Name: Dérivées de moelle osseuse Macrophages production (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Apprenez à différencier des macrophages à partir de moelle osseuse de souris pour l'immunologie cellulaire. Cette méthode permet d'obtenir de grandes quantités de macrophages primaires pour l'analyse expérimentale.

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Ce travail a été soutenu par le CNRS (PICS 2012-2014 à EG) et par une subvention de la Région Campanie (LR n ° 5, 28.03.2002 à Giovanna Mottola). Filippo Conti est un membre de la Fondation de Coopération Scientifique&#39;&#39; Infectiopole Sud.&#39;&#39; Nicola Boucherit est membre du Ministère français de la Recherche et de la Technologie. Les sources de financement n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte de données, analyse de données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Déclaration d&#39;éthique Le protocole de manipulation des animaux a été approuvé par notre Comité institutionnel d&#39;éthique animale &quot;Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Expérimentale Médico-Chirurgical» (CFREMC, permis de projet 10-300122013 Eric Ghigo) de l&#39;Université d&#39;Aix-Marseille en accord avec les règles de Décret N ° 87-848 du 19/10/1987. Les expériences ont été effectuées à la Faculté de Médecine de la Timone (numéro de permis d&#39;expérimentation 13,385 à Eric Ghigo). Une. Matériel et Culture Préparation médias <ol><li> Stériliser deux pinces, deux ciseaux, deux lames chirurgicales, un mortier et un pilon. </li><li> Obtenir du DMEM complet contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM de glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Diluer 10x PBS dans de l&#39;eau distillée stérile pour obtenir 1x PBS. </li><li> Obtenir glacée 1x PBS, DMEM complet glacée, wa DMEM completrmé à 37 ° C. </li></ol> 2. Préparation de L929 surnageants cellulaires <ol><li> Croître jusqu&#39;à confluence des cellules L929 (vingt 175 cm2 dans du DMEM complet) à 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Remarque: les colonies de granulocytes-macrophages facteur de stimulation (GM-CSF) est nécessaire pour induire la différenciation des cellules hématopoïétiques dans les macrophages 12. L929 produisent GM-CSF. <ol start="2"><li> A confluence, remplacer le support de culture avec du DMEM complet frais. Transférer les flacons à 32 ° C, 5% CO 2 pendant 10 jours. </li><li> Recueillir, piscine et centrifuger les surnageants à 750 g pendant 10 min. Jeter culots cellulaires. </li><li> surnageants de magasins en tubes de 15 ml et conserver à -20 ° C. </li></ol> 3. Dérivées de moelle osseuse macrophages (BMDM) Préparation <ol><li> Sacrifier une souris par dislocation cervicale. <ol><li> Utiliser des lames chirurgicales stériles pendant toute l&#39;expérience. Désinfecter la peau avec 70% alcohol. Faire une incision au sommet de chaque patte arrière et tirez la peau vers le bas vers le pied pour exposer le muscle. </li><li> Coupez les pattes de derrière, enlever la peau avec des ciseaux stériles et des pinces stériles. Placer les jambes à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri stérile (35/10 mm) contenant stérile, refroidi à la glace 1x PBS (5 ml). </li><li> Retirer la chair et les muscles qui sont adhère à l&#39;os avec des ciseaux et des pinces stériles. </li></ol></li><li> Transférer les os dans un nouveau plat, Petri stérile (35/10 mm) contenant de la glace-froid, stérile 1x PBS (5 ml). Laver les os deux fois avec 5 ml refroidi à la glace, 1x PBS stérile. </li><li> Transférer l&#39;os dans un mortier stérile contenant 5 ml refroidi à la glace, 1x PBS stérile. </li><li> Couper le tibia du fémur à l&#39;articulation avec des ciseaux stériles. Briser les os délicatement dans un mortier stérile contenant 5 ml de glace-froid, stérile 1x PBS aide d&#39;un pilon. </li><li> Recueillir le surnageant dans 15 ml tubes glacés. Répétez cette étape 3x. </li><li> Filtrer à travers une cellule de Nylon stra 70 umINER pour éliminer les fragments solides. Centrifuger le filtrat à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Jeter doucement le surnageant. Dissocier le culot dans 10 ml de tampon de lyse des globules rouges pendant 30 s. Ajouter 20 ml refroidi à la glace, du DMEM complet. </li></ol> Remarque: Le but de cette étape est d&#39;éliminer les contaminer les globules rouges, ainsi, cette étape doit être effectuée en 2 min afin d&#39;éviter l&#39;altération des cellules hématopoïétiques par le tampon de lyse des globules rouges du sang. <ol start="8"><li> Centrifuger à 450 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter doucement le surnageant. Dissocier le culot dans 20 ml de DMEM complet qui a été chauffé à 37 ° C. </li><li> Transférer les cellules dissociées dans deux boîtes de Pétri (100/20 mm). Incuber pendant 4 heures à 37 ° C. </li><li> Collecter les surnageants dans des tubes de 50 ml à la température ambiante. Jeter les plats qui contiennent les macrophages résidents. </li></ol> Remarque: L&#39;objectif de cette étape est d&#39;éliminer la Marro osseuse résidentw macrophages par leur aptitude à adhérer à la culture traitée plastique. Ces macrophages résidents peuvent être utilisés dans d&#39;autres expériences. <ol start="11"><li> Centrifuger les surnageants recueillis à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. </li><li> Dissocier doucement le culot dans 10 ml de DMEM complet contenant 15% L929 surnageant cellulaire. Filtrer les cellules à travers un tamis cellulaire en nylon de 40 pm. </li><li> Récupérer le filtrat. Ajouter le filtrat recueilli (10 ml) à 140 ml de DMEM complet qui a été supplémenté avec 15% de cellules L929 médias. </li><li> Distribuer 10 ml de la suspension de cellules par boîte de Pétri (15 boîtes de Pétri, 100/20 mm). Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Cultiver des cellules pendant 3 jours </li><li> Ajouter 10 ml de DMEM complet qui a été complété par 15% L929. Incuber les cellules pendant 4 jours supplémentaires. </li></ol> Remarque: Surveiller la croissance des cellules périodiquement avec un microscope inversé (étapes 3.14 à 3.16). Macrophages adhérents serontobservé après 3 jours de culture. 4. BMDMs de récolte <ol><li> Retirer le surnageant. Laver BMDMs 2 fois avec du DMEM complet </li><li> Ajouter 5 ml de DMEM complet qui a été chauffé à 37 ° C. Détachez BMDMs en grattant doucement avec une spatule en caoutchouc. </li><li> Recueillir BMDMs en tubes de 50 ml et centrifuger à 450 g pendant 10 min. Dissocier doucement culots de cellules dans 20 ml de DMEM complet. </li><li> Comptez BMDMs en présence de bleu trypan (pas de mortalité de plus de 10% doit être observé). </li></ol> Remarque: En règle générale, d&#39;environ 6 à 7,5 x 10 7 macrophages sont obtenus à partir de 15 boites de Pétri (100/20 mm) des macrophages. Il ya environ 4-5 x 10 6 macrophages / boîte de Pétri (100/20 mm). <ol start="5"><li> Préparer BMDMs comme requis pour l&#39;expérience. Après 16 heures dans un milieu complet à 37 ° C, 5% CO 2, les macrophages de nouveau adhérer au support. </li></ol> 5. Stockage BMDMs <ol><li> Recueillir BMDMs isolés (étape 4.3). Centrifuger à 450 g pendant 10 min. Remarque: BMDMs peuvent être congelées dans l&#39;azote liquide. </li><li> les culots de cellules de remettre en suspension dans des milieux de congélation consistant en 10% de DMSO et 90% de FCS à une concentration finale de 4 x 10 6 cellules / ml et pipette 1 ml dans chaque ampoule. </li><li> Geler les cellules à une vitesse de refroidissement de 1 ° C / min. Après 24 h, le transfert de l&#39;ampoule dans un récipient d&#39;azote liquide pour un stockage à long terme. </li></ol>

<ol><li>Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+generating+functionally+heterogeneous+macrophages%3A+chaos+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited.</a> J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).</li>
<li>Van Furth, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Furth%2C+R+%22Inflammation%3A+Basic+Principles+and+Clinical+Correlates%22">Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates</a>. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).</li>
<li>Adams, D., Halmiton, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+D+%22Inflammation%3A+Basic+Principles+and+Clinical+Correlates%22">Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates</a>. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).</li>
<li>Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+haemopoietic+and+other+tissues+of+the+developing+mouse+detected+by+the+monoclonal+antibody+F4%2F80%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80.</a> Development. 112, 517-526 (1991).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+microbes%3A+complexity+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).</li>
<li>Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte%2Fmacrophage+proteomics%3A+recent+findings+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications.</a> Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Barry, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+stimulation+of+p38alpha-MAPK%2FVps41-HOPS+by+LPS+from+pathogenic+Coxiella+burnetii+prevents+trafficking+to+microbicidal+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes.</a> Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).</li>
<li>Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uniformity+of+phagosome+maturation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The uniformity of phagosome maturation in macrophages.</a> J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).</li>
<li>Sundaramurthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Chemical+and+RNAi+Multiparametric+Profiles+Identifies+Triggers+of+Intracellular+Mycobacterial+Killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing.</a> Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).</li>
</ol>

Il n&#39;y a pas de conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole décrit ci-après en détail un procédé pour produire de grands nombres de BMDMs. BMDM sont des cellules primaires et ont la fonction biologique et les propriétés des macrophages différenciés à partir de monocytes, car il n&#39;y a mature, à la différence de lignées de cellules macrophages, qui sont immatures. BMDMs peut être utilisé pour le dépistage génétique (RNAi), le dépistage des drogues, des études fonctionnelles, les études d&#39;interaction hôte-pathogène et de nombreux autres domaines de recherche. <...

Un aspect important de la fonction des macrophages est leur rôle dans l&#39;immunité innée et adaptative. En raison de leur capacité à phagocyter les particules inertes, des bactéries ou des parasites, les macrophages sont une première ligne de défense contre les envahisseurs étrangers. Une fois intériorisée, les microbes sont dégradés dans phagolysosomes. Macrophages envoient aussi des signaux de recrutement et les antigènes présents à d&#39;autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T. Les macrophages sont dérivées de monocytes. Les monocytes se posent dans la moelle osseuse à partir de cellules souches myéloïdes et migrent vers le sang périphérique et de divers tissus où ils se différencient en macrophages. On estime que d&#39;une souris adulte en bonne santé contient environ 10 8 macrophages qui sont distribuées dans tout le corps dans divers organes et tissus (tableau 1) 1,2. Macrophages présentent une grande diversité phénotypique et fonctionnelle en raison de leur capacité à s&#39;adapter à leur 3,4 microenvironnement. Le plus important macrophage propriété est leur activité microbicide, qui est défini par leur capacité de phagocyter des microbes et les détruire. La réponse phagocytaire est définie par l&#39;activation des réseaux de signalisation complexes qui sont stimulés par le contact microbienne, ainsi, les macrophages modulent l&#39;expression du gène de manière appropriée en réponse à divers stimuli. Après la phagocytose, les microbes sont éliminés dans une structure appelée la phagolysosome, mais de nombreux microbes pathogènes ont développé des stratégies pour renverser la fonction microbicide des macrophages 5. La diversité des mécanismes de subversion qui sont utilisés par les différentes espèces microbiennes est un témoignage de la complexité du processus phagocytaire 6 et phagolysosome biogenèse. Les maladies infectieuses sont les principaux problèmes de santé humaine, et de nombreux mécanismes et les molécules participent à des activités antimicrobiennes des macrophages. En outre, les objectifs des propriétés microbicides qui sont pris en otage par les microbes restent inconnus; ainsi, il est un explosion d&#39;intérêt dans les aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et des interactions hôte-pathogène qui a renouvelé l&#39;attention des scientifiques concernant les macrophages. Actuellement, la majorité des travaux de recherche dans le domaine est effectuée sur des lignées de cellules macrophages, qui diffèrent des macrophages primaires dans l&#39;activité phagocytaire, la production de cytokines et la régulation de la poussée oxydative. En outre, ils sont moins appropriés pour la microscopie. Pour étudier l&#39;interaction macrophages-pathogènes, il est recommandé d&#39;utiliser les macrophages primaires, telles que les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs), qui présentent des caractéristiques plus physiologiques. En outre, il est possible de travailler sur BMDMs génétiquement modifiés, parce que ces macrophages pourraient être isolés directement à partir des souris transgéniques, et de la disponibilité des technologies nouvelles telles que la transfection lentiviral, son profil d&#39;expression du gène peut être modifiée par surexpression du gène ou de l&#39;ARN interférence. Ici, nous décrivons une procédure de différencier osseuse murine mflèche en macrophages qui fourniront un grand nombre de macrophages dans les 7 jours pour diverses analyses fonctionnelles telles que la protéomique 7, 8 transcriptomique, le trafic intracellulaire étudie 9, 10 études dynamiques, les écrans génétiques (ARNi) et le dépistage de drogues 11.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Lonza</td><td>BEM515F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse des globules rouges tampon</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules 70 &mu ; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à cellules 40 &mu ; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 50 ml</td><td>tout fournisseur</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>tout fournisseur</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (100/20 mm)</td><td>tout fournisseur</td><td>n/a</td><td></td></tr> de boîtes de Pétri traitées par culture <tr><td>(35/10 mm)</td><td>tout fournisseur</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

dérivées de moelle osseuse macrophages production

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Les macrophages sont des éléments essentiels de la réponse immunitaire innée et adaptative, et ils sont la première ligne de défense contre les envahisseurs étrangers en raison de leurs activités microbicides puissants. Les macrophages sont largement distribués dans tout le corps et sont présentes dans les organes lymphoïdes, le foie, les poumons, le tractus gastro-intestinal, du système nerveux central, de l&#39;os et de la peau. En raison de leur répartition, ils participent à une large gamme de processus physiologiques et pathologiques. Les macrophages sont des cellules très polyvalents qui sont capables de reconnaître des modifications micro-environnementales et de maintenir l&#39;homéostasie tissulaire. De nombreux agents pathogènes ont développé des mécanismes pour utiliser les macrophages comme des chevaux de Troie pour survivre, se reproduire dans, et d&#39;infecter les humains et les animaux et de se propager dans tout le corps. La récente explosion de l&#39;intérêt pour les aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et des interactions hôte-pathogène a renouvelé l&#39;attention des scientifiques concernant les macrophages. Ici, nous décrivons unprocédé pour isoler et cultiver les macrophages de la moelle osseuse murine qui fournira un grand nombre de macrophages pour étudier les interactions hôte-pathogène, ainsi que d&#39;autres processus.

Le but de ce procédé est d&#39;obtenir facilement un grand nombre de macrophages dans quelques jours. La préparation de cellules de moelle osseuse est illustré sur la figure 1. Os de la patte arrière ont été recueillies et brisé dans un mortier. Une fois que les macrophages résidents ont été retirés de la préparation de cellules de moelle osseuse, des cellules de moelle osseuse ont été incubées avec du GM-CSF (jour 0). Après 3 jours, les cellules, qui étaient ronds et non adhérent avant la culture, comm...

Les macrophages ont longtemps été reconnu comme un élément essentiel des réponses immunitaires innées et adaptatives. L&#39;explosion récente des connaissances relatives aux aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et de l&#39;interaction entre les macrophages et les microbes a renouvelé l&#39;attention des scientifiques à macrophages. Cet article décrit une méthode pour différencier les macrophages de moelle osseuse de souris.

Dérivées de moelle osseuse Macrophages production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des macrophages à partir de cultures cellulaires dérivées de moelle osseuse et d'urine. Cela est réalisé en premier lieu en extrayant la moelle osseuse des membres postérieurs de souris. Dans une deuxième étape, les macrophages résidents de la moelle osseuse sont éliminés, puis les cellules de la moelle osseuse sont cultivées davantage dans des conditions favorisant la différenciation en macrophages.Ensuite, lorsque les cellules de la moelle osseuse se sont différenciées en macrophages, elles peuvent être recueillies pour une analyse expérimentale. En fin de compte, la microscopie confocale peut être utilisée pour démontrer la localisation du LPS bactérien au sein des macrophages dérivés de la moelle osseuse, dans des compartiments acides. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la culture de lignées cellulaires de macrophages, est qu'un grand nombre de macrophages primaires peut être obtenu.La démonstration visuelle de la méthode est essentielle, car les étapes réalisées par soi-même sont difficiles à apprendre et nécessitent de la pratique. Pour réussir, désinfectez la peau d'une

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Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

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