Aplysie Préparation des ganglions pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones simples

L’escargot marin Aplysia californica a été largement utilisé comme modèle de neurobiologie pour les études sur la base cellulaire et moléculaire du comportement. Ici, une méthodologie est décrite pour explorer le système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones uniques de circuits neuronaux identifiés.

L’objectif général de cette procédure est d’étudier l’expression des gènes et les changements électrophysiologiques dans des neurones uniques identifiés. Ceci est accompli en identifiant d’abord soigneusement les neurones d’intérêt du ganglion de la plégie, après le traitement par protéase et le gainage du ganglion pour exposer les neurones. La deuxième étape consiste à enregistrer les propriétés électrophysiologiques des neurones identifiés.

Ensuite, isolez des neurones uniques à la suite de mesures électrophysiologiques, puis isolez les ARN de ces neurones pour une amplification linéaire. La dernière étape consiste à caractériser l’expression des gènes par PCR quantitative. Analyser les données électrophysiologiques et d’expression génique des traitements et des contrôles afin d’identifier des changements spécifiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’analyse des organes, des tissus ou des ganglions est qu’elle permet une analyse au niveau d’un seul neurone. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences cognitives, telles que la façon dont l’effort des gènes change dans les neurones uniques au cours du vieillissement, ou en réponse à différents réactifs pharmacologiques. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu étudier comment le vieillissement affecte le fonctionnement des neurones individuels et des circuits pour isoler les ganglions abdominaux.

Tout d’abord, anesthésez l’animal en injectant une solution de chlorure de magnésium de 380 millimolaires et attendez cinq à 10 minutes. Ensuite, identifiez les ganglions abdominaux en fonction de leur position dans le système nerveux central. Ensuite, retirez les ganglions par opération chirurgicale et stockez-les immédiatement dans l’eau de mer artificielle pour le traitement de la protéase.

Incuber les ganglions abdominaux dans une boîte de Pétri avec 0,1 % de protéase diluée dans un SW à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Notez que la quantité de protéase utilisée doit être normalisée en fonction de l’âge et du poids des animaux pour enlever la gaine ganglionnaire. Après le traitement enzymatique, épinglez le ganglion jusqu’à la base en silicone du cigare placée sur le dessus d’un cylindre en verre polycarbonate, perfusez-le avec un SW à 150 microlitres par minute à 18 degrés Celsius.

Afin d’augmenter la visibilité des neurones identifiés, le cylindre en verre polycarbonate peut être facilement éclairé par le bas à l’aide d’un stéréomicroscope binoculaire avec un grossissement de 20 x et 40 x. Ensuite, retirez soigneusement la gaine du ganglion à l’aide de pinces et de micro-ciseaux dans cette procédure. Tout d’abord, identifiez le neurone d’intérêt.

Ensuite, empalez le neurone avec une seule micro-électrode pointue intracellulaire remplie d’une solution de chlorure de potassium à trois molaires. Appliquez le médicament de votre choix dans la chambre cellulaire en pipetant doucement ou en l’injectant directement dans les neurones. Enregistrez ensuite l’activité neuronale à l’aide d’un système d’enregistrement intracellulaire.

Les données d’enregistrement sont traitées à l’aide d’un logiciel d’électrophysiologie tel qu’Axo graph pour isoler les neurones individuels. Après les expériences électrophysiologiques, arrêtez la perfusion A SW. Ensuite, lavez le ganglion avec de l’éthanol à 100 % afin de pétrifier les neurones.

Ensuite, retirez les neurones individuels à l’aide d’une paire de pinces fines et transférez-les dans un petit tube einor contenant 500 microlitres de glace froide. Réactif d’extraction d’ARN. Les neurones isolés peuvent être stockés dans un réactif d’extraction d’ARN à moins 80 degrés Celsius pour une analyse ultérieure afin d’isoler les ARN des neurones uniques à l’aide du protocole TRIOL standard pour l’isolement de l’ARN.

Ajouter brièvement 20 % volume par volume de chloroforme au triol et bien mélanger brièvement. Ensuite, placez les tubes sur un rotateur pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Faites tourner le mélange de chloroforme Triol à 12 000 fois la gravité pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, collectez la phase aqueuse et transférez-la dans un tube frais pour précipiter l’ARN. Ajouter une solution d’acétate de sodium à une concentration finale de 0,3 molaire, 100 nanogrammes par millilitre de glyco bleu, un co-précipitant, et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % à la phase aqueuse. Après cela, mélangez bien l’échantillon et incubez à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, faites tourner l’échantillon à 12 000 fois la gravité pendant 20 minutes. À quatre degrés Celsius, une petite pastille bleue sera visible au fond du tube. Après cela, retirez le surnageant et lavez la pastille avec 850 microlitres d’éthanol glacé à 75 % à 12 000 fois la gravité pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, retirez soigneusement le surnageant et faites sécher la pastille d’ARN à l’air libre pendant sept à 10 minutes. Assurez-vous que l’ARN ne sèche pas longtemps car il s’agit d’un séchage excessif. La pastille d’ARN rend la solubilisation très difficile.

Avant de vous préparer à l’analyse quantitative par PCR en temps réel, synthétisez un ARN A à partir de neurones uniques et amplifiez-le à l’aide d’un système d’amplification d’ARN commercialement linéaire. Générez ensuite de l’ADNC en utilisant un microgramme d’ARN A dans 20 microlitres d’une réaction de transcription inverse. Ensuite, diluez le CDNA dans de l’eau exempte de nucléases.

Après cela, ajoutez huit microlitres du mélange maître QPCR contenant deux microlitres de H2O cinq, des microlitres de deux mélanges maîtres cyber verts et un microlitre d’amorce avant et inverse de 10 micromolaires à deux microlitres d’ADNC dilué. Ensuite, pipetez le CDNA et le master mix. Fermez ensuite les tubes et scellez la plaque.

Mélangez le contenu en tapotant doucement et en tournant à 1 500 tr/min pendant 30 secondes avant de configurer la machine QPCR. Cette caricature montre l’enregistrement simultané des ganglions abdominaux à partir des neurones L sept et R 15. Et voici les enregistrements intracellulaires représentatifs de L sept et R 15.

Avec la flèche indiquant le moment d’une application d’HC, on pourrait continuer ces mesures pendant huit à 10 heures. Cette figure montre que les changements induits par un CH dans le potentiel d’action des formes d’onde R 15 AP ont été analysés avant, pendant et après une exposition au CH. Voici l’analyse QPCR de l’expression de CREB one dans les ganglions abdominaux et les neurones uniques identifiés.

Ce graphique montre la quantification absolue de CREB un transcrit dans les ganglions abdominaux jeunes et adultes de la plégie. Et ce graphique montre la quantification absolue de CEB un transcrit dans les neurones uniques identifiés de la plégie adulte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre, six heures et l’amplification d’isolement de l’ARN et la QPCR peuvent être complétées en trois jours si elles sont effectuées correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de standardiser le traitement de la protéase et l’ablation de la gaine ganglionnaire afin que l’activité neuronale soit préservée. Prenez également des précautions lorsque vous travaillez avec de l’ARN, comme porter des gants en tout temps. Utilisez des tubes d’égouttement sans ARN et de l’eau et traitez l’espace de travail avec des réactifs d’élimination des ARN.

Cette technique aidera également les chercheurs dans le domaine des neurosciences à explorer les bases physiologiques et moléculaires du comportement chez d’autres organismes modèles d’invertébrés tels que Triton, heli et limba.