7 ont été statistiquement analysés et le volume moyen de bande de protéine MCM-7 et l’écart-type (n = 4) sont présentés dans le graphique(Figure 3C). Les deux méthodes de normalisation ont révélé une légère diminution (environ 25 %) dans les niveaux de protéine MCM-7 après traitement d’irradiation. Les données avec la normalisation totale des protéines ont montré un écart-type plus petit que celui avec GAPDH comme contrôle de charge.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Figure 1. Flux de travail ouest V3. Le flux de travail V3 est représenté dans la colonne de gauche en 4 étapes. Les principaux instruments et réactifs utilisés dans le flux de travail sont indiqués à chaque étape. Le temps estimé pour chaque étape est également inclus. La colonne de droite indique qu’un minimum de 4 images peuvent être générées dans le flux de travail V3. L’utilisation de chaque donnée est décrite. Les images sans tache du gel prétransfert, du gel post-transfert et de la tache (A, B, C) ne peuvent pas être générées facilement avec les techniques occidentales traditionnelles de buvardage; Ces images et données fournissent des informations importantes et des points de contrôle tout au long de la procédure pour améliorer le contrôle et la reproductibilité du flux de travail du transfert western par le scientifique. Les signaux de la protéine cible peuvent être capturés soit sur une image de tache chimiluminescente(D)si un anticorps secondaire conjugué HRP a été appliqué en détection, soit sur une image fluorescente(E)si le bblotting occidental fluorescent multiplexant a été effectué pour détecter plus d’une protéine cible simultanément sur la même tache. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Figure 2. Images sans tache des gels prétransfert et post-transfert dans le flux de travail V3 western pour évaluer l’intégrité des échantillons, la qualité de la séparation et l’efficacité du transfert. (A) Image sans tache de gel de prétransfert. (B) Image sans tache de gel post-transfert. (C) Mesure de l’efficacité du transfert de protéines.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Figure 3. Comparaison de la mesure des protéines totales sans taches à l’immunodétection GAPDH en tant que contrôles de charge pour normaliser le niveau de protéine d’intérêt. (A) Image fluorescente western blot. (B) Image de tache sans tache. (C) Niveaux normalisés de protéine MCM-7. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>

Le flux de travail V3 est une procédure western blot utilisant des gels sans taches. La technologie sans taches permet aux chercheurs de visualiser la qualité de la séparation des protéines, de vérifier l’efficacité du transfert et, plus important encore, de valider le changement dans la protéine d’intérêt en utilisant la quantification des protéines totales comme contrôle de charge fiable.

Flux de travail sans taches V3 pour un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale en protéines dans Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

Le flux de travail BioRad V three fournit aux chercheurs une quantification plus fiable et une plus grande confiance dans le processus de transfert Western. Ceci est réalisé en utilisant d'abord des gels sans coloration TGX pour séparer et visualiser les échantillons protéiques. Après la séparation, les protéines sont transférées sur une membrane à l'aide du système de transfert rapide Blot Turbo, ce qui permet de vérifier la qualité et l'efficacité du transfert.Après vérification du transfert, la membrane est bloquée et incubée avec des anticorps primaires et secondaires dirigés contre les protéines cibles. Enfin, les niveaux des protéines cibles sont normalisés à l'aide de la mesure du total des protéines par coloration sans colorant, utilisée comme témoin de chargement. Le flux de travail V three apporte commodité et transparence au processus de western blot, offrant aux chercheurs une confiance à chaque étape, de la séparation au transfert et à la quantification.L'avantage principal du protocole Western V three par rapport au Western blot traditionnel réside dans le fait que la technologie sans coloration offre un contrôle pratique, commode et fiable du chargement total des protéines, permettant ainsi de normaliser les signaux de la protéine cible. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant la fiabilité des méthodologies de contrôle de chargement en immunobuvardage, notamment en ce qui concerne la surcharge des signaux des protéines de référence et les niveaux variables d'expression de ces dernières dans différentes conditions expérimentales. Nous avons découvert que les protéines activées dans les gels sans coloration pouvaient également être visualisées sur les membranes sans coloration supplémentaire, ce qui permet de les utiliser comme alternative aux colorations conventionnelles totales des protéines, ainsi qu'aux contrôles de chargement basés sur les protéines de référence.Dans les prochaines minutes, nous allons démontrer l'ensemble du flux de travail V three en utilisant la fluorescence multiplexe. La même procédure peut également être utilisée pour la chimiluminescence après préparation des échantillons protéiques selon le protocole indiqué. À l'aide d'un critère TGX stain free any KD gel préfabriqué, retirez le peigne et le ruban du bas de la cassette.Placer la cassette dans l'appareil à gel et remplir les deux réservoirs avec les tampons de migration. Charger les standards protéiques et les échantillons. Faire ensuite migrer le gel pendant 20 minutes à 300 volts.Une fois l'électrophorèse terminée, utilisez l'outil d'ouverture de cassette sur le couvercle de la Criterion Cell pour ouvrir la cassette. Appliquez ensuite quelques millilitres d'eau sur le transilluminateur UV de l'appareil Chemi Dock MP. Soulevez délicatement le gel hors de la cassette et placez-le sur le transilluminateur UV. Lancez le logiciel Image Lab et configurez un nouveau protocole monocanal pour les gels sans coloration, en utilisant le temps d'activation par défaut d'une minute, sélectionnez le type de gel approprié et l'optimisation automatique par défaut pour les bandes intenses.Ensuite, cliquez sur exécuter le protocole. Une fois la capture d'image terminée, visualisez la séparation et la qualité de l'échantillon. Puis passez immédiatement à l'étape de transfert.Pour effectuer le transfert des protéines, ouvrez un bloc trans turbo MIDI PVDF. Placez l'empilement inférieur au centre de la cassette de base. Retirez le gel de l'appareil d'imagerie.Alignez le gel sur le dessus de la membrane. Utilisez délicatement le rouleau de transfert pour éliminer les bulles d'air entre le gel et la membrane. Ensuite, positionnez le tampon supérieur sur le dessus du gel.Après avoir éliminé toutes les bulles d'air, placez le couvercle de la cassette sur la base. Appuyez fermement sur le couvercle, tournez le bouton en sens horaire pour verrouiller, puis insérez la cassette dans l'un des deux compartiments du bloc. À partir de l'écran d'accueil, sélectionnez le protocole turbo.Choisissez le double mini gel ou le mini gel unique, puis appuyez sur le bouton de démarrage pour la baie appropriée. Le transfert sera terminé en sept minutes. Retirez la cassette de la baie.Déverrouillez la cassette et démontez le sandwich de transfert. Placez le gel après transfert sur le transilluminateur UV de l'imager Chemi dock MP, puis placez immédiatement la membrane dans de l'eau désionisée. Configurez un nouveau protocole à canal unique pour les gels sans coloration, sans temps d'activation.Sélectionnez le type de gel approprié et réglez manuellement le temps d'exposition à celui du gel avant transfert, puis cliquez sur « exécuter le protocole ». Une fois la capture de l'image terminée, vérifiez l'efficacité du transfert en comparant les intensités des bandes des échantillons entre les gels avant et après transfert.Retirez le gel du plateau d'échantillons car il n'est plus nécessaire et jetez-le. Pour vérifier, transférez sur le blot. Placez la membrane sur le plateau d'échantillons et configurez un nouveau protocole à canal unique.Pour le transfert sans coloration. Sélectionnez le type de gel approprié et l'optimisation automatique par défaut pour des bandes intenses. Cliquez ensuite sur exécuter le protocole.Une fois la capture d'image terminée, vérifiez le transfert vers la membrane. Retirez la membrane du transilluminateur UV et placez-la dans le tampon de blocage pour le immunobuvardage. Après avoir incubé la membrane à température ambiante pendant une heure, incubez-la avec les anticorps primaires de souris et de lapin toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant.Verser la solution d'anticorps et laver le transfert avec 50 millilitres de TBST pendant cinq minutes. Incuber le transfert avec des anticorps secondaires marqués au fluorochrome, anti-souris et anti-lapin, pendant une heure à température ambiante. Laver ensuite le transfert avec du TBST cinq fois, cinq minutes à chaque fois.Pour imager le transfert, placez-le sur l'illuminateur UV de l'appareil Chemi doc MP dans le logiciel Image Lab. Configurez un nouveau protocole multicanal. Réglez le canal un en sélectionnant « dite six 50 » dans les applications de transfert et utilisez l'optimisation automatique par défaut pour les bandes intenses.Répétez ces étapes pour configurer les canaux deux et trois respectivement pour DITE 5 49 et le transfert sans coloration. Sélectionnez le type de gel approprié puis cliquez sur exécuter le protocole. Pour définir les pistes, sélectionnez la piste de l'image du transfert sans coloration ainsi que les bandes.Ensuite, utilisez le détecteur automatique de bandes pour une quantification précise. Assurez-vous que les profils de fond sont similaires dans chaque voie d'échantillon en ajustant la taille du disque roulant à 70. Vérifiez l'uniformité du fond en parcourant tous les profils de bandes afin de définir les bandes dans les deux canaux dite six 50 et 5 49.Utilisez l'outil de détection de bandes pour identifier les bandes à l'aide des paramètres de sensibilité par défaut. Pour désigner le canal de normalisation, revenez à la boîte à outils d'analyse. Cliquez sur Normalisation et sélectionnez Stain Free Blot, en veillant à ce que la protéine totale par voie soit sélectionnée.Pour attribuer les bandes standards de poids moléculaire, revenez à la boîte à outils d'analyse, cliquez sur les outils d'analyse de poids moléculaire (MW) et cochez la case sous la bande appropriée. Enfin, pour visualiser les intensités normalisées des bandes protéiques, cliquez sur le tableau d'analyse dans la barre d'outils. Le logiciel générera automatiquement un tableau contenant les intensités volumétriques, les facteurs de normalisation et les volumes normalisés.Les volumes normalisés doivent être utilisés pour l'analyse et le rapport des données. Le tableau peut être exporté. Pour des analyses supplémentaires, nous avons démontré l'intégralité du protocole de transfert Western V trois.Nous allons maintenant vous présenter des résultats représentatifs provenant d'une expérience réelle. Des lysats de cultures cellulaires de lymphoblastes contrôles et irradiés ont été analysés à l'aide du protocole de western blot V three. Le signal du total des protéines détecté par coloration sans colorant apparaît en bleu.La protéine cible M CM sept est indiquée en rouge, et la protéine de référence validée GA DH, utilisée comme témoin de chargement, est indiquée en vert. La protéine GA DH a été validée comme témoin de chargement approprié en évaluant sa linéarité à l’aide des conditions expérimentales décrites dans cette vidéo. Les signaux totaux de protéines provenant de la coloration sans colorant pour chaque piste sur le blott ont été mesurés à l’aide du logiciel Image Lab.Les intensités du signal de la protéine MCM sept ont été normalisées à l'aide des signaux de la protéine totale et de la GDH. Les volumes des bandes protéiques de MCM sept normalisés par les deux méthodes ont révélé une diminution de 25 % des niveaux d'expression dans les échantillons irradiés par rapport aux échantillons témoins avant une normalisation précise. La protéine de référence nécessite une validation confirmant sa gamme linéaire et la constance de ses niveaux d'expression entre les échantillons, sans validation.Les contrôles de chargement basés sur des protéines de référence ne garantissent pas une normalisation précise. En revanche, la normalisation par protéine totale ne nécessite pas de validation. Ainsi, le signal des protéines totales obtenu grâce à la méthode V three offre un contrôle de chargement plus pratique, plus commode et plus fiable lors de la mise en œuvre de cette procédure.Il faut se rappeler que la technologie sans coloration permet la visualisation fluorescente d'échantillons protéiques grâce à une modification covalente induite par UV des résidus de tryptophane disponibles. Cette modification n'affecte significativement les applications en aval, telles que la détection immunologique ou la spectrométrie de masse, que dans de rares cas. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser le protocole Western V trois et la normalisation par protéine totale sans coloration.Bien que nous ayons démontré ce protocole pour le western blot multiplex en fluorescence, la technologie sans coloration peut également être utilisée pour la normalisation des protéines totales avec des western blots luminescents.

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Préparation d’un échantillon de plasma pour la spectrométrie de masse à l’aide d’un poste de travail automatisé

Un système d’analyse automatisée et rapide des glycanes sur les protéines a déjà été développé. Cet article présente le protocole d'« analyse glyco-qualitative », optimisé pour un large éventail d’utilisateurs, tels que ceux engagés dans l’analyse des structures glycanes dans les produits biopharmaceutiques et autres matériaux glycoconjugués.

Évaluation glyco-qualitative rapide de protéines recombinantes à l’aide d’un système entièrement automatisé

Ce protocole standardise l’analyse SDS-PAGE pour le profilage personnalisé de la corona protéique sur les nanoparticules, permettant une détection reproductible, évolutive et à faible coût de signatures spécifiques au cancer. Conçu pour le diagnostic précoce de l’adénocarcinome canalaire pancréatique, il offre une alternative pratique et alignée sur le REASSURED aux méthodes protéomiques complexes, tant en milieu de recherche que clinique.

Flux de travail standardisé SDS-PAGE pour le profilage personnalisé de la corona protéique dans la détection précoce du cancer

Découvrez le flux de travail V3 pour le western blot utilisant des gels sans colorant TGX. Cette méthode offre un contrôle de charge fiable en protéines totales et améliore la quantification des protéines cibles.

Flux de travail sans taches V3 pour un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale en protéines dans Western Blotting (Vidéo) | JoVE Journal

Flux de travail sans taches V3 pour un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale en protéines dans Western Blotting

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