Name: Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Découvrez les méthodes d'étude de la migration cellulaire in vitro, incluant les tests de fermeture de plaie et de migration transwell. Ces techniques accessibles facilitent la recherche en biologie cellulaire et cancérologie.

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Les auteurs remercient Mike Myles, Sam Saunders et C.W. Elton de l’ECU Multimedia & Technology Services pour leur aide dans la production vidéo. Nous reconnaissons le soutien financier du North Carolina Biotechnology Center, de Golfers against Cancer, du Brody Brothers Endowment Fund, de l’American Heart Association et de l’ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. et M.J.R.).

1. Culture cellulaire fermeture de la plaie Assay <ol><li> Détacher les cellules de la plaque de culture de tissu en utilisant 0,25% de solution de trypsine-EDTA. cellules à granules dans un tube conique de 15 ml par centrifugation, aspirer le surnageant et les cellules dans un milieu de culture re-suspension. Plate le nombre approprié de cellules dans une plaque à 6 puits à 100% de confluence dans les 24 heures. Remarque: Les essais peuvent être nécessaires pour déterminer le moment et le nombre de cellules d&#39;atteindre 100% de confluence en raison du type de cellule et de la taille de l&#39;être bien utilisée (par exemple, 1 x 10 6 cellules B16F10 de mélanomes sont ensemencées dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits 24 heures avant la génération de la plaie). En variante, des plaques à 12 puits ou à 24 puits peuvent être utilisées. Remarque: Si possible, les cellules peuvent être ensemencées dans une culture-insertion (à partir LLC ibidi) sur un tissu plaque de culture traité faisant la plaie pré-coulé. Une culture-Insert peut protéger la surface de la plaque de culture de tissu des dommages causés par l&#39;embout de pipette. Si une culture-Insérer permet pas omettre le1.2. </li><li> Dans un environnement stérile (généralement une hotte de sécurité biologique), utilisez une pointe de pipette 200 ul d&#39;appuyer fermement contre le haut de la plaque de culture de tissus et de faire rapidement une plaie verticale à travers la monocouche cellulaire. Un embout de pipette de taille différente peut être utilisée pour rendre la taille de la plaie que l&#39;on souhaite. Ne pas utiliser une force excessive contre la plaque de culture de tissu avec la pointe de la pipette, cela pourrait endommager la surface. Si la plaie est pré-coulé, cette étape peut être omise. </li><li> Aspirer délicatement les médias et les débris cellulaires. Lentement, ajouter suffisamment de milieux de culture contre la paroi du puits pour couvrir le fond du puits et éviter détacher des cellules supplémentaires. Suite à la génération et à l&#39;inspection de la plaie une image initiale doit être prise. Placer la plaque de culture tissulaire dans un incubateur réglé à la température appropriée et la concentration de CO 2 (typiquement 37 ° C et 5% CO 2). </li><li> À plusieurs moments, par exemple toutes les 3 heures, retirer la plaque du incubatou et le placer sous un microscope inversé pour prendre une photo de l&#39;instantané et de vérifier la fermeture de la plaie. Si la microscopie time-lapse est disponible, prendre une photo tous les X minutes (généralement à partir de toutes les 5 minutes) pour une durée de temps dans une température et CO 2 chambre contrôlée. Selon le type cellulaire, le temps de fermeture de plaie peut varier. </li><li> Pour analyser les résultats de l&#39;instantané des photos, mesurer la distance d&#39;un côté de la plaie à l&#39;autre en utilisant une barre d&#39;échelle. Analyser et bien présents fermeture de la plaie au cours du temps en utilisant un nuage de points ou graphique à barres, par exemple, la figure 1. </li><li> Pour analyser les photos time-lapse, importer les photos dans le logiciel ImageJ (disponible gratuitement à http://rsb.info.nih.gov/ij/) à faire une vidéo. Pour ce faire, ImageJ ouvert, cliquez sur Fichier, Importer, et une séquence d&#39;images. Trouver le fichier avec des images; cliquez sur la première photo dans le fichier. Enregistrement de vidéos en sélectionnant Fichier, Enregistrer sous, et AVI. Cellules migrantes simples peuvent être observés à characterize mouvement directionnel. En outre, les caractéristiques morphologiques telles que la formation de lamellipodes et bord de fuite de rétraction peuvent être étudiées ainsi (Figure 2 et vidéo supplémentaire). </li></ol> 2. Transwell migration cellulaire et l&#39;invasion de dosage <ol><li> Dans un environnement stérile (typiquement une hotte de biosécurité) détacher les cellules de la plaque de culture de tissu en utilisant un tampon non-enzymatique de dissociation de cellules ou de 0,25% de solution de trypsine-EDTA, un culot de cellules par centrifugation, et aspirer le support existant en laissant le culot cellulaire. Re-suspendre les cellules dans des milieux de culture cellulaire sans sérum contenant 0,1% de BSA (albumine de sérum bovin). Remarque: En fonction de la lignée cellulaire étant étudiée 0,25% de trypsine-EDTA peut influer sur la migration et l&#39;invasion cellulaire en raison de la coupure de différents récepteurs sur la surface de la cellule 17. Note: Le nombre de cellules par ml dépend de la taille des cellules. D&#39;autres tests peuvent être nécessaires pour trouver une densité de semis que proVides les meilleurs résultats. Typiquement 1 x 10 6 cellules / ml est un bon point de départ pour la plupart des types de cellules en utilisant la 24 puits TRANSWELL insérer. Il existe une gamme de transwell tailles de plaquettes et le nombre de cellules ajoutées doit être ajustée en conséquence. </li><li> Plaque 100 pl de solution de cellules sur le dessus de la membrane filtrante dans un insert Transwell et incuber pendant 10 minutes à 37 ° C et 5% de CO2 pour permettre aux cellules de se déposer vers le bas. Remarque: La taille des pores particulière de la membrane Transwell utilisée dépend de la taille individuelle des cellules dans l&#39;échantillon. Par exemple, si les cellules sont trop petites, elles peuvent passer à travers les pores sans la nécessité de faciliter la migration ou s&#39;ils sont trop gros, ils peuvent ne rentre pas par les pores. Il existe plusieurs inserts Transwell avec des tailles de pores allant de 3 um, 5 pm et 8 pm pour des essais de migration cellulaire. Les inserts Transwell sont disponibles commercialement auprès des sociétés telles que Corning. Remarque: Le transwell mdosage de igrations peut être facilement modifié pour réaliser le dosage de l&#39;invasion cellulaire. Pour ce faire, ajoutez la matrice extracellulaire (ECM) des matériaux sur le dessus de la membrane transwell puis ajouter les cellules au-dessus de l&#39;ECM. Par exemple, le Matrigel est décongelé sur de la glace et liquéfié, puis de 30 à 50 ul de Matrigel est ajouté à un 24 puits transwell insérer et solidifié dans un incubateur à 37 ° C pendant 15 à 30 minutes pour former une couche mince de gel. Cell solution est ajoutée sur le dessus de la couche de Matrigel pour simuler invasion à travers la matrice extracellulaire. Remarque: Il ya des différences entre la migration des cellules transwell et les essais d&#39;invasion de cellules transwell. La détermination de la migration cellulaire Transwell mesure la capacité chimiotactique des cellules vers un chimio-attractant. Le dosage de l&#39;invasion de cellules Transwell, cependant, mesure à la fois la chimiotaxie de cellules et l&#39;invasion des cellules à travers la matrice extracellulaire, un processus qui se trouve couramment dans les métastases du cancer ou du développement embryonnaire. </li><li> Avec une pipette, très atmosully ajouter 600 ul de la chimio-attractant souhaitée dans le fond de la chambre inférieure dans une plaque à 24 puits. Ajouter la chimio-attractif sans déplacer l&#39;insert transwell et éviter de générer des bulles. Assurez-vous que le liquide de chimio-attractant dans le fond du puits est en contact avec la membrane dans le puits supérieur afin de former un gradient chimiotactique. Le temps d&#39;incubation dépend du type de cellule et la chimio-attractant est utilisé. Note: D&#39;autres essais peuvent être nécessaires pour déterminer la période d&#39;incubation. Remarque: Pour les cellules adhérentes, les cellules ayant migré se fixer sur l&#39;autre côté de la membrane 1,8. La quantification des cellules ayant migré peut être effectuée en suivant les étapes 2.4 à 2.8 (2.4 à 2.8 étapes n&#39;ont pas besoin d&#39;être exécuté dans un environnement stérile). Pour les cellules non-adhérentes, les cellules ayant migré vont baisser dans les médias à la chambre basse. Le nombre de cellules ayant migré peut être compté en utilisant un hémocytomètre ou cytomètre en flux 5. </li><li> Retirez le cache du transwell de la plaque. Utilisez un coton-tige autant de fois que nécessaire pour retirer soigneusement les médias et les cellules restantes qui n&#39;ont pas migré à partir du haut de la membrane sans l&#39;endommager. </li><li> Ajouter 600-1,000 ul d&#39;éthanol à 70% dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits. Placer l&#39;insert Transwell dans l&#39;éthanol à 70% pendant 10 minutes pour permettre la fixation des cellules. Retirer transwell insert de la plaque de 24 puits et utiliser un coton-tige pour enlever le reste d&#39;éthanol à partir du haut de la membrane. Laisser la membrane transwell sécher (en général 10-15 minutes). </li><li> Ajouter 600-1,000 ul de 0,2% de cristal violet dans un puits d&#39;une plaque à 24 puits et la position de la membrane en elle pour la coloration. Incuber à température ambiante pendant 5 à 10 minutes. </li><li> Retirez délicatement le cristal violet du haut de la membrane avec une pointe de pipette ou coton applicateur incliné. Très soigneusement, pour éviter de rincer les cellules fixes, tremper la membrane dans de l&#39;eau distillée autant de fois que nécessaire pour éliminer les cristaux viole excèst. Laisser la membrane transwell sécher. </li><li> Vue sous un microscope inversé et compter le nombre de cellules dans les différents champs de vision pour obtenir une somme moyenne de cellules qui ont migré à travers la membrane vers le chimio-attractant et fixés sur la face inférieure de la membrane (Figure 3). </li></ol>

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<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li>
<li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li>
<li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La migration cellulaire est un aspect important d&#39;étudier en recherche sur le cancer et il peut également être appliquée à des études de guérison de développement, immunologiques et la plaie. La culture cellulaire enroulé essai de fermeture et la migration des cellules transwell et invasion tests révèlent des informations détaillées sur les comportements migratoires des cellules et peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires de la migration des cellules 1,2,10,14. Notre étude a utilisé ces...

La motilité est une caractéristique essentielle de cellules vivantes. La migration cellulaire est impliquée dans la conception de la vie, le développement embryonnaire, la réponse immunitaire, et de nombreux processus pathologiques, tels que les métastases du cancer et l&#39;inflammation 9.1. Par conséquent, les méthodes pour étudier le comportement migratoire cellule sont des outils de recherche très utiles pour un large éventail de disciplines en sciences biomédicales, biologie, bio-ingénierie, et des domaines connexes. L&#39;étude de la migration cellulaire dans la recherche sur le cancer est d&#39;un intérêt particulier comme la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer est lié à la progression métastatique. Pour le cancer de se propager et diffuser dans tout le corps, les cellules cancéreuses doivent migrer et envahir par la matrice extracellulaire (ECM), intravasate dans la circulation sanguine, attacher à un site distant, et enfin s&#39;extravaser pour former foyers distants 1,10-12. Diverses méthodes biologiques peuvent être utilisés pour étudier ces événements en détail. La culture cellulaire enroulé une fermetured la migration transwell et d&#39;invasion des essais sont largement utilisés dans la communauté scientifique 1,10. Ces tests peuvent fournir les données nécessaires pouvant permettre une compréhension de la façon dont un type cellulaire particulier peut spontanément migrer ou répondre à une chimio-attractif et directionnelle migrer vers elle. Plusieurs phénotypes migratoires ont été décrits. Les cellules peuvent migrer dans une forme de cellule unique tel que vu dans mésenchymateuses ou mouvement amiboïde comme ou par le mouvement multicellulaire marqué la migration ou de la cellule collective streaming 13. Procédé de mouvement utilisée dans les cellules mobiles peut être facilement observée à l&#39;aide de la culture cellulaire essai de fermeture de plaie. Parmi les nombreuses façons d&#39;étudier la migration cellulaire, l&#39;essai de fermeture de plaie de la cellule est l&#39;un des plus simples. Cette méthode est utile pour déterminer la capacité de migration des masses de cellules entières. Lorsque franchi une nouvelle étape, il peut être utilisé pour observer les caractéristiques morphologiques de cellules individuelles pendant la migration 14. Suite à l&#39;analyse de la fermeture de la plaie de nombreux phénotypes peuvent être révélés. Mesure de la distance fermé au fil du temps lorsque l&#39;on compare à un contrôle peut révéler des changements de migration spécifiques ou un phénotype migratoire avec facultés affaiblies qui était inconnu auparavant. En outre, seule la formation de lamellipode cellulaire, la queue rentrée, et le mouvement directionnel peuvent donner des indices pour ce qui peut être altérée ou renforcée dans les cellules d&#39;intérêt 14. La migration des dosages transwell et d&#39;invasion peuvent être utilisées pour analyser la capacité des cellules à répondre de manière directionnelle simples à divers chimio-attractants si elles sont des chimiokines, des facteurs de croissance, des lipides, ou des nucléotides 4,5,8,15,16. On peut également évaluer la capacité migratoire différentielle due à la surexpression d&#39;un récepteur de 1,14. Ces dosages peuvent également être utilisées pour identifier et caractériser les régulateurs clés de la migration cellulaire, tels que la famille Rho des petites GTPases 2. Suite à ces court et facilement accessibles essais, le mode de la migration cellulaire et la capacité d&#39;une cellule à envahir en une matrice 3-D peuvent également être déterminées.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s milieu Eagle modifié (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA 0,25 %</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Violet cristallin</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td><td>Dissous dans l’eau à 0,2 %</td></tr><tr><td>Tampon de dissociation cellulaire</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>Capot de biosécurité SterilGARD</td><td>The Baker Company, Inc.&nbsp ;</td><td></td><td>Modèle # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl microscope inversé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Modèle # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Le numéro de catalogue varie en fonction du type de plaque de culture</td></tr><tr><td>Corning Transwell insert</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Le numéro de catalogue varie en fonction de la taille des pores de la membrane</td></tr></tbody></table>

dans la migration cellulaire in vitro et invasion dosages

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

La migration est une propriété clé des cellules vivantes et essentielle au développement normal, à la réponse immunitaire et aux processus pathologiques tels que les métastases cancéreuses et l’inflammation. Les méthodes d’examen de la migration cellulaire sont très utiles et importantes pour un large éventail de recherches biomédicales telles que la biologie du cancer, l’immunologie, la biologie vasculaire, la biologie cellulaire et la biologie du développement. Ici, nous utilisons la migration et l’invasion des cellules tumorales comme exemple et décrivons deux tests connexes pour illustrer les méthodes couramment utilisées et facilement accessibles pour mesurer ces processus. La première méthode est le test de fermeture de la plaie par culture cellulaire dans lequel une égratignure est générée sur une monocouche cellulaire confluente. La vitesse de fermeture de la plaie et de migration cellulaire peut être quantifiée en prenant des photos instantanées avec un microscope inversé régulier à plusieurs intervalles de temps. Le comportement migratoire cellulaire plus détaillé peut être documenté à l’aide du système de microscopie time-lapse. La deuxième méthode décrite dans cet article est le test de migration et d’invasion cellulaire transwell qui mesure la capacité de motilité cellulaire et d’invasivité envers un gradient chimio-attractif. Notre objectif est de décrire ces méthodes d’une manière très accessible afin que les procédures puissent être réalisées avec succès dans les laboratoires de recherche, même avec une configuration de base en biologie cellulaire.

L&#39;essai de fermeture de plaie et la détermination de la migration cellulaire Transwell présentées ici ont été effectuées en utilisant des cellules de souris B16F10 de mélanome comme un système modèle. Dans l&#39;essai de fermeture de plaie, B16F10 cellules ont été ensemencées dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits et cultivées jusqu&#39;à 100% de confluence dans les 24 heures. Une plaie d&#39;environ 700 um de large a été générée à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette et la fermeture de la plaie (migratio...

Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l&#39;invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l&#39;invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

La migration cellulaire est un processus hautement dynamique. Elle est importante pour plusieurs fonctions physiologiques telles que le développement embryonnaire normal, la réponse immunitaire, ainsi que pour les processus pathologiques. Par exemple, la métastase cancéreuse et l'inflammation.L'étude de la migration cellulaire est importante pour un large éventail de sciences biomédicales telles que la biologie du cancer, l'immunologie, la biologie cellulaire et la biologie du développement. La migration cellulaire peut être divisée en quatre étapes mécaniquement distinctes : l'extension, la formation de nouvelles adhésions, la contraction du corps cellulaire et, enfin, le détachement de la queue. Nous décrirons ici deux méthodes simples permettant d'étudier attentivement la nature dynamique de la migration cellulaire in vitro.La première méthode est un test de culture cellulaire par enceinte. Ce test est couramment utilisé et très accessible aux laboratoires disposant des équipements les plus basiques. Le test de culture cellulaire par enceinte est une méthode où, à l’aide d’un embout de pipette, des rayures sont réalisées sur une monocouche confluente de cellules, et la monocouche cellulaire confluente referme progressivement la blessure précédemment créée.La dynamique de la migration cellulaire peut être étudiée en détail à l'aide de la microscopie à intervalles de temps ou de clichés instantanés. La distance parcourue peut être mesurée et, au fil du temps, la vitesse à laquelle les cellules se déplacent peut être calculée. La deuxième méthode associée, le test de migration et d' invasion cellulaire en transwell, est également très accessible pour suivre l'ensemencement des cellules sur une membrane transwell.Aussi couramment appelée chambre de Boyden. On peut mesurer leurs capacités de migration vers un gradient de chémotactisme. Ces deux procédures expérimentales très accessibles sont extrêmement précieuses dans de nombreux domaines de recherche.Chapitre deux, enceinte de culture cellulaire, test. Bonjour, je m'appelle Calvin Justice. Je suis étudiant diplômé dans le laboratoire du Dr Yang, du Département d'oncologie à la Brody School of Medicine de l'East Carolina University.Aujourd'hui, je vais démontrer deux procédures permettant de mesurer les capacités de migration et d'invasion des cellules in vitro. Commençons maintenant par l'enceinte de culture cellulaire. Essai des cellules utilisées dans l'enceinte de culture cellulaire.Le test peut être réalisé dans des plaques de culture tissulaire en utilisant des techniques conventionnelles de culture cellulaire. Pour commencer, aspirez le milieu de croissance utilisé pour cultiver les cellules, rincez une fois avec du PBS, puis ajoutez deux millilitres de trypsine 0,25 % EDTA dans la plaque et placez-la dans l'incubateur pendant trois minutes. Retirez la plaque de l'incubateur et ajoutez trois millilitres de DMEM supplémenté avec 10 % de FCS.Retirer le milieu de la plaque et le placer dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger pendant cinq minutes à 1500 tr/min. Après la centrifugation, remettre en suspension les cellules dans deux millilitres de DMM supplémenté avec 10 % FCS.Ensuite, comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Une fois le comptage terminé, ensemencez un nombre de cellules qui deviendra confluant dans les 24 heures. Placez la plaque dans l'incubateur pendant 24 heures pour permettre l'attachement et l'expansion des cellules.Retirez la plaque de l’incubateur et observez-la au microscope afin de vous assurer qu’elle est confluente à 100 %. Ensuite, dans la hotte de sécurité biologique, à l’aide d’une pipette, créez soigneusement une estrie à l’aide du bout de pipette, de la partie supérieure du puits jusqu’au bas, sans endommager la plaque de culture cellulaire. Après avoir réalisé l’estrie avec le bout de pipette, aspirez le milieu et rincez délicatement avec deux millilitres de milieu de croissance.Dans ce cas, utiliser du DMEM supplémenté avec 10 % de FCS pour éliminer tous les débris éventuels, puis aspirer à nouveau le milieu. Enfin, ajouter deux millilitres de milieu de croissance et, si possible, placer la préparation dans une chambre contrôlée en température et en CO₂ située sous le microscope. Une fonction d'acquisition d'images en accéléré est disponible dans ce cas.La fonction de prise de vue en accéléré n'est pas disponible. Prenez une image initiale de l'emplacement de la marque et de la cavité, puis placez la plaque dans l'incubateur. Si la photographie en accéléré est disponible, configurez les fonctionnalités de prise de vue en accéléré sur le microscope.Nous allons régler notre lapse de temps sur 16 heures. Une image étant prise toutes les cinq minutes, après 16 heures, la plaque peut être retirée de la chambre et les images acquises pendant la durée de l'expérience peuvent être enregistrées sur une clé USB. Insérez la clé USB dans l'ordinateur et ouvrez le programme Image J.Cliquez sur le fichier. Importez une séquence d'images. Recherchez les images qui ont été prises pendant l'expérience.Cliquez sur le premier fichier, puis cliquez sur ouvrir. Les options de séquence suivantes apparaîtront. Sélectionnez la première image dans votre liste de photos et insérez les incréments dont vous aurez besoin pour la vidéo.Vous allez maintenant voir les options du lecteur de vidéos. Choisissez celle qui convient le mieux, faites des essais, puis cliquez sur OK. Le programme Image J va maintenant créer une vidéo ; enregistrez-la en cliquant sur Fichier, puis sur Enregistrer sous, au format AVI ou tout autre format adapté à votre expérience.La vidéo peut ensuite être analysée dans l'étude cellulaire pour des caractéristiques de migration susceptibles d'être intéressantes. Les caractéristiques pouvant être étudiées incluent l'extension podale, la contraction du corps cellulaire et le détachement de la queue. En l'absence de photographie en temps perdu, la plaque qui avait été placée dans l'incubateur pendant 12 à 16 heures après la prise de la première image peut être retirée.La zone initialement photographiée doit être de nouveau photographiée et une barre d'échelle doit être ajoutée pour permettre des mesures supplémentaires. Après avoir mesuré la largeur initiale de la plaie visible sur la première photo, la largeur mesurée en pixels doit être convertie en micromètres à l'aide de la barre d'échelle. Ensuite, la largeur de la plaie sur les images finales doit être mesurée en pixels dans la même zone qu'auparavant, puis à nouveau convertie en micromètres à l'aide de la barre d'échelle.La dernière étape consiste à soustraire la largeur finale de la largeur initiale afin d'obtenir la largeur totale refermée par la plaie durant la période de temps impartie. La distance de migration finale mesurée doit être divisée par le temps imparti pour obtenir la vitesse de recouvrement en micromètres par heure. La méthode de capture d'image peut être répétée dans de nombreux puits de tailles variables afin d'effectuer une analyse plus quantitative de la migration cellulaire, chapitre trois, dosage de migration cellulaire trans-puits et innovation.Pour commencer, vous devez d'abord cultiver les cellules d'intérêt dans une plaque de culture tissulaire pour la procédure. Ensuite, lavez une fois avec du PBS et détachez les cellules d'intérêt de la plaque de culture tissulaire à l'aide d'un tampon de dissociation cellulaire ou de la trypsine. Nous vous suggérons également de consulter la littérature sur l'impact potentiel de la trypsine sur les cellules que vous étudiez, car son utilisation pourrait influencer vos résultats.Après une centrifugation de détachement à 1500 tr/min pendant cinq minutes, retirez et aspirez le milieu existant, puis resuspendez les cellules dans du BSA 0,1 %. Ouvrez l'emballage de l'insert Transwell et placez-le dans le puits conçu pour sa taille spécifique. Si vous effectuez d'abord le test d'invasion Transwell, ajoutez du matrigel sur la partie supérieure de l'insert et incubez pendant 30 minutes avant de passer à l'étape suivante.Plaquez 100 microlitres de solution cellulaire sur la membrane du transwell. Incubez pendant 10 minutes pour permettre aux cellules de se déposer. Le nombre de cellules ensemencées dépend du type cellulaire et des expériences ultérieures qui pourraient être nécessaires.Pour déterminer ce nombre, utilisez une pipette pour ajouter délicatement le chémoattractant souhaité sous l'insert jusqu'au fond du puits. Évitez de retirer l'insert. Le temps d'incubation dépend du type cellulaire.Retirer l'insert transwell après l'incubation et utiliser un applicateur à embout coton aussi souvent que nécessaire pour retirer délicatement l'excès de milieu et les cellules qui ne se sont pas déplacées vers la membrane, depuis le dessus de celle-ci. Faire attention de ne pas endommager la membrane. Ajouter de 600 à 1000 microlitres d'éthanol à 70 % dans la chambre inférieure d'un vide.Placez soigneusement l'insert dans le puits contenant de l'éthanol à 70 % et incubez pendant 10 minutes afin de permettre la fixation cellulaire. Utilisez à nouveau un applicateur en coton autant de fois que nécessaire pour éliminer l'éthanol résiduel dans les cellules qui ne se sont pas déplacées à travers la membrane depuis le dessus de celle-ci. Ajoutez de 600 à 1000 microlitres de solution de cristal violet à 0,2 % dans un puits, puis placez l'insert dans ce puits pour la coloration cellulaire.Incuber pendant 10 minutes. Retirer généralement l'excès de colorant violet de cristeal présent à la surface de la membrane. Ensuite, et très prudemment afin d'éviter d'éliminer les cellules migrées, plonger la membrane dans de l'eau distillée autant de fois que nécessaire pour éliminer le violet de cristeal résiduel.Laisser sécher la membrane pour observer les cellules au microscope. La membrane peut être soigneusement retirée à l’aide du scalpel et placée sur une lame de couverture en verre, ou vous pouvez observer les cellules avec les inserts encore en place dans la cupule. À l’aide d’un microscope inversé, il convient de prendre une image de plusieurs champs de vision.Pour obtenir une bonne représentation du nombre de cellules migrées, le nombre de cellules peut être décompté à l'aide de l'outil de comptage d'Adobe Photoshop. Les données accumulées peuvent être insérées dans un graphique en barres afin de représenter au mieux vos résultats. Chapitre quatre, résultats représentatifs.Ensuite, nous vous présenterons quelques résultats représentatifs issus du test de culture cellulaire en enceinte et du test de migration cellulaire en transwell. Deux méthodes apparentées permettant d'examiner la motilité cellulaire, telles que décrites dans cette vidéo. Nous commencerons par le test de culture cellulaire en enceinte. Ici, nous affichons des images prises aux temps 0, 4, 8 et 12 heures.Comme vous pouvez le constater, après la création de la plaie, des images peuvent être prises et, au fil du temps, la distance de fermeture de la plaie peut être mesurée. Nous présentons nos données à l’aide d’un nuage de points et, en utilisant la méthode précédemment décrite, nous déterminons la vitesse de fermeture de la plaie en fonction du temps. En outre, la migration individuelle des cellules peut également être étudiée en détail à l’aide de la microscopie en time-lapse.Dans ce cas, nous effectuons un zoom sur des cellules individuelles durant la fermeture de la plaie, suivons leur migration au fil du temps et observons leurs caractéristiques de déplacement, telles que l'extension du bord antérieur, la rétraction de la queue et le mouvement général, qui peuvent être examinées en détail. Vous allez maintenant passer en revue certains résultats du test de migration cellulaire transversale. Ici, nous présentons deux images prises de la membrane à la suite du test de migration cellulaire en transwell.La première image montre les résultats obtenus sans chémotactisme, où il y avait peu ou pas de migration cellulaire à travers la membrane. La deuxième image montre les résultats obtenus avec chémotactisme, où une migration cellulaire accrue vers la membrane a été observée. À droite, nous présentons les résultats quantitatifs de notre expérience à l’aide d’un graphique en barres avec des barres d’erreur représentant l’erreur type.Chapitre cinq, conclusion : les données accumulées suite au test d'encapsulation cellulaire ou au test de migration ou d'invasion cellulaire transversale révèlent les capacités migratoires des cellules dans un environnement 2D ou 3D. Ces résultats peuvent être comparés à d'autres résultats afin de révéler potentiellement des données auparavant inconnues, et peuvent également être corrélés avec d'autres tests biochimiques. Ces deux tests couramment utilisés et étroitement liés sont précieux et facilement accessibles dans les installations de biologie cellulaire les plus basiques.Nous vous remercions de nous avoir rejoints aujourd'hui et vous souhaitons bonne chance dans vos futures entreprises scientifiques.

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