Nanoparticules PLGA formées par une ou deux émulsions avec de la vitamine E-TPGS

L'objectif général de cette procédure est de former des nanoparticules polymériques de taille ajustable. Cela est réalisé en dissolvant d'abord un polymère dans un solvant organique et en ajoutant un médicament ou un agent encapsulant fluorescent. La deuxième étape consiste à émulsionner le polymère avec une phase aqueuse contenant l'agent émulsifiant, puis à laisser les particules durcir dans un volume aqueux plus important tandis que le solvant s'évapore.

Ensuite, les particules sont lavées, recueillies par centrifugation et lyophilisées pour un stockage à long terme. La dernière étape consiste à caractériser la taille des nanoparticules et la morphologie de leur surface par microscopie électronique à balayage ou imagerie SEM. En définitive, la MEV est utilisée pour démontrer que la taille des nanoparticules peut être contrôlée en faisant varier la concentration d'émulsifiant.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie d'une variété de maladies humaines, car les particules peuvent être personnalisées pour encapsuler et délivrer une large gamme d'agents thérapeutiques afin d'assurer une action prolongée. Dans le tissu cible. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.

Les étapes d'émulsification sont difficiles à maîtriser car des aspects subtils de la formation de l'émulsion peuvent avoir un impact significatif sur les propriétés des particules. Pour commencer la préparation des nanoparticules, placez environ 100 milligrammes d'acide polylactique-co-glycolique, également connu sous le nom de PLGA, dans un tube à essai de 13 sur 100 millimètres. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique en verre, transférez un millilitre d’acétate d’éthyle dans l’échantillon, couvrez l’extrémité du tube avec du papier d’aluminium, puis scellez hermétiquement le papier d’aluminium avec du film parafilm.

Veillez à bien serrer le parafilm fermement le long du bord supérieur du flacon et du bord inférieur de la feuille d'aluminium afin d'éviter l'évaporation du solvant. Marquez le niveau du solvant sur le tube à essai et laissez le polymère se dissoudre toute la nuit. Le lendemain, ajoutez du solvant supplémentaire si une évaporation s'est produite.

Préparez le matériel et les produits suivants dans une hotte aspirante située à proximité de l'ultrason. Vortexez deux petites pipettes Pasteur en verre équipées de embouts en caoutchouc et d'un agitateur magnétique. De plus, placez un grand bécher rempli d'eau glacée sur un support en dessous de l'ultrason.

Ensuite, ajoutez 45 millilitres de T-P-G-S de vitamine E à 0,3 % poids par volume dans un flacon en verre de 200 millilitres, puis réglez la vitesse d'agitation à 360 tr/min. Ajoutez ensuite deux millilitres du T-P-G-S de vitamine E à 0,3 % poids par volume dans un tube à essai en verre de 13 sur 100 millimètres. Afin d'incorporer les agents hydrophobes, ajoutez l'agent d'encapsulation directement dans la solution polymérique, en prenant soin d'éviter les parois du tube à essai, puis vortexez le tube jusqu'à ce que l'agent d'encapsulation soit uniformément dispersé.

Pour les agents hydrophiles, émulsifier l'agent encapsulant avec la solution polymère. Ajouter jusqu'à 50 microlitres de médicament en tampon à la surface de la solution polymère. Soniquer une dizaine de secondes sur glace ou jusqu'à obtention d'une solution opaque et homogène.

Ensuite, agiter vigoureusement le tube à essai contenant le T-P-G-S de vitamine E à vitesse élevée tout en tenant le tube verticalement. Maintenir la pipette en verre à une distance d’un à deux centimètres au-dessus de l’ouverture du tube en vortex, et ajouter lentement la solution polymérique goutte à goutte à la surface du liquide en vortex. Veiller à ce que la pipette ne touche pas les parois du tube une fois que toute la solution polymérique a été ajoutée.

Poursuivez le vortexage de la solution. Formez maintenant une émulsion pendant 15 secondes. Transférez immédiatement le polymère émulsifié vers l'ultrasonateur.

Gardez le tube à essai immergé dans de l’eau glacée et soumettez l’émulsion à trois cycles de sonication de dix secondes chacun. Déplacez l’émulsion vers le haut et le bas de la sonde afin d’assurer une sonication uniforme, et évitez de toucher les parois ou le fond du tube à essai avec la sonde. Faites une pause de cinq à dix secondes entre chaque cycle de dix secondes pour permettre au milieu de refroidir avant de poursuivre.

Ensuite, ajouter un à deux millilitres de T-P-G-S à 0,3 % de vitamine E provenant de la solution agitée à l'émulsion. Cela va fluidifier le polymère émulsifié, facilitant ainsi son versement ; verser l'émulsion dans la solution agitée. Rincer toute solution résiduelle présente dans le tube à essai en la transférant dans la solution agitée.

Laisser durcir les nanoparticules en agitant pendant trois heures. Si l'agent d'encapsulation est sensible à la lumière, envelopper le bécher dans du papier d'aluminium et laisser l'ouverture découverte afin de faciliter l'évaporation du solvant pour recueillir les nanoparticules. Commencer par répartir les nanoparticules dans deux tubes à centrifuger Oak Ridge de volume nominal de 30 millilitres et les équilibrer à 0,1 gramme près l'un de l'autre. Puis centrifuger les nanoparticules dans un rotor à angle fixe pendant 15 minutes à 17 000 ×g.

RC f. Des durées de centrifugation plus longues permettront la collecte d'une fraction plus élevée de nanoparticules plus petites. Jeter le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot de nanoparticules.

Ajoutez cinq millilitres d'eau distillée et utilisez un bain-marie, un agitateur et un vortex pour suspendre complètement les nanoparticules. Réunissez le contenu des deux tubes à centrifuger dans un seul tube et ajoutez 20 millilitres d'eau distillée pour un volume total de 30 millilitres. Répétez ensuite les étapes de centrifugation et de lavage deux fois supplémentaires, pour un total de trois lavages.

Le volume de liquide de la dernière suspension du culot doit être de quatre à cinq millilitres. Congelez une petite aliquote de nanoparticules dépourvues de télomères pour l'imagerie MEB, en laissant le reste. Ajoutez un rapport pondéral de un à deux de TLO par rapport au polymère comme protecteur cryogénique afin d'obtenir une suspension complète et uniforme des nanoparticules de PLGA.

Cela empêchera la formation de cristaux de glace qui pourraient endommager la surface des particules et induire une agrégation. Transférez les nanoparticules dans un tube de centrifugation de cinq millilitres préalablement pesé, puis congélez à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Ensuite, retirez le bouchon du tube et recouvrez l'ouverture en fixant un morceau de papier absorbant de laboratoire sur le dessus à l’aide d’un élastique.

Déplacer rapidement afin que le contenu ne fonde pas, si une fusion se produit. Recongeler avant de placer dans le lyophilisateur, puis lyophiliser l'échantillon de cinq millilitres pendant 72 heures. Ensuite, remettre le bouchon et envelopper le tube pour stocker les particules lyophilisées à moins 80 degrés Celsius.

Le jour de l'imagerie, placez une bande de ruban adhésif en carbone double face sur une embase SEM. Étiquetez la partie métallique de l'embase à l'aide d'un marqueur indélébile pour référence ultérieure. Utilisez une spatule métallique pour prélever une petite quantité de nanoparticules lyophilisées et répartissez-les délicatement sur la surface du ruban.

Brosser la surface du support avec un tissu de laboratoire ou utiliser de l'air comprimé pour éliminer les nanoparticules libres. Visualiser les particules en utilisant une distance de travail de cinq à 15 millimètres, une intensité de cinq à 12 kilovolts et une taille de spot de un à trois ; des intensités de faisceau plus élevées peuvent entraîner un chauffage localisé de l'échantillon, ce qui modifiera la morphologie de surface des particules. Les microparticules sont observées à un grossissement de 100 fois et les nanoparticules seront discernables à 3000 fois.

Ajustez le grossissement pour focaliser sur le sommet d'une sphère afin de localiser les particules facilement visualisables au MEB, et collectez au moins trois images par lot afin d'obtenir un échantillon représentatif de la taille et de la morphologie des particules. À l’aide de cette méthode, des particules peuvent être créées par une émotion unique, apparaissant comme des sphères individuelles non fusionnées, ayant une morphologie de surface lisse et une large gamme de tailles réparties dans l’échantillon. Les microparticules présentées ici ont un diamètre moyen de 730 nanomètres.

Des nanoparticules créées par une émulsion unique qui encapsulent le médicament hydrophobe campin sont montrées ici. Ces particules se sont avérées encore plus petites, avec un diamètre moyen de 340 nanomètres. Des concentrations plus élevées d'émulsifiant ont produit des particules plus petites, le diamètre moyen passant de 2000 à 200 nanomètres.

Alors que la concentration de l'émulsifiant augmentait de 0,01 à 0,3 %, comme le montrent ici les images MEB. Toutefois, lorsque la concentration de vitamine E-T-P-G-S était trop élevée, des particules distinctes ne se formaient pas ; lorsque 1 % de vitamine E-T-P-G-S était utilisé, des fusions importantes et des structures en forme de feuillet étaient observées dans l'ensemble de la structure. Vrai. Une fois que vous aurez appris à fabriquer des nanoparticules de PLG par émulsification, d'autres méthodes telles que la modification de surface peuvent être réalisées afin de concevoir des nanoparticules capables d'interagir avec des types cellulaires spécifiques ou des régions particulières du corps.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment former des particules de taille reproductible et ajustable par émulsification.