Flux de travail sans taches V3 pour un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale en protéines dans Western Blotting

BioRad V three Workflow offre aux chercheurs une quantification plus fiable et une confiance dans le processus de transfert Western. Pour ce faire, on utilise d’abord des gels sans coloration TGX pour séparer et visualiser les échantillons de protéines. Après la séparation, les protéines sont transférées dans une membrane à l’aide du système de transfert rapide blot turbo, qui permet de vérifier la qualité et l’efficacité du transfert.

Après vérification du transfert, la membrane est bloquée et sondée avec des anticorps primaires et secondaires pour les protéines cibles. Enfin, les niveaux cibles de protéines sont normalisés à l’aide de la mesure des protéines totales sans colorant comme contrôle de la charge. Le flux de travail V three apporte commodité et transparence au processus de transfert occidental, offrant aux chercheurs une confiance à chaque étape, de la séparation au transfert et à la quantification.

Le principal avantage du flux de travail V three Western par rapport au transfert Western traditionnel est que la technologie sans coloration offre un contrôle pratique, pratique et fiable de la charge totale des protéines pour normaliser vos signaux protéiques cibles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à la fiabilité des méthodologies de contrôle de charge pour la technique de transfert Western qui impliquent la sursaturation des signaux de protéines de ménage et les niveaux d’expression différentiels des protéines de ménage dans diverses conditions expérimentales. Nous avons découvert que les protéines activées dans les gels sans coloration pouvaient également être visualisées sur les blos sans coloration supplémentaire, ce qui leur permettait d’être utilisées comme alternative aux colorations conventionnelles de protéines totales, ainsi qu’aux contrôles de charge en protéines.

Dans les prochaines minutes, nous allons faire la démonstration de l’ensemble du flux de travail V 3 à l’aide de la fluorescence multiplex. La même procédure peut également être utilisée pour la chimiluminescence après la préparation d’échantillons de protéines conformément au protocole de texte. À l’aide d’un critère TGX sans tache tout gel préfabriqué KD, retirez le peigne et le ruban adhésif du bas de la cassette.

Placez la cassette dans l’appareil à gel et remplissez les deux réservoirs avec des tampons courants. Chargez les étalons et les échantillons de protéines. Ensuite, faites couler le gel pendant 20 minutes à 300 volts.

Une fois l’électrophorèse terminée, utilisez l’outil d’ouverture de la cassette de gel sur le couvercle de la Criterion Cell pour ouvrir la cassette. Appliquez ensuite quelques millilitres d’eau sur le transluminateur UV de l’imageur Chemi Dock MP. Soulevez délicatement le gel de la cassette et placez-le sur le logiciel UV Trans Illuminator, lancez Image Lab et configurez un nouveau protocole monocanal pour les gels sans taches en utilisant le temps d’activation du gel par défaut d’une minute, sélectionnez le type de gel approprié et l’optimisation automatique par défaut pour les bandes intenses.

Cliquez ensuite sur Exécuter le protocole. Une fois la capture d’image terminée, visualisez la séparation et la qualité de l’échantillon. Passez ensuite immédiatement à l’étape du transfert.

Pour effectuer un transfert de protéines, ouvrez un pack de transfert trans block turbo MIDI PVDF. Placez la pile inférieure au centre de la base de la cassette. Retirez le gel de l’imageur.

Alignez le gel sur le dessus de la membrane. Utilisez doucement le rouleau tampon pour éliminer les bulles d’air entre le gel et la membrane. Ensuite, alignez la pile supérieure sur le gel.

Après avoir éliminé toutes les bulles d’air, placez le couvercle de la cassette sur la base. Appuyez fermement sur le couvercle, tournez le cadran dans le sens des aiguilles d’une montre pour verrouiller et insérez la cassette dans l’une des deux baies de buvard. Depuis l’écran d’accueil, sélectionnez le protocole turbo.

Choisissez les deux mini gels ou un mini, et appuyez sur le bouton de course pour la baie appropriée. Le transfert sera terminé en sept minutes. Retirez la cassette de la baie.

Déverrouillez la cassette et démontez le sandwich buvard. Placez le gel post-transfert sur le transluminateur UV de l’imageur Chemi dock MP, et placez immédiatement la membrane dans de l’eau déminéralisée. Mettez en place un nouveau protocole monocanal pour les gels sans coloration sans temps d’activation.

Sélectionnez le type de gel approprié et réglez manuellement le temps d’exposition sur celui du gel de pré-transfert et cliquez sur exécuter le protocole. Une fois la capture d’image terminée. Vérifiez l’efficacité du transfert en comparant les intensités des bandes d’échantillon entre les gels avant et après le transfert.

Retirez le gel du plateau d’échantillon car il n’est plus nécessaire et jetez-le. Pour vérifier, transférez-le dans le tampon. Placez la membrane sur le plateau d’échantillon et mettez en place un nouveau protocole monocanal.

Pour une tache sans tache. Sélectionnez le type de gel approprié et l’optimisation automatique par défaut pour les bandes intenses. Cliquez ensuite sur Exécuter le protocole.

Une fois la capture d’image terminée, vérifiez le transfert vers la membrane. Retirez la membrane de transfert de l’illuminateur UV trans et placez-la dans un tampon de blocage pour le transfert occidental. Après avoir incubé la membrane à température ambiante pendant une heure, incubez-la avec des anticorps primaires de souris et de lapin pendant une nuit à quatre degrés Celsius le lendemain.

Versez la solution d’anticorps et utilisez 50 millilitres de TBST pour laver le transfert pendant cinq minutes. Incuber le transfert avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents, anti-muse et anti-lapin pendant une heure à température ambiante. Ensuite, utilisez TBST pour laver le tampon cinq fois pendant cinq minutes chacune.

Pour imager le transfert, placez-le sur l’illuminateur UV de l’imageur Chemi doc MP dans le logiciel de laboratoire d’imagerie. Configurez un nouveau protocole multicanal. Configurez le premier canal en sélectionnant dite six 50 sous les applications blot et utilisez l’optimisation automatique par défaut pour les bandes intenses.

Répétez ces étapes pour configurer les canaux deux et trois pour DITE 5, 49 et tach free blot, respectivement. Sélectionnez le type de gel approprié et cliquez sur exécuter le protocole. Pour définir les voies, sélectionnez la voie et les bandes de l’image de tache sans tache.

Puis localisateur de voie automatique pour une quantification précise. Assurez-vous que les profils d’arrière-plan de chaque voie d’échantillonnage sont similaires en ajustant la taille du disque roulant à 70. Confirmez l’uniformité de l’arrière-plan en parcourant tous les profils de voies pour définir les bandes dans les six canaux 50 et 5 49

Utilisez l’outil de recherche de bande pour détecter les bandes à l’aide des paramètres de sensibilité par défaut. Pour désigner le canal de normalisation, retournez à la boîte à outils d’analyse. Cliquez sur normalisation et choisissez un transfert sans tache, en vous assurant que la protéine de voie totale est sélectionnée.

Pour affecter les voies standard de poids moléculaire à la boîte à outils d’analyse, cliquez sur Outils d’analyse MW et cochez la case sous la voie appropriée. Enfin, pour afficher les intensités normalisées des bandes de protéines, cliquez sur le tableau d’analyse dans la barre d’outils. Le logiciel génère automatiquement une table contenant les intensités de volume, les facteurs de normalisation et les volumes normalisés.

Les volumes normalisés doivent être utilisés pour l’analyse des données et la production de rapports. La table peut être exportée. Pour une analyse plus approfondie, nous avons démontré le flux de travail complet du transfert Western V three.

Nous allons maintenant vous montrer les résultats représentatifs d’une expérience réelle. Des lysats de cellules témoins et des cultures cellulaires de lymphoblastes irradiés ont été analysés à l’aide du flux de travail par transfert Western V three. Le signal protéique total sans colorant apparaît en bleu.

La protéine cible M CM sept est indiquée en rouge, et le contrôle de charge en protéines de ménage validé GA DH est indiqué en vert. GA DH a été validé comme un contrôle de charge approprié en évaluant sa linéarité à l’aide des conditions expérimentales décrites dans cette vidéo. Les signaux protéiques totaux sans coloration pour chaque voie sur le transfert ont été mesurés à l’aide d’un logiciel de laboratoire d’imagerie.

Les sept intensités du signal MCM ont été normalisées à l’aide des signaux de protéine totale et de GA DH. Les volumes de bandes protéiques MCM à sept normalisés par les deux méthodes ont révélé une diminution de 25 % des niveaux d’expression dans les échantillons irradiés par rapport aux échantillons témoins avant une normalisation précise. La protéine de ménage nécessite une validation, confirmant sa plage linéaire et ses niveaux d’expression cohérents entre les échantillons sans validation.

Les contrôles de charge en protéines ne garantissent pas une normalisation précise. En revanche, la normalisation des protéines totales ne nécessite pas de validation. Ainsi, le signal protéique total sans coloration obtenu par le flux de travail V three offre un contrôle de charge pratique, pratique et plus fiable lors de la tentative de cette procédure.

N’oubliez pas que la technologie sans coloration permet la visualisation fluorescente d’échantillons de protéines grâce à une modification covalente induite par les UV des résidus de tryptophane disponibles. Ce n’est que dans de rares cas que cette modification aura un impact significatif sur les applications en aval telles que l’immunodétection ou la spectrométrie de masse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer le flux de travail V three Western et la normalisation des protéines totales sans colorant.

Bien que nous ayons démontré ce flux de travail pour le transfert Western fluorescent multiplex, la technologie sans coloration peut également être utilisée pour la normalisation des protéines totales avec des Western blots luminescents.