Identifier les interactions protéine-protéine dans Drosophila Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

L’objectif global de cette procédure est de purifier les protéines en interaction in vivo d’un gène d’intérêt à partir du cerveau adulte de la mouche des fruits. Pour ce faire, il faut d’abord générer les mouches transgéniques qui expriment la protéine d’appât marquée au robinet et recueillir les têtes adultes de ces mouches. La deuxième étape consiste à préparer le surnageant du lysat de tête de mouche pour la procédure de tapotement, puis à effectuer la purification séquentielle de l’immunoglobine G, le clivage TEV et la purification de cal modlin.

Les cinq évolutions suivantes ont été recueillies à partir de la dernière étape de la procédure de tapotement avec le lysat cérébral total et le complexe protéique. Après le clivage TEV sont résolus par la page SDS et visualisés par coloration à l’argent. En fin de compte, la deuxième élution est généralement soumise à la spectrométrie de masse pour l’identification des protéines.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux expériences existantes telles que les expériences hybrides TAL et Core IP, est que les interactions protéiques détectées par tap ont lieu dans des conditions physiologiques proches, ce qui permet de préserver la spécificité de ces interactions. Deux séries d’étapes de purification permettent d’enrichir les résultats spécifiques et de réduire le taux de faux positifs. La démonstration de la procédure sera faite par l’intermédiaire d’un postdoc de mon laboratoire.

Avant de commencer cette procédure, élargissez le stock neuronal de transgènes GAL à quatre UAS en bouteilles et retournez les bouteilles tous les trois jours jusqu’à ce que 250 bouteilles aient été utilisées pour la collecte. Rassemblez des mouches adultes âgées d’un à trois jours dans un tube conique de 50 millilitres et placez immédiatement le tube dans de l’azote liquide pour congeler les mouches. Après ce magasin, les mouches dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Retirez deux tamis de test standard américains pré-réfrigérés ainsi qu’un mortier et un pilon du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-les dans un grand seau à glace rempli de glace carbonique en poudre. Empilez ensuite le tamis numéro 25 sur le dessus du tamis numéro 40 dans le seau. Après avoir sorti les mouches congelées du congélateur, placez-les dans de l’azote liquide pendant environ 10 minutes.

Lorsque vous avez terminé, secouez vigoureusement le tube pour casser les têtes, les pattes et les ailes des corps. Ensuite, versez le mélange sur le tamis supérieur et secouez vigoureusement les tamis tout en les maintenant ensemble. Une fois terminé, séparez les deux tamis et transférez soigneusement les têtes de mouches du tamis inférieur au mortier froid sur la glace sèche dans un seau à glace, broyez les têtes avec le mortier et le pilon en particules poudreuses et transférez la poudre dans un broyeur de papier en verre de 15 millilitres pré-refroidi et pré-pesé.

Mesurez ensuite le poids du broyeur avec l’échantillon de tête et calculez le poids de l’échantillon de tête avec le broyeur en verre sur glace. Ajoutez 15 millilitres de tampon d’homogénéisation glacé préalablement préparé à la poudre et passez avec le pilon à grand dégagement jusqu’à ce que le pilon monte et descende facilement dans le broyeur. Ensuite, transférez l’homogénat dans un tube de centrifugation à grande vitesse et faites-le tourner pendant 20 minutes à environ 50 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius.

Une fois terminé, transférez le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation à grande vitesse. Après avoir répété la centrifugation, transférez le surnageant dans un tube ultra-centrifuge et faites-le tourner pendant 40 minutes à environ 250 000 fois la gravité à quatre degrés Celsius. Pour éliminer davantage le supernat pendant que l’échantillon est centrifugé, transférez 400 microlitres de billes d’immunoglobine g Sphero dans un tube de faucon de 15 millilitres.

Après avoir ajouté 10 millilitres de tampon de lavage d’immunoglobine G froide, secouez doucement le tube pendant deux minutes. Lorsque vous avez terminé, faites tourner les perles à 1000 fois la gravité pendant encore deux minutes. Après avoir répété ce processus deux fois de plus, retirez le tampon, ne laissant que les billes dans le tube après la centrifugation.

Transférez avec précaution environ 15 millilitres du surnageant éliminé dans le tube contenant les billes d’immunoglobine G. Incuber les billes et le lysat cérébral Mélanger à quatre degrés Celsius sur un mutateur pendant deux heures Dans une chambre froide, mettre en place une micro colonne propre et vide de 15 millilitres. Chargez le mélange de billes d’immunoglobine G en le versant régulièrement dans la colonne.

Une fois que le lysat cérébral a fait allusion à la colonne d’immunoglobine G stabilisée, lavez-le soigneusement avec 10 millilitres de tampon de lavage d’immunoglobine G froide. Répétez le lavage deux fois, en veillant à ne pas laisser sécher les perles. Après le troisième lavage, lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon de clivage TEV juste avant que la dernière goutte de tampon TEV ne se détache de la colonne.

Fermez le bas de la colonne avec un capuchon pour bloquer l’écoulement. Ajoutez ensuite 1,3 millilitre de tampon TEV contenant 130 unités d’enzyme TEV dans la colonne et fermez le haut avec un bouchon. Faites pivoter la colonne à 18 degrés Celsius pendant deux heures pour permettre à l’enzyme TEV de cliver le peptide au site TEV et de libérer le complexe protéique pendant que les billes d’immunoglobine sont incubées avec l’enzyme TEV.

Placez 200 microlitres de perles Cal Modlin dans un tube Falcon de 15 millilitres et lavez-les trois fois avec 10 millilitres de tampon de liaison cal modlin froid Pour chaque lavage. Faites basculer le tube pendant deux minutes sur un mutateur, puis faites tourner les perles à 1000 fois la gravité pendant deux minutes. À la fin du troisième lavage, retirez le tampon du tube.

Une fois l’incubation du TEV terminée, placez la colonne d’immunoglobine G dans la chambre froide et laissez les billes se déposer pendant 10 minutes. Retirez les capuchons supérieur et inférieur et récupérez le produit de décolletage TEV de 1,3 millilitre dans un tube faucon de 15 millilitres. Après avoir laissé le tampon s’écouler complètement, ajoutez 200 microlitres supplémentaires de tampon TEV à la colonne et collectez l’EENT dans le même tube.

Ensuite, ajoutez 4,5 millilitres de tampon de liaison Cal Modlin et 4,5 microlitres de chlorure de calcium molaire dans le tube de produit de clivage TEV de 1,5 millilitre. Transférez le mélange de six millilitres dans le tube contenant les billes de modlin cal. Après avoir fait tourner le tube sur un mutateur à quatre degrés Celsius pendant une heure, installez une autre micro-colonne de 10 millilitres propre et vide dans la chambre froide.

Chargez le mélange de billes de cal modlin dans la colonne et laissez-le s’écouler par gravité. Lorsque toute la solution a fait allusion à travers la colonne Cal Modlin décantée, lavez soigneusement la colonne deux fois avec 10 millilitres de tampon de liaison Modlin cal. Immédiatement après le lavage, ajoutez doucement 200 microlitres de tampon d’élution modlin à froid dans la colonne et collectez l’EIT avec un tube einor de 1,5 millilitre marqué.

Répétez cette étape quatre fois de plus pour collecter un total de cinq fractions. Ensuite, analysez la teneur en protéines de chaque fraction par page SDS. Conservez l’EIT restant à moins 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie.

La protéine interagissant avec Highwire et ses homologues vertébrés et invertébrés sont d’énormes ubiquitine ligase qui régulent le développement et la réparation du système nerveux. Les travaux effectués sur le ver, la mouche et la souris ont conduit au modèle de travail actuel selon lequel le fil de fer fonctionne comme une E trois ligases et comme une protéine d’échafaudage pour faciliter la formation d’un complexe d’ubiquitination multi-sous-unités, qui régule les fonctions neuronales spécifiques au temps et au type de cellule. Grâce à la combinaison de l’interaction avec différents cofacteurs et du ciblage de différents substrats d’ubiquitine.

Pour identifier le complexe d’ubiquitination associé à Highwire et l’étiquette terminale d’extrémité à l’UAS, exploitez un transgène highwire entièrement fonctionnel. Lors du sauvetage, le phénotype mutant a été généré environ 10 grammes de têtes de mouches adultes exprimant le tapotement seulement ou le tapotement : des protéines transgéniques ont été collectées et soumises à des procédures de tapotement côte à côte, comme décrit ci-dessus. Les EIT finaux des deux purifications ont été analysés par la page SDS, puis la spectrométrie de masse à coloration à l’argent a identifié une liste de protéines dans l’échantillon de haute voltige comprenant uniquement la drosophile, la FSN et la reone.

Des analyses génétiques et biochimiques ultérieures ont révélé que HIGHWIRE et DFSN travaillent ensemble comme un SCF, comme le complexe E trois ubiquitine ligase pour réguler la structure et la fonction synaptiques, et reone s’associe à highwire in vivo et freine la prolifération synaptique. Cette fonction de reone est au moins partiellement réalisée par sa capacité à promouvoir la stabilité des protéines de haute ligne en protégeant les protéines de haute ligne de la dégradation autophagique, ce qui révèle un nouveau mécanisme qui contrôle sélectivement l’abondance des protéines de haute ligne pendant le développement synaptique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois jours si elle est bien exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de générer la bonne forme de détection des transgènes, d’identifier la transformation qui exprime le transgène au niveau approprié, et enfin, et surtout, de financer les bonnes conditions tampons qui non seulement solubilisent la protéine de base, mais préservent également les complexes intacts d’InVivo à un état relativement stable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon de connecter le doute, de voler et d’effectuer une expérience de purification d’affinité en tandem pour purifier en injectant des protéines de vos gènes préférés dans les neurones.