Name: Nanoparticules PLGA formées par une ou deux émulsions avec de la vitamine E-TPGS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Apprenez à former des nanoparticules PLGA de taille ajustable par émulsion avec de la vitamine E-TPGS. Cette méthode permet de contrôler le diamètre des particules pour des applications de libération de médicaments.

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1. Préparation des nanoparticules
Toutes les étapes impliquant un solvant ou un polymère dissous/émulsionné doivent être effectuées dans une hotte chimique.
<ol>
	<li>Peser 100 mg (+/- 5 mg) d’acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) et les placer dans un tube à essai de 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Transvasez 1 ml de solvant (acétate d’éthyle (EtAc) ou dichlorométhane (DCM)) sur l’échantillon à l’aide d’une pipette sérologique en verre.</li>
	<li>Couvrez le haut du tube avec un petit morceau de papier d’aluminium et Parafilm le film en toute sécurité, en veillant à bien enrouler le Parafilm sur le bord supérieur du flacon ainsi que sur le bord inférieur du ballon.</li>
	<li>Marquez le niveau du solvant à l’extérieur du tube à essai. Laissez le polymère se dissoudre pendant la nuit, en ajoutant du solvant supplémentaire le lendemain en cas d’évaporation. 
	Remarque : Le polymère peut également être dissous le jour de la préparation des nanoparticules, si nécessaire. Suivez les étapes 1.1 à 1.3, puis faites un effet vortex à puissance élevée jusqu’à ce que tout le polymère soit complètement dissous (~10 min).</li>
	<li>Préparez une zone de travail dans la hotte avec l’équipement/le matériel suivant à côté de l’ultrasoniseur : un vortexeur, deux petites pipettes Pasteur en verre avec des ampoules en caoutchouc et une plaque d’agitation magnétique. Placez un grand bécher rempli d’eau glacée sur un support sous l’ultrasonateur.</li>
	<li>Ajoutez 45 ml de vitamine E-TPGS à 0,3 % p/v dans un bécher en verre de 200 ml avec une barre d’agitation magnétique et réglez la vitesse d’agitation à 360 tr/min.</li>
	<li>Ajouter 2 ml de vitamine E-TPGS à 0,3 % p/v dans un tube à essai en verre de 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Ajouter drug : 
	Pour les agents hydrophobes : ajouter l’encapsulant directement à la solution polymère (en prenant soin d’éviter les parois du tube à essai) et agiter le tube jusqu’à ce que l’encapsulant soit dispersé de manière homogène. 
	Pour les agents hydrophiles : émulsionner l’encapsulant avec la solution polymère avant de continuer. Ajouter jusqu’à 50 μl de médicament dans de l’eau ou un tampon à la surface de la solution polymère. Ultrasoniser brièvement pour émulsionner le médicament avec un polymère (généralement 10 secondes, ou au besoin pour obtenir une solution homogène et opaque). Cette étape de sonication doit être réalisée sur glace.</li>
	<li>Placez le polymère/encapsulant à tube ouvert près du vortexer. Tout en tenant le tube à essai contenant de la vitamine E-TPGS verticalement et à fort vortex, utilisez une pipette Pasteur en verre pour ajouter la solution polymère/encapsulant goutte à goutte. Veillez à éviter les côtés du tube et à déposer la solution de polymère directement sur la surface de l’émulsifiant vortex. Une fois que la totalité de 1 ml de solution de polymère a été ajoutée à la vitamine E-TPGS, continuez à faire tourbillonner la solution (maintenant une émulsion) pendant 15 secondes supplémentaires.</li>
	<li>Transférez immédiatement le polymère émulsionné dans l’ultrasonateur. Gardez le tube à essai immergé dans de l’eau glacée et sonisez l’émulsion en trois rafales de 10 secondes (amplitude de 40 % pour un sonicateur de 700 W, taille de pointe de sonde de 1/8 po). Déplacez l’émulsion de haut en bas de la sonde pour assurer une sonication uniforme, en prenant soin d’éviter de toucher la sonde sur les côtés ou au fond du tube à essai. Faites une pause entre chaque sonication de dix secondes pour permettre à la solution de refroidir avant de continuer.</li>
	<li>Ajoutez 1 à 2 ml de vitamine E-TPGS à 0,3 % de la solution d’agitation à l’émulsion à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, ce qui dilue le polymère émulsionné afin qu’il se verse plus facilement. Videz l’émulsion dans la solution d’agitation. Répétez cette étape pour laver toute solution restante du tube à essai dans la solution d’agitation.</li>
	<li>Laissez les nanoparticules durcir en remuant pendant trois heures. Si l’encapsulant est sensible à la lumière, le bécher peut être enveloppé dans une feuille d’aluminium, en laissant le dessus ouvert pour faciliter l’évaporation du solvant.</li>
</ol>
2. Collection de nanoparticules
<ol>
	<li>Séparez les nanoparticules durcies dans deux tubes à centrifuger Oak Ridge (volume nominal de 30 ml) et équilibrez-les à 0,1 g près.</li>
	<li>Centrifugez les nanoparticules dans un rotor à angle fixe pendant 15 min à 17 000 x g. Des temps de centrifugation plus longs entraîneront la collecte d’une fraction plus élevée de nanoparticules plus petites.</li>
	<li>Jetez le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille de nanoparticules (l’eau peut être versée ou pipetée). Ajoutez 15 ml de diH2O et utilisez un sonicateur à bain d’eau et/ou un vortex pour remettre complètement les nanoparticules en suspension.</li>
	<li>Combinez le contenu des deux tubes de centrifugation en un seul et répétez les étapes 2.1-2.3 2 fois plus, pour un total de trois lavages dans 30 ml de diH2O à chaque fois. Le volume de liquide de la dernière remise en suspension des granulés doit être de 4 à 5 ml. 
	Un rapport pondéral de 1:2 tréhalose :polymère peut être ajouté à ce stade comme cryoprotecteur (congeler une petite aliquote de nanoparticules sans tréhalose pour l’imagerie MEB). Les cristaux de glace qui se forment pendant le processus de congélation peuvent endommager la surface des particules et induire une agrégation, et il a été démontré que l’inclusion de tréhalose améliore la remise en suspension uniforme et complète des nanoparticules PLGA13.</li>
	<li>Transférez les nanoparticules dans un tube à centrifuger prépesé de 5 ml et congelez-les à -80 °C pendant au moins 30 min.</li>
	<li>En vous déplaçant rapidement pour ne pas laisser fondre le contenu congelé, débouchez le tube et couvrez le haut en fixant le tissu de laboratoire sur le dessus avec un élastique. **En cas de fusion, recongelez avant de le placer dans le lyophilisateur.</li>
	<li>Lyophiliser 72 h pour un volume de 5 ml. Stockez les particules lyophilisées dans un tube enveloppé de Parafilm à -80 °C.</li>
</ol>
3. Dimensionnement et morphologie de surface
Microscopie électronique à balayage
<ol>
	<li>Les échantillons pour MEB doivent être préparés le jour de l’imagerie. Placez une bande de ruban de carbone double face sur un talon de MEB. Un marqueur permanent peut être utilisé pour étiqueter la partie métallique du talon pour référence ultérieure.</li>
	<li>À l’aide d’une spatule métallique, prélevez une petite quantité de nanoparticules lyophilisées et étalez-les doucement sur la surface du ruban. Brossez la surface du talon avec un mouchoir de laboratoire ou utilisez de l’air comprimé pour éliminer les nanoparticules libres.</li>
	<li>Enduire l’échantillon d’or-paladium pendant 30 à 120 secondes. Un temps de pulvérisation plus long produira une surface plus lisse pour l’imagerie, bien que cela puisse entraîner la perte de détails de surface fins.</li>
	<li>Les paramètres typiques de visualisation des particules sont une distance de travail de 5 à 15 mm, une intensité de faisceau de 5 à 12 kV et une taille de spot de 1 à 3. Des intensités de faisceau plus élevées peuvent entraîner un échauffement régional de l’échantillon, ce qui modifiera la morphologie de surface des particules. Les microparticules sont observées à un grossissement de 100X et les nanoparticules seront distinguables à un grossissement de 3 000X.</li>
	<li>L’échantillon idéal consistera en un revêtement uniforme de particules sur la surface plane du talon. Parfois, des structures secondaires (y compris des flocons ou des sphères) peuvent résulter de la lyophilisation. En se concentrant sur le bord d’un flocon, là où le flocon rencontre le ruban, ou sur le haut d’une sphère, vous aiderez à localiser les particules qui peuvent être facilement visualisées avec le MEB. Collectez au moins trois images par lot afin d’obtenir un échantillon représentatif de la taille et de la morphologie des particules.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les particules PLGA sont généralement préparées par émulsion simple ou double, une méthode qui permet de personnaliser les caractéristiques des particules telles que la taille, l’encapsulant et les propriétés de surface7. Ces propriétés et d’autres dépendent de nombreuses variables, notamment le type de solvant, les rapports d’alimentation, la méthode d’émulsification et le type d’émulsifiant. Cependant, d’après notre expérience, il est possible pour un seul expérimentateur de produire des particules aux propriétés constantes. En utilisant le même protocole, un expérimentateur bien formé a produit sept lots distincts de nanoparticules avec les diamètres moyens suivants : 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 et 364 nm±110. La moyenne des lots de l'expérimentateur bien entraîné donne un diamètre moyen de 340 nm±25 et un écart-type moyen à l'intérieur du lot de 110 nm±8. Un second expérimentateur, formé par le premier, a utilisé le même protocole pour produire des nanoparticules d’un diamètre moyen de 328 nm±138. Cependant, un troisième expérimentateur, qui fabriquait des nanoparticules indépendamment depuis plusieurs mois, a suivi le même protocole pour produire des nanoparticules d’un diamètre moyen de 220 nm±70. Ainsi, il est possible de fabriquer des particules avec une gamme attendue de diamètres, mais cela dépend de la réplication exacte d’une technique expérimentale subtile. La mise en commun des lots peut permettre de produire de grandes quantités de nanoparticules ayant des propriétés d’agrégat identiques. Par exemple, lorsque nous modifions la surface de nanoparticules pour une étude in vitro ou in vivo , plusieurs lots (jusqu’à 6) de 200 mg sont préparés, lavés, recueillis, mélangés dans un seul tube, puis divisés pour la modification de surface. Cela garantit que la taille des nanoparticules, la charge du médicament, la charge et la fraction des sites de surface disponibles pour la modification seront comparables entre deux groupes de traitement. Dans un autre exemple, si la variable d’intérêt est l’efficacité du médicament avec différents agents chargés dans différents lots de nanoparticules, il est important de mesurer et de contrôler la variabilité de la charge du médicament. Il est essentiel que les propriétés des particules soient mesurées pour chaque lot de particules produites, et que les expériences soient conçues et reproduites pour contrôler la variabilité d’un lot à l’autre.
L’émulsion complète des phases organique et aqueuse est essentielle à la formation de petites particules. Le poly(alcool vinylique) (PVA) est peut-être l’émulsifiant le plus couramment utilisé. Nous et d’autres avons utilisé une variété d’agents émulsifiants et stabilisants, y compris la vitamine E-TPGS9, le PVA14, le spans15 et le poloxamères16 (pour une discussion approfondie de la large gamme d’agents utilisés pour la production de particules PLGA, voir l’examen de Wischke et al.17). Un polymère correctement émulsionné apparaîtra sous la forme d’une solution homogène, blanc laiteux/opaque. Une émulsion médiocre (ou « cassée ») présentera une hétérogénéité ou une granularité macroscopique, et elle peut même se séparer en deux couches visuellement distinctes dans le tube. Cela indique généralement un échec à former des nanoparticules. L’émulsion peut se rompre après l’étape 1.9 si elle n’est pas immédiatement transférée à l’ultrasonisateur. Si cela se produit, agitez à nouveau jusqu’à ce qu’il soit homogène et passez immédiatement au sonicateur. La séparation ne doit pas se produire après l’étape de sonication (1.10). Une fois que les particules ont été dispersées dans un volume aqueux plus important (étape 1.11), la solution doit être uniformément opaque à légèrement translucide. La qualité translucide augmentera à mesure que la taille des particules diminuera, et une teinte bleue peut être observée pour les très petites nanoparticules. Cette teinte peut ne pas être observée si des particules encapsulent un médicament. Si l’émulsion ne parvient pas à se disperser uniformément dans le grand volume aqueux ou si elle apparaît granuleuse, l’expérience ne doit pas se poursuivre. Il est normal d’observer une certaine variation dans l’apparence de la pastille de particules, ainsi que dans sa cohésion. Certaines pastilles peuvent se remettre en suspension lors d’un léger tourbillon, tandis que d’autres peuvent prendre plusieurs minutes de sonication au bain-marie. La remise en suspension ne devrait pas prendre plus de 5 min. Les particules lyophilisées peuvent prendre une variété de textures, allant du coton à l’écoulement libre.
L’un des nombreux avantages du PLGA en tant que matériau nanoparticulaire est la possibilité d’optimiser le processus de fabrication pour créer la taille de particule souhaitée pour l’application prévue. Les nanoparticules plus grosses encapsulent une fraction plus élevée de médicament hydrophobe (par rapport au poids du polymère) que les petites nanoparticules, cependant, la cinétique de libération du médicament peut également être affectée18-20. La taille des nanoparticules a un effet direct sur les mécanismes d’internalisation des particules par les cellules, ainsi que sur leur distribution dans les tissus, ce qui peut entraîner des différences spectaculaires dans l’efficacité de l’administration. Par exemple, le système phagocytaire mononucléaire marquera et éliminera les agents en circulation systémique qui sont supérieurs à 1 μm. Les petites nanoparticules peuvent être intéressantes pour une perfusion directe dans le cerveau, où les nanoparticules plus grosses seraient piégées dans la matrice extracellulaire serrée ; L’administration de petites nanoparticules pourrait également faciliter le ciblage passif des tumeurs via l’effet de perméation et de rétention amélioré. L’efficacité de l’encapsulation du médicament varie considérablement en fonction des propriétés du médicament spécifique, de la taille de la particule et de l’émulsifiant (c’est-à-dire sa solubilité dans l’eau par rapport au solvant). L’émulsion simple ou double affectera également la charge du médicament et la taille des nanoparticules. L’encapsulation d’agents hydrophobes par émulsion simple peut aider à la production de nanoparticules ultra-petites, par rapport à la méthode à double émulsion. Nous dirigeons le lecteur vers d’autres ressources pour une discussion approfondie de ce sujet23-28. Enfin, d’autres méthodes d’émulsification sont disponibles, y compris l’homogénéisation à grande vitesse, et ces autres approches peuvent présenter des avantages pour des types spécifiques de médicaments ou des applications d’administration de médicaments29.
La méthode de l’émulsion unique offre la possibilité de varier un large éventail de variables de formulation, chacune d’entre elles étant capable de modifier les propriétés des nanoparticules. Par exemple, l’utilisation du dichlorométhane (DCM) comme solvant produira généralement des nanoparticules plus grosses avec une distribution de taille plus large. Étant donné que l’acétate d’éthyle (EtAc) est miscible dans l’eau, la tension superficielle de la gouttelette de polymère dans l’émulsion primaire est diminuée, produisant des nanoparticules plus petites. Le DCM peut être substitué au même volume d’EtAc. D’autres solvants ou mélanges de solvants peuvent être utilisés pour optimiser l’encapsulation des médicaments et les propriétés des particules. D’autres paramètres de formulation sont également capables de modifier la taille des particules : par exemple, l’augmentation du volume de solvant, du rapport solvant/polymère, de l’intensité de la sonication ou de la vitesse/durée de la centrifugation entraînera une diminution de la taille des particules collectées. Il est possible de dimensionner les particules fractionnées en effectuant une centrifugation séquentielle (par exemple, une centrifugation rapide à basse vitesse pour éliminer d’abord les particules plus grosses, suivie d’un essorage plus long pour collecter les particules ultra-petites) ou en filtrant.
Nous décrivons ici les paramètres de formulation qui permettent la préparation de particules PLGA avec des diamètres moyens allant de 220 nm à 1,98 μm. Ces méthodes de production de particules composées de PLGA peuvent être utilisées pour optimiser la conception des particules (taille, encapsulant et propriétés de surface) pour de futures applications d’administration de médicaments in vitro ou in vivo.

Les polymères sont devenus des véhicules d’administration de médicaments de plus en plus populaires au cours des dernières décennies pour des applications allant de la thérapie tumorale ciblée1 à la modulation du système immunitaire2. Les médicaments encapsulés ou conjugués dans des polymères sont souvent plus efficaces que leurs homologues administrés librement, car les médicaments associés aux polymères sont protégés contre la dégradation. Cette protection se traduit par une demi-vie biologique plus longue et une efficacité potentiellement améliorée avec une réduction des effets secondaires systémiques3-5.
Poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) présente bon nombre des propriétés idéales d’un système d’administration à l’échelle nanométrique, assurant la libération à long terme de l’agent encapsulé et se dégradant en produits biocompatibles d’acide lactique et glycolique. De petites molécules, des protéines et des acides nucléiques encapsulés dans la PLGA ont démontré une activité accrue dans une variété d’applications pathologiques8. Il est important de noter que la plate-forme matérielle facilite la personnalisation de fonctionnalités telles que la taille, la charge et l’affichage de surface des ligands pour cibler des particules sur des tissus spécifiques ou à des fins d’imagerie. Étant donné que la PLGA est déjà utilisée chez l’homme sous forme de sutures biodégradables (par exemple, Purasorb, Purac Biomaterials et Vicryl, Ethicon Inc.), le potentiel d’application clinique est élevé.
L’émulsion huile-eau (simple) ou eau-huile-eau (double) est une méthode par laquelle le PLGA peut être utilisé pour encapsuler des médicaments hydrophobes et hydrophiles sous forme micro ou nanométrique. En bref, la PLGA est dissoute dans une phase organique (huile) qui est émulsionnée avec un tensioactif ou un stabilisant (eau). Les médicaments hydrophobes sont ajoutés directement à la phase huileuse, tandis que les médicaments hydrophiles (eau) peuvent d’abord être émulsionnés avec la solution de polymère avant la formation des particules. Les rafales de sonication de haute intensité facilitent la formation de petites gouttelettes de polymère. L’émulsion résultante est ajoutée à une phase aqueuse plus grande et agitée pendant plusieurs heures, ce qui permet au solvant de s’évaporer. Les nanoparticules durcies sont collectées et lavées par centrifugation (Figure 1).
Ici, nous décrivons une technique de fabrication de nanoparticules PLGA en utilisant une ou deux émulsions, avec de l’acétate d’éthyle (EtAc) comme solvant et du succinate de polyéthylène glycol de vitamine E-D-α-Tocophérol (TPGS) comme agent émulsifiant. L’utilisation de la vitamine E-TPGS offre plusieurs avantages possibles par rapport à d’autres types d’agents stabilisants (par exemple, poly(alcool vinylique), PVA), notamment une efficacité accrue de l’émulsification et de l’encapsulation. D’autres groupes ont signalé les avantages de la vitamine E-TPGS, notamment l’inhibition de la P-gp, une protéine d’efflux transmembranaire, qui est généralement surexprimée sur les cellules cancéreuses et connue pour contribuer à la résistance aux médicaments en faisant la navette entre les médicaments et les cellules cibles. De plus, nous démontrons comment caractériser et dimensionner les particules à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB) et fournissons des conseils supplémentaires sur la modification de la taille via l’altération du protocole.

<table><tbody><tr><td>Poly(acide lactique-co-glycolique) &amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>Viscosité intrinsèque : 0,55-0,75 dl/g</td></tr><tr><td>Acétate d'éthyle (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de méthylène (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamine E TPGS</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polyvinylique</td><td></td><td></td><td>Hydrolysé à 87-89 %, 30 000-70 000 Da</td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dismembrateur à ultrasons</td><td>Fisher Scientific</td><td>Modèle 705</td><td>700 W (Ultrasonicateur)</td></tr><tr><td>Embout de sonicateur</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 po</td></tr><tr><td>Vortexeur</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur multiposition</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur à angle fixe</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>Bain à ultrasons</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisateur</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

nanoparticules plga formées par une ou deux émulsions avec de la vitamine e-tpgs

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

L’acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) est un membre biocompatible de la famille des polymères biodégradables de polyester aliphatique. La PLGA est depuis longtemps un choix populaire pour les applications d’administration de médicaments, d’autant plus qu’elle est déjà approuvée par la FDA pour une utilisation chez l’homme sous forme de sutures résorbables. Les médicaments hydrophobes et hydrophiles sont encapsulés dans des particules PLGA par simple ou double émulsion. En bref, le médicament est dissous avec un polymère ou émulsionné avec un polymère dans une phase organique qui est ensuite émulsionnée avec la phase aqueuse. Une fois le solvant évaporé, les particules sont lavées et collectées par centrifugation pour la lyophilisation et le stockage à long terme. La PLGA se dégrade lentement par hydrolyse dans des environnements aqueux, et les agents encapsulés sont libérés sur une période de quelques semaines à quelques mois. Bien que le PLGA soit un matériau qui présente de nombreux avantages pour l’administration de médicaments, la formation reproductible de nanoparticules peut être difficile ; Une variabilité considérable est introduite par l’utilisation de différents équipements, lots de réactifs et méthodes précises d’émulsification. Ici, nous décrivons en détail la formation et la caractérisation des microparticules et des nanoparticules formées par émulsion simple ou double à l’aide de l’agent émulsifiant vitamine E-TPGS. La morphologie et la taille des particules sont déterminées par microscopie électronique à balayage (MEB). Nous fournissons des images MEB représentatives de nanoparticules produites avec une concentration variable d’émulsifiant, ainsi que des exemples d’artefacts d’imagerie et d’émulsifications défaillantes. Ce protocole peut être facilement adapté à l’utilisation d’émulsifiants (par exemple, poly(alcool vinylique), PVA) ou de solvants (par exemple, dichlorométhane, DCM).

Des images représentatives au MEB de microparticules et de nanoparticules en PLGA préparées selon ce protocole sont présentées dans les Figures 2a et 2b. Les particules apparaîtront sous forme de sphères individuelles, non fusionnées, avec une morphologie de surface lisse et une large gamme de tailles réparties dans l'échantillon.
Pour déterminer le diamètre moyen de chaque lot, des mesures sont effectuées directement sur les images de MEB à l'aide de la fonction « mesure » d'ImageJ. Un minimum de 150 mesures du diamètre de particules sélectionnées aléatoirement dans le champ observé doit être réalisé afin d'obtenir une distribution de taille représentative. La taille moyenne d'un lot de particules dépend des paramètres de formulation. Par exemple, sur la figure 2a, des microparticules (diamètre moyen de 730 nm±370) ont été obtenues avec 1 ml de solvant pour 100 mg de PLGA, en utilisant 0,05 % de Vitamine E-TPGS dans la phase émulsifiante, tandis que sur la figure 2b, des nanoparticules (diamètre moyen de 340 nm±70) ont été formées avec 4 ml de solvant pour 200 mg de PLGA, encapsulant le médicament hydrophobe camptothécine et en utilisant 0,3 % de Vitamine E-TPGS dans la phase émulsifiante (les paramètres complets de formulation sont décrits dans la légende de la figure). D'une manière générale, une concentration plus élevée d'émulsifiant produit des particules plus petites, des diamètres moyens compris entre 220 et 2 000 nm pouvant être obtenus en faisant varier la concentration en émulsifiant de 0,3 à 0,01 % (figure 3).
Nos rendements varient de 74 à 98 % (22 lots de nanoparticules préparés avec différents solvants, émulsifiants et conditions d'émulsification par un seul expérimentateur). Des rendements supérieurs peuvent être observés pour des lots plus gros (&gt;150 nm), car les nanoparticules de petite taille sont facilement perdues lors de la centrifugation et de l'étape de lavage, en particulier lorsque le surnageant est versé hors du culot. Un pipetage soigneux du liquide peut aider à éviter ce problème. Des vitesses plus élevées et/ou une centrifugation plus longue peuvent également améliorer le rendement, à la fois en favorisant la récupération de la fraction ultra-fine de nanoparticules et en compactant davantage le culot, réduisant ainsi les pertes lors du lavage. Le protocole décrit ici vise principalement à produire des particules utilisant le TPGS comme agent émulsifiant et l'EtAc comme solvant, bien qu'il soit possible d'utiliser d'autres solvants et/ou agents émulsifiants. En général, nous constatons que l'EtAc produit des nanoparticules plus petites et plus uniformes en taille que le DCM (par exemple, des diamètres de 540 nm±190 contre 2 160 nm±1 530 pour l'EtAc et le DCM respectivement, 100 mg/ml de PLGA dans le solvant, émulsifié dans 2 ml de TPGS à 0,1 %), probablement parce que l'EtAc est miscible à l'eau, contrairement au DCM. Le PVA est un agent émulsifiant couramment utilisé, largement employé par notre équipe et d'autres groupes. Nous avons observé une variabilité des nanoparticules préparées à partir de différents lots de PVA disponible commercialement. Il est donc conseillé, dans la mesure du possible, d'utiliser le même stock de PVA afin d'améliorer la reproductibilité. Selon nos observations, le PVA agit comme un émulsifiant plus efficace à des concentrations nettement plus élevées que le TPGS (par exemple, un diamètre de 140 nm±48, 100 mg/ml de PLGA dans le DCM, émulsifié dans 2 ml de PVA à 5 %).
La caractérisation des nanoparticules par MEV peut s'avérer difficile en raison des différences d'équipement et de procédé d'imagerie. Il est donc essentiel de distinguer les caractéristiques morphologiques indiquant des problèmes de formation des particules de celles qui résultent d'artéfacts introduits involontairement lors de l'imagerie. La fusion (Figures 4a et 4b), le crénelage (Figure 4c) ou la fissuration (Figure 4f) des particules sont parfois observées sur les images MEV. Ces artéfacts peuvent parfois indiquer des particules mal formées (par exemple, dans la Figure 4a, la concentration en émulsifiant était trop élevée pour former des particules distinctes), mais peuvent également résulter d'artéfacts induits par la méthode de caractérisation (par exemple, dans la Figure 4b, l'échantillon a chauffé lors du dépôt de la couche par pulvérisation cathodique, et dans la Figure 4c, un chauffage local dû au faisceau du MEV a modifié la morphologie de surface des particules pendant l'acquisition de l'image). Pour éviter les artéfacts d'imagerie, la durée du dépôt par pulvérisation cathodique doit être minimisée et la puissance du faisceau maintenue faible. Des morphologies plus lisses sont observées pour des durées de pulvérisation plus longues ; toutefois, cela peut provoquer la fusion des particules. Des durées de pulvérisation trop courtes peuvent rendre l'imagerie difficile, car les particules s'électrisent et se déplacent pendant la capture de l'image. L'acquisition rapide des images permet d'éviter une exposition prolongée au faisceau et la déformation des images (Figures 4d et 4e). Une exposition élevée au faisceau peut également entraîner une expansion et une fissuration de la surface des nanoparticules (Figure 4f). Si les artéfacts morphologiques ne peuvent être réduits en modifiant les paramètres de caractérisation, il est possible qu'ils reflètent des problèmes réels liés aux nanoparticules elles-mêmes. Pendant le processus de fabrication, la fusion peut résulter d'une surchauffe due à une puissance élevée d'ultrasonication, à une évaporation incomplète du solvant, à une resuspension incomplète lors de la phase de lavage, ou à un échec de lyophilisation.
<img alt="Procédé de séparation de l'huile et de l'eau ; sonication, évaporation, collecte ; schéma de lyophilisation." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1. Schéma de fabrication des nanoparticules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille réelle</a>.
<img alt="Structure des nanoparticules (MEB) et distribution des tailles (μm, nm), tableau d'analyse comparative." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2. Images de microscopie électronique à balayage (MEB) et distributions de taille correspondantes des microparticules et nanoparticules de PLGA produites par la méthode d'émulsion simple. En (A), les particules ont été formées en émulsifiant 100 mg de PLGA dissous dans 1 ml d'acétate d'éthyle dans 2 ml de 0,05 % de Vitamin E-TPGS, puis durcies dans 45 ml de 0,01 % de Vitamin E-TPGS. La distribution de taille correspondante est présentée en (C). En (B), les particules ont été formées en émulsifiant 200 mg de PLGA et 40 mg de camptothécine dissous dans 4 ml d'acétate d'éthyle dans 4 ml de 0,3 % de Vitamin E-TPGS, puis durcies dans 90 ml de 0,3 % de Vitamin E-TPGS. La distribution de taille correspondante est présentée en (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Analyse de la taille des particules ; le diagramme en barres et les images MEB montrent l'effet du pourcentage de TPGS sur la taille des microsphères." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3. La taille des particules dépend de la concentration en émulsifiant. Une augmentation de la concentration en Vitamine E-TPGS a conduit à des nanoparticules plus petites. Les diamètres moyens et les images MEB correspondantes sont présentés pour les particules préparées en émulsifiant 100 mg de PLGA dissous dans 1 ml d'acétate d'éthyle dans (A) 0,01 %, (B) 0,05 %, (C) 0,1 % ou (D) 0,3 % de Vitamine E-TPGS, puis durcies dans 45 ml de 0,3 % de Vitamine E-TPGS. Les barres d'erreur représentent l'écart type de 200 mesures de diamètre effectuées à partir de 2 images d'un même lot. L'échelle représente 5 μm (A-C) et 200 nm (D).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.
<img alt="Micrographie MEB illustrant la morphologie des particules et leur agrégation. Analyse de la microstructure de la poudre." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4. Artéfacts de morphologie de surface observés en MEB. En (A), une forte fusion et des structures en forme de feuillet étaient présentes sur l'ensemble de l'échantillon. La concentration de Vitamine E-TPGS était trop élevée (1 %) pour permettre la formation de particules distinctes. En (B), certaines régions de l'échantillon étaient fondues, toutefois de grandes poches de nanoparticules distinctes existaient, notamment là où il y avait des espaces dans le dépôt par pulvérisation cathodique. Nous pensons que ces artéfacts de fusion sont dus à un chauffage pendant le processus de dépôt par pulvérisation. En (C), les particules apparaissaient initialement lisses, mais une exposition prolongée de l'échantillon au faisceau du MEB a entraîné l'apparition de fossettes et de plissements. (D) montre une image de faible résolution, capturée avec une exposition minimale de l'échantillon au faisceau du MEB ; les particules apparaissent lisses et de morphologie sphérique. En (E), le même échantillon est exposé pendant une période plus longue, et une déformation évidente de leur morphologie initiale est observée. En (F), une exposition prolongée au faisceau à une tension élevée (12 kV) a provoqué un chauffage et une fissuration des particules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir l'image en taille plus grande</a>.

Nous décrivons la production et la caractérisation de nanoparticules et de microparticules composées d’acide poly(lactique-co-glycolique) en utilisant la vitamine E-TPGS comme émulsifiant. En faisant varier les paramètres de formulation tels que la concentration d’émulsifiant, il est possible de produire des nanoparticules de diamètres moyens allant de 220 nm à 1,98 μm.

Nanoparticules PLGA formées par une ou deux émulsions avec de la vitamine E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

L'objectif général de cette procédure est de former des nanoparticules polymériques de taille ajustable. Cela est réalisé en dissolvant d'abord un polymère dans un solvant organique et en ajoutant un médicament ou un agent encapsulant fluorescent. La deuxième étape consiste à émulsionner le polymère avec une phase aqueuse contenant l'agent émulsifiant, puis à laisser les particules durcir dans un volume aqueux plus important tandis que le solvant s'évapore.Ensuite, les particules sont lavées, recueillies par centrifugation et lyophilisées pour un stockage à long terme. La dernière étape consiste à caractériser la taille des nanoparticules et la morphologie de leur surface par microscopie électronique à balayage ou imagerie SEM. En définitive, la MEV est utilisée pour démontrer que la taille des nanoparticules peut être contrôlée en faisant varier la concentration d'émulsifiant.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie d'une variété de maladies humaines, car les particules peuvent être personnalisées pour encapsuler et délivrer une large gamme d'agents thérapeutiques afin d'assurer une action prolongée. Dans le tissu cible. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle.Les étapes d'émulsification sont difficiles à maîtriser car des aspects subtils de la formation de l'émulsion peuvent avoir un impact significatif sur les propriétés des particules. Pour commencer la préparation des nanoparticules, placez environ 100 milligrammes d'acide polylactique-co-glycolique, également connu sous le nom de PLGA, dans un tube à essai de 13 sur 100 millimètres. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique en verre, transférez un millilitre d’acétate d’éthyle dans l’échantillon, couvrez l’extrémité du tube avec du papier d’aluminium, puis scellez hermétiquement le papier d’aluminium avec du film parafilm.Veillez à bien serrer le parafilm fermement le long du bord supérieur du flacon et du bord inférieur de la feuille d'aluminium afin d'éviter l'évaporation du solvant. Marquez le niveau du solvant sur le tube à essai et laissez le polymère se dissoudre toute la nuit. Le lendemain, ajoutez du solvant supplémentaire si une évaporation s'est produite.Préparez le matériel et les produits suivants dans une hotte aspirante située à proximité de l'ultrason. Vortexez deux petites pipettes Pasteur en verre équipées de embouts en caoutchouc et d'un agitateur magnétique. De plus, placez un grand bécher rempli d'eau glacée sur un support en dessous de l'ultrason.Ensuite, ajoutez 45 millilitres de T-P-G-S de vitamine E à 0,3 % poids par volume dans un flacon en verre de 200 millilitres, puis réglez la vitesse d'agitation à 360 tr/min. Ajoutez ensuite deux millilitres du T-P-G-S de vitamine E à 0,3 % poids par volume dans un tube à essai en verre de 13 sur 100 millimètres. Afin d'incorporer les agents hydrophobes, ajoutez l'agent d'encapsulation directement dans la solution polymérique, en prenant soin d'éviter les parois du tube à essai, puis vortexez le tube jusqu'à ce que l'agent d'encapsulation soit uniformément dispersé.Pour les agents hydrophiles, émulsifier l'agent encapsulant avec la solution polymère. Ajouter jusqu'à 50 microlitres de médicament en tampon à la surface de la solution polymère. Soniquer une dizaine de secondes sur glace ou jusqu'à obtention d'une solution opaque et homogène.Ensuite, agiter vigoureusement le tube à essai contenant le T-P-G-S de vitamine E à vitesse élevée tout en tenant le tube verticalement. Maintenir la pipette en verre à une distance d’un à deux centimètres au-dessus de l’ouverture du tube en vortex, et ajouter lentement la solution polymérique goutte à goutte à la surface du liquide en vortex. Veiller à ce que la pipette ne touche pas les parois du tube une fois que toute la solution polymérique a été ajoutée.Poursuivez le vortexage de la solution. Formez maintenant une émulsion pendant 15 secondes. Transférez immédiatement le polymère émulsifié vers l'ultrasonateur.Gardez le tube à essai immergé dans de l’eau glacée et soumettez l’émulsion à trois cycles de sonication de dix secondes chacun. Déplacez l’émulsion vers le haut et le bas de la sonde afin d’assurer une sonication uniforme, et évitez de toucher les parois ou le fond du tube à essai avec la sonde. Faites une pause de cinq à dix secondes entre chaque cycle de dix secondes pour permettre au milieu de refroidir avant de poursuivre.Ensuite, ajouter un à deux millilitres de T-P-G-S à 0,3 % de vitamine E provenant de la solution agitée à l'émulsion. Cela va fluidifier le polymère émulsifié, facilitant ainsi son versement ; verser l'émulsion dans la solution agitée. Rincer toute solution résiduelle présente dans le tube à essai en la transférant dans la solution agitée.Laisser durcir les nanoparticules en agitant pendant trois heures. Si l'agent d'encapsulation est sensible à la lumière, envelopper le bécher dans du papier d'aluminium et laisser l'ouverture découverte afin de faciliter l'évaporation du solvant pour recueillir les nanoparticules. Commencer par répartir les nanoparticules dans deux tubes à centrifuger Oak Ridge de volume nominal de 30 millilitres et les équilibrer à 0,1 gramme près l'un de l'autre. Puis centrifuger les nanoparticules dans un rotor à angle fixe pendant 15 minutes à 17 000 ×g.RC f. Des durées de centrifugation plus longues permettront la collecte d'une fraction plus élevée de nanoparticules plus petites. Jeter le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot de nanoparticules.Ajoutez cinq millilitres d'eau distillée et utilisez un bain-marie, un agitateur et un vortex pour suspendre complètement les nanoparticules. Réunissez le contenu des deux tubes à centrifuger dans un seul tube et ajoutez 20 millilitres d'eau distillée pour un volume total de 30 millilitres. Répétez ensuite les étapes de centrifugation et de lavage deux fois supplémentaires, pour un total de trois lavages.Le volume de liquide de la dernière suspension du culot doit être de quatre à cinq millilitres. Congelez une petite aliquote de nanoparticules dépourvues de télomères pour l'imagerie MEB, en laissant le reste. Ajoutez un rapport pondéral de un à deux de TLO par rapport au polymère comme protecteur cryogénique afin d'obtenir une suspension complète et uniforme des nanoparticules de PLGA.Cela empêchera la formation de cristaux de glace qui pourraient endommager la surface des particules et induire une agrégation. Transférez les nanoparticules dans un tube de centrifugation de cinq millilitres préalablement pesé, puis congélez à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Ensuite, retirez le bouchon du tube et recouvrez l'ouverture en fixant un morceau de papier absorbant de laboratoire sur le dessus à l’aide d’un élastique.Déplacer rapidement afin que le contenu ne fonde pas, si une fusion se produit. Recongeler avant de placer dans le lyophilisateur, puis lyophiliser l'échantillon de cinq millilitres pendant 72 heures. Ensuite, remettre le bouchon et envelopper le tube pour stocker les particules lyophilisées à moins 80 degrés Celsius.Le jour de l'imagerie, placez une bande de ruban adhésif en carbone double face sur une embase SEM. Étiquetez la partie métallique de l'embase à l'aide d'un marqueur indélébile pour référence ultérieure. Utilisez une spatule métallique pour prélever une petite quantité de nanoparticules lyophilisées et répartissez-les délicatement sur la surface du ruban.Brosser la surface du support avec un tissu de laboratoire ou utiliser de l'air comprimé pour éliminer les nanoparticules libres. Visualiser les particules en utilisant une distance de travail de cinq à 15 millimètres, une intensité de cinq à 12 kilovolts et une taille de spot de un à trois ; des intensités de faisceau plus élevées peuvent entraîner un chauffage localisé de l'échantillon, ce qui modifiera la morphologie de surface des particules. Les microparticules sont observées à un grossissement de 100 fois et les nanoparticules seront discernables à 3000 fois.Ajustez le grossissement pour focaliser sur le sommet d'une sphère afin de localiser les particules facilement visualisables au MEB, et collectez au moins trois images par lot afin d'obtenir un échantillon représentatif de la taille et de la morphologie des particules. À l’aide de cette méthode, des particules peuvent être créées par une émotion unique, apparaissant comme des sphères individuelles non fusionnées, ayant une morphologie de surface lisse et une large gamme de tailles réparties dans l’échantillon. Les microparticules présentées ici ont un diamètre moyen de 730 nanomètres.Des nanoparticules créées par une émulsion unique qui encapsulent le médicament hydrophobe campin sont montrées ici. Ces particules se sont avérées encore plus petites, avec un diamètre moyen de 340 nanomètres. Des concentrations plus élevées d'émulsifiant ont produit des particules plus petites, le diamètre moyen passant de 2000 à 200 nanomètres.Alors que la concentration de l'émulsifiant augmentait de 0,01 à 0,3 %, comme le montrent ici les images MEB. Toutefois, lorsque la concentration de vitamine E-T-P-G-S était trop élevée, des particules distinctes ne se formaient pas ; lorsque 1 % de vitamine E-T-P-G-S était utilisé, des fusions importantes et des structures en forme de feuillet étaient observées dans l'ensemble de la structure. Vrai. Une fois que vous aurez appris à fabriquer des nanoparticules de PLG par émulsification, d'autres méthodes telles que la modification de surface peuvent être réalisées afin de concevoir des nanoparticules capables d'interagir avec des types cellulaires spécifiques ou des régions particulières du corps.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment former des particules de taille reproductible et ajustable par émulsification.

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