Name: Aplysie Préparation des ganglions pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones simples (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Apprenez à préparer des ganglions d'Aplysia californica pour l'analyse électrophysiologique et moléculaire de neurones identifiés. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique et les propriétés neuronales à l'échelle cellulaire.

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Nous remercions sincèrement la Fondation Whitehall pour son soutien financier et les fonds de démarrage du Scripps Research Institute pour la réalisation de ce travail.

1. Préparation des ganglions abdominaux, mesures électrophysiologiques et isolement de neurones identifiés uniques à partir du ganglion abdominal d’Aplysia californica
<ol><li>Maintenir Aplysia dans l’aquarium de laboratoire avec de l’eau de mer artificielle circulante (ASW) à 16 °C dans des conditions claires:sombres à 12:12.</li>
	<li>Isolement de ganglion abdominal.<ol>
<li>Anesthésier les animaux en injectant une solution de MgCl2 de 380 mM pendant 5 à 10 minutes (équivalent à 30 à 35% du poids corporel de l’animal).</li>
		<li>Identifier le ganglion abdominal en fonction de sa position dans le système nerveux central24,28.</li>
		<li>Enlever les ganglions par opération chirurgicale et les stocker immédiatement dans de l’eau de mer artificielle composée de 450 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 10 mM deCaCl2,55 mMMgCl2,2,5 mM de NaHCO3 et 10 mM d’HEPES (pH 7,4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Traitement de la protéase.<ol>
<li>Incuber un ganglion abdominal pendant 30 min à 34 °C±0,5 dans une boîte de Petri avec de la protéase à 0,1 % (dispase) diluée dans de l’ASW décrit ci-dessus. REMARQUE: La quantité de protéase utilisée doit être normalisée en avec l’âge et le poids des animaux. En général, les animaux plus âgés et plus gros auraient besoin de plus de protéase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enlèvement de gaine de ganglions.<ol>
<li>Après le traitement enzymatique, épinglez les ganglions à la base en silicone Sylgard d’une chambre cellulaire (Ø = 1 cm; vol. = 0,3 ml) et perfuser avec de l’ASW (débit: 150 μl/min) à température ambiante (18 °C±2). REMARQUE: Afin d’augmenter la visibilité des neurones identifiés, placez le ganglion sur le dessus d’un cylindre en verre polycarbonate(Figure 1)(diamètre Ø = chambre cellulaire modifiée de 2 mm) qui peut être facilement éclairé par le bas à l’aide d’un stéréomicroscope binoculaire à grossissement 20X et 40X.</li>
		<li>Retirez soigneusement la gaine du ganglion à l’aide de pinces et de microscisseurs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrement électrophysiologique simultané de deux neurones.<ol>
<li>Identifier le neurone d’intérêt.</li>
		<li>Empaler le neurone avec une seule microélectrode pointue intracellulaire avec une résistance 10-15 MΩ remplie d’une solution de KCl 3 M.</li>
		<li>Enregistrer l’activité neuronale (passe de bande de 10 kHz) à l’aide d’un système d’enregistrement intracellulaire.</li>
		<li>Traiter les données d’enregistrement à l’aide d’un logiciel d’électrophysiologie tel qu’Axograph. REMARQUE: On peut facilement effectuer l’enregistrement de plusieurs neurones. Les neurones L7, L11 ou R15 et R2 sont facilement identifiables en fonction de leur position. Deux amplificateurs et deux micromanipulateurs sont nécessaires pour enregistrer simultanément à partir de deux neurones L7 et R15(Figure 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Demande de médicament.<ol>
<li>Appliquer le médicament de choix dans la chambre cellulaire par pipetage doux ou injecter directement dans les neurones.</li>
		<li>Effectuer des mesures électrophysiologiques. REMARQUE: Selon l’objectif expérimental, on pourrait mesurer différents paramètres électrophysiologiques des neurones tels que les changements de potentiel membranaire (MP) ou de potentiel d’action (AP) avant, pendant et après l’application du médicament.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolement des neurones uniques.<ol>
<li>À la fin des expériences électrophysiologiques, arrêtez la perfusion d’ASW et lavez le ganglion avec de l’éthanol à 100%.  L’exposition à l’éthanol pétrifiera les neurones et, à l’aide d’une pince fine, facilitera l’enlever des neurones individuels sans endommager d’autres neurones du ganglion.</li>
		<li>Retirez les neurones simples sous un stéréomicroscope et transférez-les dans un petit tube Eppendorf contenant un réactif d’extraction d’ARN glacé de 500 μl. Des neurones isolés peuvent être stockés dans un réactif d’extraction d’ARN à -80 °C pour une analyse future.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolement de l’ARN à partir de neurones uniques et analyse de l’expression génique par PCR quantitative en temps réel (qPCR)
<ol><li>Précautions à prendre pour minimiser la dégradation de l’ARN : Les ribonucléèses (RNases) dégradent l’ARN et sont des enzymes très stables et actives. Suivez les étapes suivantes lors de la gestion des ARN.<ol>
<li>Nettoyez la zone de travail et les instruments avec des agents de désactivation RNase.</li>
		<li>Portez des gants en tout temps tout en manipulant l’ARN et changez souvent de gants.</li>
		<li>Utilisez uniquement des plastiques sans RNase pour manipuler les ARN.</li>
	</ol></li>
	<li>Isoler l’ARN total des neurones simples:<ol>
<li>Le protocole standard trizol pour l’isolement de l’ARN peut être utilisé pour isoler les ARN à partir de neurones uniques. Ajouter brièvement 20% v/v de chloroforme à Trizol, bien mélanger par un bref vortex.</li>
		<li>Placer les tubes sur rotateur pendant 10 min à 4 °C. Faire tourner le mélange Trizol-Chloroforme à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
		<li>Recueillir la phase aqueuse et le transférer dans un tube frais.</li>
		<li>Ajouter une solution d’acétate de sodium (pH 5,5) à une concentration finale de 0,3 M, 100 ng/ml du coprecipitant GlycoBlue et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % pour précipiter l’ARN.</li>
		<li>Bien mélanger les échantillons et incuber à -80 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Faites tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 20 min à 4 °C et une petite pastille bleue sera visible au fond du tube.</li>
		<li>Retirer le surnageant et laver le culot avec 850 μl d’éthanol glacé à 75 % à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
		<li>Retirez soigneusement le surnageant et séchez à l’air la pastille d’ARN pendant 7-10 min, maximum. REMARQUE: Assurez-vous que l’ARN n’est pas laissé longtemps à sécher comme plus- leséchage de la pastille d’ARN rend la solubilisation très difficile.
</li>
		<li>Une fois séché, ressusciter la pastille d’ARN dans 10 μl d’eau exempte de RNAse et déterminer la concentration d’ARN. REMARQUE: Déterminer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Lorsque vous n’utilisez pas immédiatement, stockez l’ARN à -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse de l’ARN à partir de neurones uniques :<ol>
<li>Amplifier l’ARN (un ou deux tours selon l’objectif expérimental) en utilisant un système d’amplification linéaire de l’ARN disponible dans le commerce. REMARQUE: L’ARN total des neurones simples variait de ~ 10-60 ng. Le rendement attendu du premier cycle d’amplification est d’environ 100-300 ng et le deuxième cycle d’amplification est d’environ 0,8-1,5 μg d’ARN.</li>
	</ol></li>
	<li>Transcription inverse de l’ARN :<ol>
<li>Pour générer de l’ADNc à partir d’ARN, utilisez 1,0 μg d’ARN dans 20 μl d’une réaction de transcription inverse. Plusieurs kits sont disponibles dans le commerce à cet effet. REMARQUE: L’ADNc a été synthétisé selon le protocole du fabricant en utilisant les paramètres suivants sur le cycleur thermique. 5 min à 25 °C 30 min à 42 °C 5 min à 85 °C Maintenir à 4 °C</li>
		<li>Après l’étape de transcription inverse, stockez l’ADNc à -20 °C pour un stockage à long terme.</li>
	</ol></li>
	<li>Conception et normalisation de l’apprêt : Plusieurs excellents logiciels sont disponibles, gratuitement, pour concevoir des amorces pour des amplifications en temps réel.<ol>
<li>Sélectionnez 18 à 24 oligonucléotides mer qui produisent des amplicons de 70 à 110 pb et synthétisez les amorces à l’aide de sources commerciales. REMARQUE : Deux à trois paires d’amorces doivent être conçues pour chaque gène d’intérêt. Chaque ensemble d’amorces doit être normalisé par qPCR. Les paires d’amorces avant et arrière qui ont été utilisées pour le gène CREB1 (Figure 4) sont ci-dessous : Jeu d’amorces 1 Avant: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3' Revers : 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Jeu d’amorces 2 Avant: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Inverse: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Pour sélectionner la meilleure amorce à utiliser pour les analyses en aval, surveillez la valeur Ct et la forme de la courbe d’amplification en qPCR. REMARQUE: Les amorces qui donnent des valeurs Ct (seuil de cycle) comprises entre 10 et 35 dans l’amplification ronde 40 et des courbes lisses pendant la phase exponentielle de la PCR suivie d’un plateau lisse sont optimales pour les analyses d’expression génique.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR quantitative en temps réel (qPCR) : Remarque : Utilisez des tubes ou des plaques appropriés compatibles avec la machine qPCR.<ol>
<li>Diluer l’ADNc à 5x avec de l’eau sans nucléase.</li>
		<li>À 2 μl d’ADNc dilué, ajouter 8 μl d’un mélange maître qPCR contenant 2 μl deH2O,5 μl de 2x mélange maître SYBR Green et 1,0 μl de 10 μM (chacun) d’amorce avant et arrière.</li>
		<li>Fermez les tubes et scellez la plaque après avoir pipeté l’ADNc et le mélange maître. Mélanger le contenu en tapotant doucement et en tournant vers le bas à 1 500 tr / min pendant 30 secondes.</li>
		<li>Passez à la configuration de la machine qPCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le neurone R15 est impliqué dans la régulation des systèmes cardiovasculaire, digestif, respiratoire et reproducteur30. Une activité d’éclatement régulièrement rythmique de l’AP est une caractéristique de R15. Comme le montre la section des résultats, l’enregistrement apparié de R15 et L7 montre que la préparation des ganglions a préservé l’activité des neurones R15. Les neurones R15 et L7 ont répondu convenablement à Ach. Cette préparation de ganglions a pu être maintenue jusqu’à 8-10 heures et l’activité éle...

Le cerveau humain est extraordinairement complexe avec près de 100 milliards de neurones et des billions de connexions synaptiques. Il existe un nombre presque égal de cellules non neuroneuronales qui interagissent avec les neurones et régulent leur fonction dans le cerveau. Les neurones sont organisés en circuits qui régulent des comportements spécifiques. Malgré les progrès réalisés dans notre compréhension des fonctions cérébrales et des circuits neuronaux, on sait peu de choses sur l’identité des composants des circuits qui contrôlent un comportement spécifique. La connaissance des identités de divers composants d’un circuit facilitera grandement notre compréhension de la base cellulaire et moléculaire du comportement et aidera à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les troubles neuropsychiatriques.
L’escargot marin Aplysia californica a été un cheval de bataille pour déterminer les circuits neuronaux sous-jacents à des comportements spécifiques1-14. Le système nerveux d’Aplysia contient environ 20 000 neurones qui sont organisés en 9 ganglions différents. Les neurones de l’Aplysia sont grands et peuvent être facilement identifiés en fonction de leur taille, propriétés électriques, et la position dans les ganglions. Aplysia a un riche répertoire de comportements qui peuvent être étudiés. L’un des comportements bien étudiés est le réflexe de retrait des branchies (GWR). Les composants centraux de ce réflexe sont situés dans les ganglions abdominaux. Les composantes des circuits de la régression pondérée géographiquement ont été cartographiées et les contributions de divers composants ont été déterminées. Il est important de faire en charge les circuits de régression pondérée géographiquement par5,6,15-19. Des décennies d’étude sur ce réflexe ont également identifié plusieurs voies de signalisation qui ont un rôle clé dans l’apprentissage et la mémoire20-24.
Plusieurs préparations différentes d’Aplysia ont été employées pour étudier la base cellulaire et moléculaire du stockage de mémoire. Il s’agit notamment de l’animal intact2,3,de la préparation semi-intacte1,7,13,14,16 et de la reconstitution des principaux composants des circuits neuronaux25-29. Une préparation réduite pour explorer des ganglions d’aplysie pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des circuits neuronaux identifiés est décrite ici. Les quatre neurones identifiés suivants ont été étudiés. R15, un neurone éclatant, L7 et L11, deux neurones moteurs différents et R2, un neurone cholinergique ont été étudiés. R2 est le plus grand neurone décrit dans le système nerveux des invertébrés. En bref, cette méthodologie implique le traitement de la protéase des ganglions, des mesures électrophysiologiques avant et après les traitements pharmacologiques, et l’isolement des neurones simples pour l’analyse quantitative de l’expression des gènes. Cette méthodologie nous permet de combiner des analyses moléculaires avec l’enregistrement simultané de plusieurs neurones. Cette méthodologie a été avec succès employée pour étudier des réponses des neurones R15 et L7 à l’acétylcholine (Ach) par les enregistrements intracellulaires appariés. Après des mesures électrophysiologiques R15 et L7 et d’autres neurones identifiés tels que L11 et R2 ont été isolés pour l’analyse quantitative de l’amplification en chaîne par réaction (qPCR) de l’expression de CREB1, un facteur de transcription important pour le stockage de mémoire.

<table><tbody><tr><td>Aplysia</td><td>National Aplysia Resource Facility, Université de Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S 3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P 9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull ; 2H2O</td><td>SIGMA</td><td>C5080- 500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull ; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 214-501</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO4</td><td>SIGMA</td><td>S 6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H 3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protéase</td><td>GIBCO</td><td>17105-042</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194002</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>ACROS</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc, pH 5,5</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Ambion</td><td>AM9737</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II Kit d’amplification d’ARNa</td><td>Ambion</td><td>AM1751</td><td></td></tr><tr><td>qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95048-100</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outils de science fine</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Broches Minutien en acier inoxydable&nbsp ;</td><td>Outils de haute technologie</td><td>26002-10 ou</td><td></td></tr><tr><td>26002-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur Veriti</td><td>Applied Biosystems</td><td>Thermocycleur</td><td></td>Veriti</tr><tr><td>5430R Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td> 7900HT <td></td></tr><tr><td>PCR rapide en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT Amplificateur PCR</td><td></td>rapide en temps réel</tr><tr><td></td><td>BRAMP-01R</td><td>NPI Electronique</td><td></td></tr><tr><td>Digidata Converter</td><td>Instrutech ITC-18</td><td>HEKA ELEKTRONIK</td><td></td></tr><tr><td>Micro Manipulator</td><td>Patch Star</td><td>Scientifica</td><td></td></tr></tbody></table>

aplysie préparation des ganglions pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones simples

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Un défi majeur en neurobiologie est de comprendre les fondements moléculaires des circuits neuronaux qui régissent un comportement spécifique. Une fois que les mécanismes moléculaires spécifiques sont identifiés, de nouvelles stratégies thérapeutiques peuvent être développées pour traiter les anomalies dans des comportements spécifiques causés par des maladies dégénératives ou le vieillissement du système nerveux. L’escargot marin Aplysia californica est bien adapté aux investigations de la base cellulaire et moléculaire du comportement parce que les circuits neuronaux sous-jacents à un comportement spécifique pourraient être facilement déterminés et les composants individuels des circuits pourraient être facilement manipulés. Ces avantages de l’Aplysia ont conduit à plusieurs découvertes fondamentales de la neurobiologie de l’apprentissage et de la mémoire. Ici, nous décrivons une préparation du système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires des neurones individuels. En bref, le ganglion disséqué du système nerveux est exposé à la protéase pour enlever la gaine ganglionnaire de telle sorte que les neurones soient exposés mais conservent l’activité neuronale comme chez l’animal intact. Cette préparation est utilisée pour effectuer des mesures électrophysiologiques de neurones simples ou multiples. Il est important de noter qu’après l’enregistrement à l’aide d’une méthodologie simple, les neurones pourraient être isolés directement des ganglions pour l’analyse de l’expression génique. Ces protocoles ont été utilisés pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques simultanés à partir de neurones L7 et R15, étudier leur réponse à l’acétylcholine et quantifier l’expression du gène CREB1 dans des neurones L7, L11, R15 et R2 uniques isolés d’Aplysia.

Le poids des animaux utilisés dans cette étude variait de 100 à 200 g. Suivant les protocoles décrits, nous avons effectué des mesures électrophysiologiques et l’analyse moléculaire des neurones des ganglions abdominaux isolés chez les animaux s’étendant de 2-5 g à 200-300 g.
La normalisation du traitement de protéase est importante pour des mesures électrophysiologiques réussies des neurones dans les ganglions. Initialement, des concentrations et des durées multiples de protéase (Dispase) ont...

L’escargot marin Aplysia californica a été largement utilisé comme modèle de neurobiologie pour les études sur la base cellulaire et moléculaire du comportement. Ici, une méthodologie est décrite pour explorer le système nerveux d’Aplysia pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones uniques de circuits neuronaux identifiés.

Aplysie Préparation des ganglions pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones simples

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'expression génique et les modifications électrophysiologiques dans des neurones identifiés individuels. Cela est réalisé en identifiant d'abord soigneusement les neurones d'intérêt à partir du ganglion de plegia, après le traitement par protéase et l'élimination de la gaine pour exposer les neurones. La deuxième étape consiste à enregistrer les propriétés électrophysiologiques des neurones identifiés.Ensuite, isoler des neurones individuels après les mesures électrophysiologiques, puis isoler les ARN à partir de ces neurones pour une amplification linéaire. La dernière étape consiste à caractériser l'expression génique par PCR quantitative. Enfin, analyser les données électrophysiologiques et d'expression génique provenant des traitements et des témoins afin d'identifier des modifications spécifiques.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse d'organes, de tissus ou de ganglions, est qu'elle permet une analyse au niveau du neurone unique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences cognitives, comme la manière dont l'expression des gènes évolue dans des neurones individuels au cours du vieillissement, ou en réponse à différents réactifs pharmacologiques. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous souhaitions étudier comment le vieillissement affecte le fonctionnement des neurones et des circuits individuels afin d'isoler les ganglions abdominaux.Tout d'abord, anesthésiez l'animal en injectant une solution de chlorure de magnésium à 380 millimolaire et attendez cinq à dix minutes. Ensuite, identifiez les ganglions abdominaux selon leur position dans le système nerveux central. Puis retirez les ganglions par intervention chirurgicale et stockez-les immédiatement dans de l'eau de mer artificielle pour un traitement protéolytique.Incuber les ganglions abdominaux dans une boîte de Pétri avec une solution de protéase à 0,1 % diluée dans une E.S. à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Remarquez que la quantité de protéase utilisée doit être normalisée en fonction de l'âge et du poids des animaux afin de retirer la gaine du ganglion. Après le traitement enzymatique, épingler le ganglion sur une base en silicone en forme de cigare placée au sommet d'un cylindre en verre polycarbonate, puis le perfuser avec une E.S. à raison de 150 microlitres par minute à 18 degrés Celsius.Afin d'augmenter la visibilité des neurones identifiés, le cylindre en verre de polycarbonate peut être facilement éclairé par le bas à l'aide d'un microscope stéréo binoculaire avec un grossissement de 20 x et 40 x. Ensuite, retirez soigneusement la gaine du ganglion à l'aide de pinces et de ciseaux microchirurgicaux au cours de cette procédure. Tout d'abord, identifiez le neurone d'intérêt.Ensuite, piquez le neurone avec une unique microélectrode intracellulaire effilée remplie d'une solution de chlorure de potassium à trois molarités. Appliquez le médicament choisi dans la chambre cellulaire en pipetant doucement ou en injectant directement dans les neurones. Ensuite, enregistrez l'activité neuronale à l'aide d'un système d'enregistrement intracellulaire.Les données d'enregistrement sont traitées à l'aide d'un logiciel d'électrophysiologie tel qu'Axo graph afin d'isoler les neurones uniques. Après les expériences d'électrophysiologie, arrêtez la perfusion de A SW. Ensuite, lavez le ganglion avec de l'éthanol à 100 % afin de pétrifier les neurones.Ensuite, retirez les neurones individuels à l’aide d’une pince fine et transférez-les dans un petit tube Eppendorf contenant 500 microlitres de réactif d’extraction d’ARN glacé. Les neurones isolés peuvent être conservés dans le réactif d’extraction d’ARN à moins 80 degrés Celsius pour des analyses ultérieures afin d’isoler les ARN de neurones individuels en utilisant le protocole standard TRIOL pour l’isolement d’ARN.Ajouter brièvement 20 % en volume de chloroforme par rapport au triol et bien mélanger en vortexant brièvement. Ensuite, placer les tubes sur un rotateur pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Centrifuger le mélange de triol et de chloroforme à 12 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, récupérez la phase aqueuse et transférez-la dans un tube propre pour précipiter l'ARN. Ajoutez une solution d'acétate de sodium pour obtenir une concentration finale de 0,3 molaire, 100 nanogrammes par millilitre du co-précipitant GlycoBlue et 2,5 volumes d'éthanol à 100 % à la phase aqueuse. Mélangez ensuite soigneusement l'échantillon et incubez à moins 80 degrés Celsius toute la nuit.Le lendemain, centrifuger l'échantillon à 12 000 ×g pendant 20 minutes. À quatre degrés Celsius, un petit culot bleu sera visible au fond du tube. Ensuite, éliminer le surnageant et laver le culot avec 850 microlitres d'éthanol glacé à 75 % à 12 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, retirez soigneusement le surnageant et laissez sécher le culot d'ARN à l'air pendant sept à dix minutes. Veillez à ne pas laisser l'ARN sécher trop longtemps, car un séchage excessif rend la solubilisation très difficile.Avant de préparer l'analyse par PCR quantitative en temps réel, synthétisez un ARN A à partir de neurones individuels et amplifiez-le à l'aide d'un système d'amplification linéaire d'ARN disponible dans le commerce. Ensuite, générez de l'ADNc en utilisant un microgramme d'ARN A dans une réaction de transcription inverse de 20 microlitres. Puis, diluez l'ADNc dans de l'eau libre de nucléase.Ensuite, ajoutez huit microlitres du mélange maître de QPCR contenant deux microlitres d'H2O, cinq microlitres de mélange maître au vert cyber à 2x et un microlitre d'amorces directe et inverse à 10 micromolaire à deux microlitres d'ADNc dilué. Ensuite, pipetez l'ADNc et le mélange maître. Puis fermez les tubes et scellez la plaque.Mélangez le contenu en tapotant doucement et en centrifugeant à 1 500 tr/min pendant 30 secondes avant de préparer la machine de PCR quantitative. Ce schéma montre l'enregistrement simultané du neurone L sept et du neurone R 15 des ganglions abdominaux. Voici des enregistrements intracellulaires représentatifs des neurones L sept et R 15.Avec la flèche indiquant le moment d'une application de CH, on pourrait poursuivre ces mesures pendant huit à dix heures. Cette figure montre que le CH a induit des modifications du potentiel d'action des formes d'onde du PA de R 15, analysées avant, pendant et après une exposition au CH. Voici l'analyse par QPCR de l'expression de CREB un dans les ganglions abdominaux et dans des neurones identifiés individuels.Ce graphique montre la quantification absolue du transcrit CREB1 dans les ganglions abdominaux jeunes et adultes de la plegia. Et ce graphique montre la quantification absolue du transcrit CEB1 dans les neurones uniques identifiés de la plegia adulte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à six heures, et l'isolement de l'ARN, son amplification et la QPCR peuvent être terminés en trois jours si elle est correctement effectuée.Lors de cette procédure, il est important de normaliser le traitement par protéase et le retrait de la gaine du ganglion afin de préserver l'activité neuronale. De plus, prenez des précautions lors de la manipulation d'ARN, comme le port systématique de gants. Utilisez des tubes et de l'eau exempts d'ARNases, et traitez l'espace de travail avec des réactifs éliminant les RNAses.Cette technique aidera également les chercheurs dans le domaine des neurosciences à explorer la base physiologique et moléculaire du comportement chez d'autres organismes modèles invertébrés tels que Triton, heli et limba.

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Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN représentent une couche de régulation de la traduction sous-étudiée qui a récemment été liée à la plasticité du système nerveux central. Ici, la préparation des échantillons et l’approche de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem sont décrites pour la caractérisation simultanée de nombreuses modifications de l’ARN dans des neurones uniques.

Caractérisation des modifications de l’ARN dans des neurones uniques à l’aide de la spectrométrie de masse

Apprenez à préparer des ganglions d'Aplysia californica pour l'analyse électrophysiologique et moléculaire de neurones identifiés. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique et les propriétés neuronales à l'échelle cellulaire.

Aplysie Préparation des ganglions pour les analyses électrophysiologiques et moléculaires de neurones simples

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