Dérivées de moelle osseuse Macrophages production

L’objectif global de cette procédure est de générer des macrophages à partir de cultures cellulaires dérivées de l’urine et de la moelle osseuse. Ceci est accompli d’abord en extrayant la moelle osseuse des pattes arrière de la souris. Dans la deuxième étape, les macrophages résidents de la moelle osseuse sont retirés, puis les cellules de la moelle osseuse sont cultivées dans des conditions de différenciation des macrophages.

Ensuite, lorsque les cellules de la moelle osseuse se sont différenciées en macrophages, elles peuvent être collectées pour une analyse expérimentale. En fin de compte, la microscopie confocale peut être utilisée pour démontrer la localisation du LPS bactérien dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse, les compartiments acides finaux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la croissance des macrophages, les lignées cellulaires, est son grand nombre, ce qui permet d’obtenir des macrophages primaires.

La démonstration visuelle de la méthode est essentielle car les étapes d’autoproduction sont difficiles à apprendre et nécessitent de la pratique, et pour réussir, désinfectez la peau d’une souris euthanasiée avec de l’éthanol à 70 %. Faites une incision en haut de chaque patte arrière et tirez la peau vers le bas vers le pied pour exposer le muscle. Ensuite, coupez les pattes arrière et utilisez des ciseaux et des pinces stériles.

Pour enlever la peau, placez les pattes dans une boîte de Pétri stérile de 35 millimètres contenant cinq millilitres de glace stérile. PBS froid. Retirez la peau et les muscles attachés aux os, puis transférez les os dans une nouvelle boîte de Pétri stérile contenant cinq millilitres de glace.

PBS froid et stérile. Lavez les os deux fois avec cinq millilitres supplémentaires de PBS, puis transférez-les dans un mortier stérile contenant cinq millilitres de glace. PBS froid et stérile.

Coupez maintenant le tibia du fémur au niveau de l’articulation et utilisez un pilon pour écraser doucement les os. Prélever le surnageant dans des tubes glacés de 15 millilitres trois fois. Filtrez ensuite la suspension tissulaire à travers une passoire en nylon de 70 microns.

Pour éliminer les fragments solides, faites tourner le filtrat et jetez doucement le surnageant. Dissociez la pastille avec un tampon de lyse des globules rouges, en ajoutant 20 millilitres de DMEM complet glacé après 30 secondes pour arrêter la réaction après centrifugation des cellules, nous suspendons la pastille dans 20 millilitres de 37 degrés Celsius, DMEM complet, puis divisons la suspension cellulaire entre deux boîtes de Pétri de 100 millimètres. Incuber les plats pendant quatre heures à 37 degrés Celsius, puis recueillir les surnageants dans des tubes de 50 millilitres à température ambiante.

Après avoir fait tourner les surnageants, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de DMEM complet complété par le surnageant L 9 29 cellules préalablement préparé, puis filtrez les cellules à travers une passoire à cellules en nylon de 40 microns. Ajoutez le filtrat à 140 millilitres de DMEM complet et à un milieu cellulaire L 9 29, puis répartissez 10 millilitres de suspension cellulaire par boîte dans 15 boîtes de Pétri de 100 millimètres. Après avoir incubé les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 10 millilitres de DMEM complet plus L 9 29 surnageant et incuber les cellules pendant quatre jours supplémentaires.

Surveiller périodiquement la croissance cellulaire à l’aide d’un microscope inversé pour prélever les macrophages dérivés de la moelle osseuse, aspirer et éliminer d’abord le surnageant. Ensuite, lavez la boîte de Pétri deux fois avec du DMEM complet. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de DMEM complet à 37 degrés Celsius et utilisez un policier en caoutchouc pour détacher doucement les cellules, recueillir les macrophages dérivés de la moelle osseuse dans des tubes de 50 millilitres, puis faire tourner les cellules.

Resus mettant en suspension les granulés dans 20 millilitres de DMEM complet. Enfin, comptez les cellules par exclusion triam blue. En utilisant cette méthode, un grand nombre de macrophages peuvent être obtenus en quelques jours seulement après l’isolement et le placage des cellules rondes non adhérentes de la moelle osseuse moins les macrophages résidents de la moelle osseuse, comme cela vient d’être démontré.

Ces cellules précurseurs représentatives de la BMDM ont été incubées avec G-M-C-S-F. Après trois jours, les cellules ont commencé à adhérer et à se différencier en macrophages. Après sept jours, une monocouche confluente de macrophages dérivés de la moelle osseuse a été observée.

L’analyse par cytométrie en flux pour Ffour, 80 et H-L-A-D-R a révélé que les macrophages dérivés de la moelle osseuse exprimaient les deux marqueurs, confirmant la différenciation des cellules de la moelle osseuse en macrophages. Évaluer les capacités acides des macrophages dérivés de la moelle osseuse. La capacité des cellules à internaliser les vitesses du latex a été surveillée comme prévu.

Il a été déterminé que le nombre de billes par cellule augmentait au fil du temps afin d’évaluer leur potentiel endocytaire. Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ont également été co-cultivés avec Coxiella. Il a été observé que le LPS de l’œil de Burnett en rouge était localisé dans un compartiment qui héberge la protéine membranaire associée au lysosomal un en bleu, mais pas la cathepsine D en vert, démontrant que le LPS était présent dans les endosomes tardifs, qui sont incapables de fusionner avec les lysosomes comme prévu macrophage dérivé de la moelle osseuse.

Les interactions entre les bactéries et les agents pathogènes ont été analysées plus en détail via leur infection par l’œil de Wiley TMA. Comme prévu, les bactéries en rouge n’étaient pas localisées dans le compartiment qui abrite le KPS et le D, qui apparaît à nouveau en vert. Dans cet immuno-transfert représentatif, les voies de transduction du signal des macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été évaluées, démontrant que les macrophages dérivés de la moelle osseuse comme les tissus, les macrophages isolés régulent à la hausse les niveaux de P 38 alpha map kinase phosphorylée en réponse à la stimulation du LPS esia coli.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie cellulaire, telles que le compartiment intracellulaire microlocalisé.