Isolation et caractérisation de protéines humaines chimériques exprimant fc à l’aide d’adsorbeurs membranaires de protéine a et d’un flux de travail rationalisé

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de caractériser efficacement des protéines chimériques humaines exprimant la fraction FC à l'aide de protéine A, de supports membranaires adsorbants et d'un protocole simplifié. Cette approche consiste tout d'abord à clarifier le surnageant de culture cellulaire à l'aide d'un filtre de 0,22 micron. La deuxième étape consiste à monter le système d'écoulement et à commencer la perfusion du surnageant de culture cellulaire à travers le support membranaire adsorbant de protéine A.

Ensuite, la protéine exprimant le fragment FC humain est élutée du support membranaire, puis le EIT obtenu est concentré par ultrafiltration, suivie d'un échange de tampon par dialyse. Les étapes finales consistent à utiliser la cytométrie en flux et le western blotting pour déterminer la qualité et la quantité de la protéine concentrée. En définitive, les supports membranaires de protéine A, associés à un protocole simplifié, montrent une réduction du temps de traitement et une augmentation potentielle du rendement protéique par rapport à la chromatographie d'affinité classique utilisant des colonnes pré-remplies de protéine A aro speed.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la chromatographie d'affinité sur colonne, réside dans le fait que l'absorbeur membranaire permet potentiellement des rendements plus élevés de la protéine avec un temps de traitement réduit. Le choix de méthodes appropriées de caractérisation peut également réduire le temps de traitement. Préparez l'absorbeur membranaire conformément aux instructions du fabricant, en veillant à ce que toutes les solutions perfusées soient à température ambiante et préfiltrées à travers un filtre de 0,22 micron. Pour commencer, remplissez une seringue de 10 millilitres avec du tampon phosphate de KO ou du DPBS filtré sur 0,22 micron et éliminez toutes les bulles d'air.

Veiller à ce qu'aucun air n'entre dans l'absorbeur à membrane ; perfuser du DPBS pour éliminer la solution de stockage et équilibrer l'absorbeur à membrane immédiatement avant utilisation. Filtrer immédiatement le surnageant de culture cellulaire avant de le faire passer à travers l'absorbeur à membrane à l'aide d'un système de filtration stérile sous vide de 0,22 micron afin de charger l'absorbeur à membrane de protéine A, aspirer le surnageant de culture cellulaire dans une seringue munie d'un embout Luer lock et chasser toutes les bulles d'air pour assembler les matériaux et équipements. Relier d'abord la seringue à l'entrée de l'absorbeur à membrane.

Fixez un tube flexible à la sortie de l'absorbeur à membrane si désiré. Placez un filtre à seringue de 0,22 micron entre la seringue et l'absorbeur à membrane. Utilisez un flacon ou une bouteille pour recueillir le liquide sortant de l'absorbeur.

Régler la pompe à seringue au débit volumétrique souhaité, sans toutefois dépasser le débit recommandé par le fabricant. Faire passer le surnageant de culture cellulaire à travers l'absorbant membranaire en recueillant l'effluent. Recharger la seringue avec du surnageant selon les besoins.

Si désiré, tester le flux sortant pour la présence de protéine à l'aide de la cytométrie en flux, du western blot ou du ELISA selon les préférences du laboratoire ; il est généralement inutile de refaire passer le flux sortant pour éluer la protéine du support membranaire. Laver d'abord le support membranaire avec 10 millilitres de DPBS afin d'éliminer toute protéine non liée. Éluer la protéine du support membranaire au débit souhaité.

Utiliser 10 à 15 millilitres de tampon d'élution. Recueillir l'EIT dans un tube contenant un tampon neutralisant à 10 % du volume d'élution. Après élution de la protéine, régénérer l'absorbeur membranaire conformément aux instructions du fabricant.

Remplir l'absorbeur de membrane avec 20 % d'éthanol dans du DPBS pour un stockage prolongé à quatre degrés Celsius. Déposer tous les EIT dans une unité de filtration centrifuge avec un seuil de poids moléculaire de 10 kilodaltons.

Suivez les instructions du fabricant pour la centrifugation et la dialyse. Le rétentat. Dans une unité de dialyse de petit volume avec une coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons, contre le tampon choisi, il peut être nécessaire d'ajouter du tampon au matériau dialysé.

Si la précipitation des protéines est un problème, résolvez la protéine purifiée et les étalons FC sur le gel choisi par électrophorèse SDS-PAGE en conditions réduisantes ou non réduisantes, selon les besoins. Utilisez un mini-gel plutôt qu’un grand gel afin de réduire le temps de migration ; chargez plusieurs quantités d’échantillons de la protéine purifiée, y compris des échantillons dilués avec du DPBS, afin de s’assurer que les signaux des bandes de protéine purifiée se situent dans la plage linéaire du signal des étalons FC. Lors de l’analyse d’image après séparation sur gel, transférez les protéines du gel vers une membrane en fluorure de polyoléfine dans un système tampon discontinu à l’aide d’un transfert semi-sec, en suivant les instructions du fabricant ; le temps de transfert est généralement de cinq à dix minutes.

Colorer le gel après le transfert afin de vérifier l'efficacité du transfert. Réaliser le immunoblotting avec une anti-FC ou une anti-IgG conjuguée à la phosphatase alcaline ou à la peroxydase de raifort en utilisant une détection protéique assistée par vide. Le temps d'immunoblotting est généralement inférieur à une heure.

Développer le blot immunitaire en utilisant le substrat et la méthode de votre choix. Quantifier la protéine purifiée par analyse d'image. Effectuer une régression linéaire sur les signaux des bandes provenant des étalons de FC.

Si le R carré est supérieur à 0,90, utilisez l'équation de la droite pour calculer la quantité de protéine à partir du signal de la bande, en tenant compte du facteur de dilution de l'échantillon si nécessaire. Étant donné que la quantification de la protéine est effectuée en se basant sur fc, ajustez la valeur en fonction des différences de masse moléculaire entre la protéine et fc. Si le R carré est inférieur à 0,90, répétez la procédure de transfert Western accélérée.

Enfin, valider la protéine à l'aide de tests fonctionnels ou de méthodes permettant de détecter le FC par cytométrie en flux. Un immunobuvardage ou une cytométrie en flux EISA a été utilisée pour rechercher la présence de GAL un HFC fonctionnel dans le surnageant de la culture cellulaire initiale, comme indiqué par l'histogramme bleu. Le milieu frais de culture cellulaire, représenté ici en rouge, a servi de contrôle négatif. Cet histogramme est recouvert en vert par le flux traversant, ce qui indique que l'absorbeur membranaire a efficacement capturé et retenu GAL un HFC. GAL un HFC a été élué de l'absorbeur membranaire par incréments d'un millilitre à raison d'un millilitre par minute, à l'aide d'un tampon acide à base d'amine, et les fractions éluées neutralisées ont ensuite été testées pour la présence de GG un HFC fonctionnel par cytométrie en flux. Le signal de GL un HFC a augmenté progressivement à partir de l'éluat un, approximativement équivalent au contrôle négatif, jusqu'à un maximum à EEU trois, puis a diminué pour atteindre un niveau presque constant aux éluats neuf et dix.

Le dernier EEU 10 n'a pas atteint l'équivalence du signal du témoin négatif en raison d'une certaine rétention par l'adsorbeur de GL un HFC. La quantification et la caractérisation du GL un HFC purifié ont été réalisées par une procédure de western blot accélérée par transfert semi-sec et immunotransfert assisté par vide. En comparant le signal de GA un HFC aux étalons de quantification de HFC, la quantité et la qualité du matériau purifié ont été déterminées.

Les signaux de GAL un HFC et de GAL un HFC dégradé se situaient dans la plage des étalons. Les intensités des signaux des bandes étalons d'HFC présentaient une relation linéaire avec la quantité d'HFC présente. La concentration de GAL un HFC purifié, exprimée en fonction de l'HFC, a été déterminée à 450 microgrammes par millilitre par traitement d'image.

Ajuster en fonction du poids moléculaire de G une HFC. La concentration du matériau purifié était de 720 microgrammes par millilitre. En revanche, trop de GAL purifié une HFC a été déposé dans les bandes six et sept du western blot montré ici, ce qui a produit des signaux saturés ou dépassant la plage des étalons HFC, empêchant ainsi la quantification.

La coloration de gel Kumasi constitue une alternative au western blot et peut servir de contrôle de qualité rapide ou de méthode de quantification. Notez la présence d'une bande d'environ 10 kilodaltons en plus des bandes d'environ 25 kilodaltons et 40 kilodaltons dans l'échantillon de GAL un HFC dégradé. Cette bande correspond au GAL un HFC dégradé qui n'a pas réagi avec l'anticorps de détection utilisé dans les western blots.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des protéines chimériques exprimant le fragment FC humain à l’aide d’absorbants membranaires, et comment caractériser ces protéines en aussi peu que quatre heures.