Name: Inverser levure système à deux hybrides pour identifier les mammifères Nuclear Receptor résidus qui interagissent avec des ligands et / ou antagonistes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Découvrez un test de double hybride à haut débit dans la levure pour identifier les résidus du récepteur nucléaire PXR impliqués dans l'interaction avec le kétoconazole. Cette méthode permet de repérer les mutations conférant une résistance au médicament.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (NIH) Subventions CA127231 et la Fondation Damon Runyon Clinical Investigator Award (CI 1502) (SM). Nous tenons à remercier le professeur Zdenek Dvorak de Palacky University Olomouc, République tchèque pour ses renseignements utiles sur la portabilité discuter de cette technique à leur institution et standardisation du protocole.

Une. Construction de PXR et SRC-1 Fusions dans les vecteurs de levure <ol><li> Amplification par PCR de l&#39;homme PXR LBD (107-434 acides aminés) et Human SRC-1 pleine longueur (1-1401 acides aminés). <ol><li> Utilisez pSG5-hPXR plasmide 8 comme PXR LBD modèle, utilisez plasmide pCMX-SRC1 que SRC-1 modèles. </li><li> SuperMix PCR dégel, des matrices d&#39;ADN et des amorces (voir Matériaux), gardez-les sur de la glace. </li><li> Ajouter 0,25 pg / pl matrice d&#39;ADN 1 pi, 10 mM paires d&#39;amorces 2 pi chacun, SuperMix PCR 45 pi et ajouter H 2 O pour porter le volume total à 50 pi. </li><li> Set PCR à un cycle de 94 ° C pendant 2 min, 20 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 sec et 72 ° C pendant 2 min, puis un cycle de 72 ° C pendant 10 minutes pour l&#39;extension. Voir les produits de PCR en exécutant sur gel d&#39;agarose à 1%. </li></ol></li><li> Les produits de PCR clonage dans des vecteurs Y2H. <ol><li> Purifier les produits de PCR à partir de gel d&#39;agarose à 1%. Digest PXR, LBD, PCR, et Y2H vecteur PSH2-1 avecBamHI et Sali; digérer SRC-1 PCR et Y2H vecteur pGADNOT avec NotΙ et SalΙ. Pour ce faire, ajouter 1 pg d&#39;ADN, 3 ul de tampon de réaction 10 x, 1 ul d&#39;enzymes de restriction et finalement H 2 O pour amener le volume total à 30 ul. </li><li> Placer les échantillons dans de digestion à 37 ° C bain d&#39;eau pendant 1 heure. Vérifier la digestion en exécutant sur gel d&#39;agarose à 1%. </li><li> Purifier les échantillons de digestion de gel d&#39;agarose à 1%, ligaturer digéré les produits de PCR et des vecteurs Y2H et à transformer des cellules compétentes DH5a. </li><li> Choisissez les colonies et isoler l&#39;ADN plasmidique. </li></ol></li><li> Identifier l&#39;ADN plasmidique PSH2-1-PXR par BamHI / Sall digestion, identifier pGADNOT-SRC-1 ADN plasmidique par Notl / Sall digestion. Vérifiez tout l&#39;ADN plasmidique positif par séquençage. </li></ol> 2. Yeast Two-hybrid dosages <ol><li> Inoculer la souche de levure dans 5 ml YPAD et incuber pendant une nuit par une agitation constante (220 rpm à 30 ° C). Remarque: La souche Saccharomyces cerevisiae était CTY10-5d(MAT une ade2 trp 1-901 leu2-3, 112 his3-200 ga l4 - GAL80 - URA3 :: lexA-lacZ) qui contient un gène intégré GAL1-lacZ avec lexA opérateur 10. Pour obtenir des cellules de levure viables résistantes au kétoconazole, mais ceux qui ne portent pas des altérations de transporteur en tant que cause de la résistance azole 18 à 20, de nouvelles souches de levure CTY10-5d ont été obtenus selon la première erg 3 de suppression (erg 3 de Δ) et en introduisant ensuite la suppression supplémentaire en ERG11 (erg 3 Δ / erg11 Δ) gènes par recombinaison homologue. Les détails de construction ont été décrits dans un manuscrit déjà publié 6. </li><li> Le lendemain (le matin), ensemencer la levure (01h20) dans 5 ml YAPD et incuber à obtenir une DO 600 ~ 0,2 par agitation constante (220 rpm à 30 ° C). </li><li> Sédimenter les cellules à 2.000 tours par minute dans une microcentrifugeuse pendant 2 minutes et éliminer le surnageant. Laver ensuite la pellet deux fois avec de l&#39;eau autoclave et une fois avec 0,1 M LiAc. </li><li> Après le dernier lavage, éliminer le surnageant et ajouter les réactifs suivants au culot cellulaire: 240 ul de PEG 3500 à 50% p / v, 36 pi de 1 M de LiAc, 50 pi de 2 mg / ml de bouillie ADNsb de sperme de saumon, H 2 O 34 ul. Vortex à mélanger, ajouter 1 pg PSH-PXR et 1 pg pGADNOT-SRC-1 ADN et mélanger. </li><li> Transférer le mélange de polystyrène tube rond-bas, agiter la transformation, mélanger (220 rpm à 30 ° C) pendant 30 min. Déplacer le tube à 42 ° C bain d&#39;eau et incuber pendant 30 min supplémentaires. </li><li> Centrifuger le tube à 2000 tours par minute pendant 2 min et éliminer le surnageant. Laver culot fois à l&#39;eau autoclave. </li><li> Ajouter 100 pi d&#39;eau stérile dans le tube, remettre en suspension les cellules par le doigt doux tapant et pipetage, puis la plaque sur des plaques de -His/-Leu Dropout moyen (Formulation par litre -His/-Leu Dropout moyen: 20 g de dextrose, YNB 1,7 g, 0,67 g CSM-His/-Leu, 5 g de sulfate d&#39;ammonium, 1,5% de gélose) et incUbate à 30 ° C pendant 3-4 jours pour isoler les transformants. </li></ol> 3. X-gal Filtre Assay <ol><li> Couper une membrane de nitrocellulose à la taille d&#39;une partie de boîte de Pétri. Étiqueter la membrane de nitrocellulose pour marquer l&#39;orientation. </li><li> Placer une membrane de nitrocellulose de rupture en colonies de levure, de s&#39;assurer que la membrane est en contact avec la surface du support de plaque. </li><li> Retirer la membrane, le placer côté colonie vers le haut sur un papier filtre de 3 mm, et placer la membrane et le papier-filtre à -80 ° C pendant 15 min. </li><li> Préparer une solution X-gal. Ajouter 50 ul de 20 mg / ml de X-gal et 15 ul de β-mercaptoéthanol à 5 ml de tampon Z (1 L de tampon contient 16,1 g de Na 2 HPO 4, 7H 2 O, 5,5 g de NaH 2 PO 4 H 2 O, 0,75 g KCl, 0,25 g MgSO 4 7H 2 O •). Si Z tampon a été maintenu à 4 ° C, l&#39;amener à la température ambiante avant l&#39;addition de ces réactifs. </li><li> Placer deux cercles de papier filtre de 3 mmdans une boîte de Pétri et les faire tremper avec 5 ml de solution X-gal. Drainer l&#39;excès de tampon à partir de la boîte de Pétri et placer la membrane de nitrocellulose avec la colonie côté vers le haut. </li><li> Fermez le couvercle, s&#39;assurer que la membrane est en contact avec le papier filtre et il est complètement humide. Enveloppez la boîte de Petri dans une feuille et incuber à 37 ° C pendant 30 min à la nuit. </li></ol> 4. Liquide β-gal Assay <ol><li> Cultivez levure dans un milieu liquide -His/-Leu Dropout à DO 600 de 0,7. </li><li> Transférer 1 ml de milieu dans un tube de 1,5 ml et centrifuger à 3000 rpm pendant 2 min. Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon Z à remettre le culot, centrifuger à 3000 rpm à nouveau pendant 2 min. Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 150 ul de tampon Z avec 2ME pour remettre en suspension le culot cellulaire, mélanger puis ajouter 50 ul de chloroforme et 20 pi de 0,1% de SDS. Vigoureusement vortex l&#39;échantillon pendant 15 secondes. </li><li> Ajouter 700 ul de solution ONPG (1 mg / ml dans Z buffer). Réglez la minuterie, incuber à 30 ° C assez longtemps pour permettre à la couleur jaune de développer et de noter le temps de réaction total. </li><li> Ajouter 500 ul de 1 M de Na 2 CO 3 pour arrêter la réaction et déterminer l&#39;absorbance à 420 nm. Le flan est une solution de 700 ul d&#39;ONPG plus 500 ul de 1 M de Na 2 CO 3. </li></ol> Calculer unités Miller comme suit: Miller Unités = (A420 * 1000) / (A600 * min * ml) A420: unités d&#39;absorbance à 420 nanomètres; A600: unités d&#39;absorbance à 600 nanomètres; min: le temps de réaction en minutes; ml: le volume en ml de la réaction

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans notre analyse de Y2H modifié, nous avons identifié des résidus importants pour les interactions de kétoconazole sur PXR 6. Etant donné que SRC-1 est un co-activateur (et a été clone dans le vecteur d&#39;pGADNot), nous avons également testé si SRC-1 pouvait activer l&#39;expression de lacZ lorsque clone dans le système de vecteur PSH et si cela modifie le profil d&#39;activation et / ou affecter la perméabilité de la levure de dosage à deux hybrides. Grâce à nos plasmides redessinés nous avons effectué d...

La levure double hybride (Y2H) test est largement utilisé pour découvrir des interactions protéine-protéine et, plus récemment, à la découverte de nouvelles petites molécules qui perturbent les complexes protéine-protéine interaction 7, 8, 9, 10, 11. Cependant, les approches conventionnelles de ce test, utilisé pour la découverte de médicaments ou &quot;hits&quot;, ne permettent pas la détection de résidus d&#39;interaction allostériques de composés chimiques dans les surfaces protéine-protéine, que s&#39;il est modifié encore interagir et de permettre l&#39;interrogatoire des résidus modifiés 11 . En effet, un tel procédé (s), si possible de développer, permettrait un système de levure docile pour l&#39;évaluation à haut débit de résidus d&#39;interaction allostériques critiques pour interaction protéine-protéine perturbation. Dans le cadre de la découverte de médicaments, la façon la plus directe d&#39;établir une interaction des composés avec des protéines impliquerait détermination de la structure (par exemple la cristallisation de la protéine complexe inhibiteur). Ces méthodes sont cumbersome, utiliser les ressources élaborées et il n&#39;est pas techniquement possible de réaliser des études structurelles sur chaque protéine. Systèmes de dépistage génétique de la drogue tractables ont été établis dans des bactéries 1, 2 et d&#39;autres systèmes modèles comme mammifère double-hybride. Cependant, ces systèmes doivent optimisation et les systèmes alternatifs comme Y2H sont toujours les plus testés dans la découverte de médicaments. Il ya des limites qui comprennent une faible sensibilité et la fiabilité des interactions à l&#39;aide de méthodes singulières 13, cependant, un essai de Y2H unique peut être modifié pour répondre à des questions spécifiques concernant les résidus d&#39;interaction. Dans le domaine de la recherche sur le récepteur nucléaire, Y2H a été utilisé pour définir des protéines qui interagissent 14, cependant, ces interactions protéiques ont rarement été utilisé pour définir la nature, dans lequel les ligands / antagonistes interagissent avec des complexes récepteur-protéine nucléaire. Ainsi, notre laboratoire a concentré ses efforts sur la définition d&#39;une méthode, en particulier pour les protéines réceptrices qui ne sont pasprête facilement à des méthodes basées protéomique, ce serait déterrer nouveau ligand / antagoniste interaction résidus en utilisant un Y2H à base plate-forme de découverte inversée. Sur la base de notre conclusion précédente selon laquelle le kétoconazole perturbe PXR et son activateur SRC-1, nous avons développé un nouveau système de Y2H inverse qui nous permettent de définir interroger et résidus de kétoconazole interagir sur PXR 6. Notre procédé est basé sur les propriétés de la protéine GAL4 de levure qui se compose de domaines séparables responsables de l&#39;activation de la liaison à l&#39;ADN et la transcription. La protéine PXR LBD est exprimé comme une fusion au domaine LexA liaison à l&#39;ADN (DNA-BD), tandis que la longueur des co-activateurs pleins SRC-1 (coactivateurs de récepteur de stéroïde 1) les protéines sont exprimées sous forme de fusions au domaine d&#39;activation de GAL4 (AD ). L&#39;interaction entre PXR et SRC-1 des protéines de fusion conduit à l&#39;activation de la transcription GAL4 de sites de liaison contenant gène rapporteur Lac Z-β qui est intégré dans le génome de la levuree. Le kétoconazole, un antagoniste PXR, perturbe PXR et SRC-1 interaction 15, 16, 17 et on peut détecter l&#39;interaction de PXR et SRC-1 en présence ou en l&#39;absence de kétoconazole après coloration des colonies sur des filtres pour l&#39;activité X-gal. Le principe de Y2H est illustré sur la figure 1 et la procédure expérimentale est résumée sur la figure 2.

<table><tbody><tr><td>souche de levure CTY10-5d erg3&delta ;/erg11&delta ;</td><td>Notre</td><td>levure CTY10-5d de laboratoire a été doublement éliminée <gènes em>ERG3 et ERG11 (erg3&Delta ;/erg11&Delta ;) gènes6 .</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance YPD</td><td>BD Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Levure Azote Base (YNB) sans acides aminés et sulfate d’ammonium</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-His/-Leu Mélange complet de suppléments</td><td>MP Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophényle &bêta ;-D-galactopyranoside).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon Luria (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>Saumon sonique ADN spermatozoïde bouilli (10 mg/ml)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>Kétoconazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de lithium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50 % PEG-3350 solution, stérilisé par filtre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>Whatman</td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Boîte de Pétri</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>PXR LBD amorce avant pour pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>PXR LBD amorce inverse pour pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>SRC-1 amorce avant pour pGADNOT</td></tr><tr><td>5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>SRC-1 amorce inverse pour pGADNOT</td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>notre labo</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>notre labo</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>notre labo</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

inverser levure système à deux hybrides pour identifier les mammifères nuclear receptor résidus qui interagissent avec des ligands et / ou antagonistes

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

En tant que régulateur essentiel du métabolisme des médicaments et de l&#39;inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), joue un rôle important dans la physiopathologie de la maladie reliant le métabolisme et l&#39;inflammation (par exemple, de la stéatose hépatique) 1,2. Il a eu beaucoup de progrès dans l&#39;identification des ligands agonistes pour PXR, cependant, il ya des descriptions limitées des antagonistes de la drogue comme et leurs sites de liaison sur PXR 3,4,5. Un obstacle majeur a été l&#39;incapacité à purifier efficacement la protéine de longueur totale pour des études structurales avec des antagonistes malgré le fait que PXR a été clonée et caractérisée en 1998. Notre laboratoire a développé une nouvelle levure à haut débit à base de dosage à deux hybrides de définir un antagoniste, le kétoconazole de résidus de liaison sur PXR 6. Notre méthode consiste à créer des bibliothèques de mutation qui sauver l&#39;effet des mutations simples sur la surface AF-2 de PXR prévu pour interagir avec le kétoconazole. Sauvetage ou «gain de fonction» second mutations peuvent être effectuées de telle sorte que des conclusions en ce qui concerne l&#39;interaction génétique du kétoconazole et le résidu (s) de surface sur PXR sont réalisables. Ainsi, nous avons développé un haut débit écran de deux hybrides de levure de mutants PXR interagissant avec son coactivateur SRC-1. En utilisant cette approche, dans laquelle la levure a été modifié pour tenir compte de l&#39;étude de la drogue antifongique, le kétoconazole, nous avons pu démontrer mutations spécifiques sur PXR enrichies en clones incapables de se lier au kétoconazole. Par la logique inverse, nous concluons que les résidus d&#39;origine sont des résidus d&#39;interaction directe avec le kétoconazole. Ce test représente un roman, essai génétique docile à l&#39;écran pour les sites de liaison antagonistes sur les surfaces des récepteurs nucléaires. Cet essai peut être appliqué à n&#39;importe quel médicament, indépendamment de son potentiel cytotoxique de la levure ainsi que de la protéine cellulaire (s) qui ne peut être étudiée en utilisant la biologie structurale standard ou les méthodes à base de protéomiques. Pièges potentiels incluent l&#39;interprétation de données (méthodes complémentaires utiles), reliment sur la méthode unique de Y2H, expertise dans le traitement de levure ou d&#39;effectuer des essais levure à deux hybrides, et l&#39;optimisation des essais.

Nous avons effectué un test pour voir si nous pouvions détecter une lecture colorimétrique de l&#39;association de PXR et récepteur des stéroïdes coactivateur-1 (SRC-1). Etant donné que la levure a une production importante de stérol, il a été montré précédemment que l&#39;expression de lacZ dans la levure peut être induite sans la nécessité d&#39;un ligand exogène supplémentaire. Nous avons trouvé que l&#39;expression de lacZ (colonies bleues) est également induite dans la souche de levure transformée avec PXR et SRC-1...

Kétoconazole se lie à et antagonise Pregnane X Receptor (RPX) activation. Levure haute écrans de débit de mutants PXR définissent une région unique pour la liaison kétoconazole. Cette méthode génétique à base de levure découvre interactions avec les récepteurs nucléaires de nouveaux avec des ligands qui s&#39;associent avec les sites de liaison surface.

Inverser levure système à deux hybrides pour identifier les mammifères Nuclear Receptor résidus qui interagissent avec des ligands et / ou antagonistes

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

L'objectif général de cette procédure est de décrire un test de type levure à haut débit, basé sur le système deux-hybride, permettant de révéler les interactions entre le récepteur X des pregnanes, ou PXR, et l'inhibiteur de petite molécule kétoconazole. Cette approche consiste d'abord à construire les plasmides deux-hybrides chez la levure, l'un exprimant le domaine de liaison au ligand du PXR humain et l'autre exprimant le coactivateur du récepteur aux stéroïdes, SRC-1. En présence de kétoconazole, l'interaction entre le PXR humain et SRC-1 est perturbée, comme le montrent les tests en milieu liquide de bêta-galactosidase.En association avec un criblage colorimétrique des colonies sur un filtre, le criblage de mutants du PXR en présence de kétoconazole permet d'identifier les mutations qui rendent le récepteur insensible à l'action du médicament, permettant ainsi une expression paresseuse détectable par inspection visuelle et des résultats des essais liquides de bêta-galactosidase. Les essais SASE sont utilisés pour mettre en évidence les modifications de l'activation du PXR en présence de kétoconazole, ce qui permet d'identifier les résidus initiaux impliqués dans l'interaction. Nous avons eu cette idée pour la première fois dans le laboratoire du Dr Manny, où je suis associé.Lorsque nous avons été confrontés à des données structurées incomplètes sur PXR, les techniques biochimiques ne nous ont pas permis d'effectuer l'identification, en particulier pour des interactions de faible ampleur et difficilement modifiables. Pour la caractérisation structurale. Basé sur le principe de détection de mutants de PXR résistants au kiton, nous avons mis au point un procédé qui sera abordable, réalisable et pourra être effectué en quelques jours selon une méthode à très haut débit.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'activité pharmacologique de liaison des petites molécules aux protéines réceptrices, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme toute protéine jouant un rôle pathogène dans une maladie, en particulier celles dont les approches de biologie structurale ont des limites pour l'identification préliminaire des résidus impliqués dans la liaison, afin de mieux comprendre et concevoir des intermédiaires ciblés par de petites molécules. Commencez par amplifier le domaine de liaison des ligands du PXR humain et la séquence complète de la SRC humaine un, comme décrit dans le protocole écrit. Vérifiez les produits de PCR en les faisant migrer sur un gel d'agarose à 1 %.Ensuite, purifiez les produits de PCR à partir du gel AROS. Digestez les produits de PCR dans deux vecteurs hybrides comme décrit dans le protocole écrit et placez les échantillons de digestion dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une heure. Purifiez les échantillons digérés à partir d'un gel d'agarose à 1 %, puis ligez les produits de PCR digérés et purifiés avec les deux vecteurs hybrides avant de les transformer dans des cellules compétentes DH five alpha suivies d'une incubation nocturne à 37 degrés Celsius.Prélève les colonies et isole l'ADN plasmidique ; utilise une digestion par enzymes de restriction pour confirmer la présence du vecteur et de l'insert, puis vérifie tout ADN plasmidique positif par séquençage. Inocule la souche de levure dans cinq millilitres de YAPD et incube toute la nuit sous agitation constante à 220 tr/min et à 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, inocule la levure au ratio de un à vingt dans cinq millilitres de YAPD et incube afin d'obtenir une densité optique à 600 nanomètres de 0,2 par agitation constante.Centrifuger les cellules à 2000 tr/min dans une microcentrifugeuse pendant deux minutes et éliminer le surnageant. Laver ensuite le culot deux fois avec de l'eau stérilisée au autoclave et une fois avec de l'acétate de lithium 0,1 molaire. Après avoir éliminé le surnageant du dernier lavage, ajouter au culot cellulaire les réactifs de transformation indiqués dans le protocole écrit et mélanger au vortex.Ensuite, ajoutez les vecteurs préparés contenant PXR et contenant SRC avant le mélange. Transférez à nouveau le mélange de transformation dans un tube rond en polystyrène et agitez pendant 30 minutes. Placez le tube dans un bain-marie à 42 degrés Celsius et incubez pendant 30 minutes supplémentaires.Ensuite, centrifuger le tube à 2000 tr/min pendant deux minutes après élimination du surnageant. Laver le culot une fois avec de l'eau d'autoclave : pipeter 100 microlitres d'eau stérile dans le tube et resuspendre les cellules par de légers tapotements avec le doigt et par pipetage. Puis ensemencer les cellules sur un milieu défini dépourvu d'histidine et de leucine, et incuber à 30 degrés Celsius pendant trois à quatre jours afin d'isoler les transformants.Pour commencer le test de filtration Xga, découpez un triangle dans une membrane de nitrocellulose afin qu'il s'insère dans une portion de 10 millimètres d'une boîte de Pétri. Étiquetez la membrane de nitrocellulose pour indiquer son orientation. Placez la membrane de nitrocellulose préalablement marquée sur les colonies de levure en veillant à ce qu'elle soit en contact avec la surface du milieu de la boîte.Retirez la membrane. Placez-la, côté colonies vers le haut, sur un papier filtre de trois millimètres et mettez la membrane ainsi que le papier filtre à moins 80 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, placez deux disques de papier filtre de trois millimètres dans une boîte de Pétri et imbibez-les de cinq millilitres de solution xal.Éliminer l'excès de tampon de la boîte de Pétri et placer la membrane en nitrocellulose dans la boîte, côté colonies vers le haut. Fermer le couvercle en veillant à ce que la membrane soit en contact complet avec le papier filtre et entièrement humide. Envelopper la boîte de Pétri dans du papier d'aluminium et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à toute la nuit pour faire croître les levures, puis éliminer le milieu liquide sans histidine ni leucine jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres de 0,7.Transférez un millilitre de milieu dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifugez à 3000 tr/min pendant deux minutes. Après avoir éliminé le surnageant, ajoutez un millilitre de tampon Z au culot et centrifugez. Comme précédemment, ajoutez 150 microlitres de tampon Z contenant du captoéthanol au culot cellulaire pour le resuspendre.Ensuite, ajouter 50 microlitres de chloroforme et 20 microlitres de SDS à 0,1 % vigoureusement. Vortexer l'échantillon pendant 15 secondes. Puis ajouter 700 microlitres de solution ONPG, régler le minuteur et incuber à 30 degrés Celsius suffisamment longtemps pour permettre le développement de la couleur jaune.Une fois la couleur développée, noter le temps total de réaction. Ajouter 500 microlitres de carbonate de sodium à une molaire pour arrêter la réaction. Puis déterminer l'absorbance à 420 nanomètres.Comme étape finale, calculez les unités Miller comme décrit dans le protocole écrit. Étant donné que la levure présente une production stéroïde significative, l'expression de laxy dans la levure peut être induite sans nécessiter de ligand exogène supplémentaire. Le test d'induction xal a révélé que l'expression de laxy, visualisée par les colonies bleues, est induite dans la souche de levure transformée avec PXR et SRC un.Ce résultat est également observé dans le test liquide de la bêta-galactosidase. Toutefois, aucune induction de l'expression de *lacy* n'est détectée chez les levures transformées avec les vecteurs vides, ni avec PXR seul ni avec SRC1 seul. Le kétoconazole perturbe les interactions entre PXR et SRC1 dans la levure, puisque toutes les colonies issues du filtre de réplique étaient blanches, ce qui a également été confirmé par une activité bêta-galactosidase significativement réduite mesurée par des dosages enzymatiques en milieu liquide.Lorsque des transformations de levure ont été réalisées avec S rrc un sur le double mutant P XR, cela a révélé que les colonies exposées à la kétoconazole conservent encore l'expression de laxy. Ceci est similaire à des études antérieures menées dans ce laboratoire, qui ont montré que le même PXR peut être activé par un ligand puissant, mais qu'il est insensible aux effets antagonistes de la kétoconazole dans les tests sur des systèmes mammaliens. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser soigneusement un AC hybride et connaître les modifications nécessaires à l'étude des résidus impliqués dans la liaison de petites molécules aux protéines.Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler d'obtenir une bibliothèque très diversifiée de mutants de votre récepteur, d'atteindre une bonne efficacité de transformation pour chaque lot de 200 mutants, de développer des répliques quasi identiques du filtre en place avec ou sans médicaments, et enfin d'effectuer une inspection visuelle et chimique précise pour la détection de la nase. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes comme l'analyse de 200 acides aminés, la protéine pro-acides aminés et les modèles homologues de docking iCal peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la capacité de liaison minimale applicable aux protéines dans les cellules humaines. Et si tel est le cas, un modèle peut-il être établi pour défendre ces résidus en tant que pharmacophore ?

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