Une méthode pour étudier l'impact de l'échec ovarien chimiquement induite sur la capacité d'exercice et cardiaque adaptation chez la souris

L'objectif général de cette procédure est d'accélérer le processus naturel d'atrésie folliculaire dans les ovaires, entraînant ainsi une insuffisance ovarienne, une diminution de l'œstrogène et une femelle non cyclique, un état qui imite de près la ménopause. Ceci est réalisé en administrant d'abord pendant 15 à 20 jours consécutifs la substance chimique industrielle dioxyde de vinylcyclohexène, ou VCD, qui s'est révélée cibler spécifiquement et détruire les petits follicules ovariens primaires et primitifs en accélérant leur processus naturel d'atrésie. La deuxième étape consiste à déterminer le cycle œstral et la cyclicité ovarienne par cytologie vaginale, en commençant environ six semaines après le début des injections de VCD.

Une absence de cycle ou une acyclicité persistante de 15 à 20 jours doit être observée par c cytologie vaginale afin de confirmer la perte du cycle et l'insuffisance ovarienne. La dernière étape consiste à mettre en œuvre une intervention pouvant être influencée par la ménopause ou la transition vers la ménopause, telle qu'un exercice volontaire sur une roue en cage ou l'adaptation cardiaque. En définitive, l'activité volontaire sur la roue en cage et l'adaptation cardiaque sont utilisées pour déterminer si la ménopause diminue l'activité sur la roue en cage.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'ectomie, est que l'ectomie est une procédure chirurgicale entraînant une disparition soudaine des œstrogènes, contrairement à la perte progressive naturelle des œstrogènes observée lors de la transition de la préménopause à la postménopause. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des maladies métaboliques et cardiovasculaires chez les femmes ménopausées, car ces dernières sont particulièrement plus sensibles au syndrome métabolique et à ses comorbidités associées, notamment les maladies cardiovasculaires, par rapport aux femmes préménopausées. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de la cytologie vaginale sont difficiles à apprendre, étant donné qu'il faut faire preuve de précaution pour appliquer correctement la technique de frottis et identifier le cycle EST.

Quatre, le dioxyde de vinylcycline ou VCD est conservé à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer le VCD selon le protocole d'injection, ajoutez 0,587 millilitre de VCD dans un flacon doseur propre et complétez jusqu'à un volume final de 10 millilitres avec de l'huile de sésame. Couvrez, scellez avec du parafilm et mélangez en retournant doucement. Conservez à 4 degrés Celsius pendant une durée maximale de sept jours.

Pour commencer le protocole d'injection de VCD, peser deux souris âgées de deux mois pendant 20 jours consécutifs, administrer quotidiennement par voie intrapéritonéale du VCD à température ambiante à une dose de 160 milligrammes par kilogramme, en utilisant une aiguille de calibre 27 pendant la période d'injection. Tenter d'alterner les sites d'injection afin de réduire les risques d'infection locale de manière similaire. Injecter aux souris témoins la solution véhicule, l'huile de sésame, à un volume de 2,5 millilitres par kilogramme après la fin de la période d'injection.

Surveillez le cycle œstral quotidiennement en prélevant des frottis vaginaux. L'un des facteurs essentiels au succès de cette étude est l'obtention de frottis vaginaux de haute qualité pour la détermination cytologique. Immobilisez les souris en utilisant la méthode de prise par le dos de la nuque.

Insérez un compte-gouttes contenant 0,2 millilitres de solution saline stérile dans l'orifice vaginal à une profondeur de 0,5 centimètre. Mélangez trois fois la solution saline injectée à l’aide du compte-gouttes, puis déposez une goutte sur une lame vide. Évaluez immédiatement chaque échantillon au microscope optique standard à un grossissement de 100 x pour confirmer l’insuffisance ovarienne.

Par la suite, les souris ménopausées induites par VCD sont utilisées pour les expériences d'exercice. L'appareil de roue de cage se compose d'une roue de 11,5 centimètres de diamètre avec une surface de course de cinq centimètres de large, équipée d'un compteur magnétique numérique activé par la rotation de la roue. Avant chaque test de course sur roue, étalonner la roue de cage conformément aux instructions du fabricant.

Mesurez le diamètre intérieur de la roue de course. Calculez la circonférence et saisissez cette valeur dans le compteur numérique comme taille de roue pour monter la roue sur la cage, faites glisser la roue. Passez par le grillage supérieur de la cage à animaux.

Fixez le support de roue au grillage de la cage à l’aide de pinces à levier. Les pinces doivent être placées au-dessus du grillage, à l’écart de l’animal. Passez la partie ordinateur et tout câble supplémentaire à travers le grillage de la cage.

Placer l'ordinateur et le câble excédentaire hors de portée de l'animal. Cela peut être réalisé en plaçant un récipient en plastique de taille moyenne utilisé pour la pesée sur le dessus du câblage de la cage afin de maintenir l'ordinateur et le câble excédentaire. Ensuite, fixer la partie ordinateur du compteur magnétique numérique sur le support du rouet.

À l’aide de ruban adhésif, fixez l’aimant libre du compteur magnétique numérique sur la barre centrale, du même côté que le câble de l’aimant vers l’ordinateur. Fixez-le à nouveau suffisamment avec du ruban pour protéger l’aimant des dommages causés par la mastication. L’aimant doit être positionné de sorte que chaque rotation de la roue soit enregistrée par l’ordinateur, sans interférence ni résistance empêchant une rotation complète de la roue.

Fixer la roue tournante à la roue. Installer le support de roue en insérant les poteaux du support dans les trous de fixation situés sur les barres centrales de la roue. S'assurer que la roue peut tourner librement.

L'installation doit être surveillée quotidiennement pour détecter tout dommage causé par la mastication et réparée selon les besoins pour l'expérience. Des souris femelles consanguines de sept mois, C57, black six et B6C3F1, provenant d'une même portée, sont réparties aléatoirement entre le régime d'exercice et le groupe témoin sédentaire. Comment les animaux expérimentaux sont-ils logés individuellement ? Dans une cage de 47 × 26 × 14,5 centimètres, avec un accès libre à une roue de cage pendant 28 jours. Les animaux témoins sont logés ensemble dans une cage sans roue.

Fournir à tous les animaux de l'eau et une alimentation standard pour rongeurs. Ajouter du lidocaïne manuellement et enregistrer quotidiennement les valeurs de distance parcourue et du temps total passé à courir, données par le compteur magnétique. Enregistrer les valeurs de distance et de temps dans le même laps de temps d'une heure chaque jour, afin d'obtenir des valeurs précises et cohérentes pendant toute la durée de 28 jours de la période d'exercice. Après chaque enregistrement quotidien, remettre à zéro le compteur magnétique afin d'assurer des mesures exactes le jour suivant.

À la fin de la période d'exercice spécifique, les masses corporelles des animaux sacrifiés sont enregistrées avant la récolte des tissus. Pour exposer le cœur, pratiquer une incision médiane sur la face ventrale, ouvrir le diaphragme et visualiser rapidement le cœur. Prélever le cœur à la base et le placer dans une solution saline tamponnée au phosphate froide afin d'éliminer complètement le sang résiduel présent dans le ventricule. Retirer les tissus excédentaires du cœur, peser l'organe entier et, si souhaité, le congeler instantanément dans l'azote liquide.

Prélevez des tissus supplémentaires, rincez-les avec une solution saline tamponnée au phosphate refroidie sur glace modifiée et congélez-les rapidement dans de l'isopentane refroidi à l'azote liquide. Dans cette étude, l'insuffisance ovarienne a été induite par un traitement au VCD et confirmée par examen microscopique de frottis vaginaux. Le stade du cycle œstral est déterminé par la proportion de cellules épithéliales, les cellules épithéliales quantifiées et les leucocytes dans les cellules épithéliales nucléées des PROEs, qui prédominent.

Ici, les flèches indiquent des cellules nucléées pendant que les cellules estro sont principalement des cellules épithéliales squameuses anucléées. Le maestrus se caractérise par un mélange de types cellulaires avec une prédominance de leucocytes. Le diestrus est dominé par des leucocytes.

Le cycle œstral chez la souris dure généralement quatre jours avant l'injection de VCD. Les animaux étaient considérés comme acycliques après 15 jours de diestrus persistant. Ce graphique montre la durée moyenne en jours du cycle œstral des groupes injectés avec le véhicule et ceux injectés avec du VCD.

Un cycle est mesuré à partir du premier jour du stade d'œstrus (ES) jusqu'au premier jour du cycle suivant. La cytologie vaginale en ES a commencé environ six semaines après le début des injections. On a observé que les cycles ŒSTRUS chez les animaux injectés avec le VCD devenaient irréguliers par rapport aux animaux injectés avec le véhicule, et après 12 cycles œstraux, la cytologie de tous les animaux injectés avec le VCD n'indiquait plus de cyclicité à l'issue du protocole d'injection de VCD. L'analyse histologique par coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H et E) de coupes transversales de tissu ovarien a révélé une atrophie significative du tissu ovarien traité au VCD par rapport aux témoins.

Lorsqu'elles sont observées à une amplification de 20 x à une amplification de 200, une élimination complète des follicules primaires et primordiaux a été observée dans le tissu traité au VCD. Contrairement au tissu traité au véhicule, l'effet de l'insuffisance ovarienne induite par le VCD sur la performance à l'exercice a été testé chez des souris de sept mois traitées au VCD et au véhicule de deux souches ; les valeurs quotidiennes d'exercice sur roue de cage ont été enregistrées en temps et en distance pour chaque animal exerçant tout au long d'une période d'exercice de quatre semaines. Cette figure montre les moyennes hebdomadaires des valeurs quotidiennes de course en distance, en temps et en vitesse.

Pour les souris C57BL/6 traitées soit avec le véhicule soit avec du VCD, aucune différence significative n'a été observée concernant la performance à l'exercice, mesurée par la distance moyenne quotidienne parcourue et le temps passé sur la roue, entre les groupes traités au VCD et ceux traités au véhicule, ni chez les souris de souche C57BL/6 ni chez celles de souche B6C3F1. Ceci indique que l'impact de l'insuffisance ovarienne induite par le VCD sur l'exercice volontaire en roue de cage transcende au moins deux souches murines après la durée du protocole d'exercice volontaire en cage. Les morphométries corporelles ont été enregistrées et les cœurs ont été rapidement excisés et pesés, en accord avec des observations antérieures.

L'hypertrophie cardiaque en réponse à l'exercice sur roue dans la cage, mesurée par le poids cardiaque absolu et le poids cardiaque normalisé par rapport à la longueur du tibia, a été observée. Bien que la masse cardiaque absolue et le rapport poids cardiaque sur longueur du tibia soient significativement plus élevés chez les souris traitées au véhicule et au VCD par rapport à leurs homologues sédentaires, aucune différence mesurable de l'hypertrophie cardiaque n'a été détectée entre les souris témoins et celles présentant une insuffisance ovarienne induite par le VCD. Enfin, après l'exercice volontaire sur roue dans la cage, les souris traitées au VCD et au véhicule ont été soumises à une course forcée sur tapis roulant afin d'évaluer leurs capacités d'exercice à intensité élevée et faible.

Dans le protocole à haute intensité, la vitesse moyenne du tapis roulant a été augmentée progressivement toutes les 10 minutes jusqu'à ce que les souris présentent des signes d'épuisement. En moyenne, la vitesse maximale des souris traitées au véhicule était de 26,7 ± 0,95 mètres par minute, et la vitesse maximale des souris traitées au VCD était de 28 ± 1,4 mètres par minute avant l'épuisement. Une course à intensité plus faible, à 20 mètres par minute, a été utilisée pour évaluer la capacité d'endurance.

En moyenne, le temps maximal des souris traitées au véhicule était de 28,3 ± 1,3 minute et le temps maximal des souris traitées au VCD était de 29,7 ± 1,4 minute avant l'épuisement. Aucune différence significative concernant la capacité d'exercice à intensité élevée ou faible n'a été observée entre les groupes traités au véhicule et ceux traités au VCD, indiquant que l'insuffisance ovarienne induite par le VCD n'avait aucun effet sur la capacité d'exercice des souris. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines des sciences cellulaires, moléculaires et physiologiques pour explorer le rôle de la ménopause chez les rongeurs.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser correctement les injections de VCD, effectuer la cytologie vaginale et mettre en œuvre une intervention physiologique.