Name: Optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Découvrez la culture de neurosphères à partir d'échantillons chirurgicaux de gliome de haut grade. Cette méthode préserve les caractéristiques moléculaires des tumeurs pour des études précliniques et l'immunohistochimie 3D.

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Ce travail a été financé par le Hermelin Brain Tumor Center de l’hôpital Henry Ford.

1. Suspension unicellulaire d’un échantillon de glioblastome chirurgical frais pour la culture de la neurosphère
<ol><li>Avec le consentement écrit des patients et conformément aux directives de l’établissement, prélever des échantillons de tumeurs pour la culture cellulaire immédiatement après la chirurgie de résection du gliome de haut grade.</li>
	<li>Confirmer le diagnostic de l’échantillon de tumeur par l’histopathologie. Transporter immédiatement l’échantillon de la salle d’opération à la hotte de culture de tissu à flux laminaire, pour le traitement dans les 1 heure suivant la chirurgie. REMARQUE: Pour les chirurgies sur un site éloigné, couper l’échantillon de tumeur en fragments plus petits et placer dans un tube contenant du DMEM / F12 (garder sur la glace). La tumeur peut être traitée plusieurs heures après la chirurgie.</li>
	<li>En commençant par 200-500 mg de tissu (optimal), hachez l’échantillon de tumeur à l’aide d’une lame de scalpel et transférez-le dans un tube de 15 ml contenant 10 ml de milieu sans sérum DMEM / F12. Mélanger en inversant plusieurs fois, laisser les morceaux tumoraux sédimenter par gravité, enlever le milieu et répéter si nécessaire.</li>
	<li>Préparez la solution de dissociation tissulaire enzymatique et arrêtez la solution fraîche.<ol>
<li>Solution de dissociation tissulaire enzymatique : 5 ml 0,05 % de trypsine-EDTA, 2,5 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sans calcium et sans magnésium, 2,5 ml de solution mère de collagénase IV (2 000 U/ml dans du HBSS avec du calcium et du magnésium).</li>
		<li>Solution d’arrêt : 5 ml de solution d’inhibiteur de trypsine, 5 ml de DMEM/F12, 2 μl de 5 000 U/ml de DNAse I (fabriquée dans hbss sans calcium et sans magnésium).</li>
	</ol></li>
	<li>Retirer le milieu et ajouter la solution de dissociation tissulaire enzymatique à l’échantillon de tumeur haché, en utilisant 2 ml pour chaque tissu de 0,5 g. Mélanger doucement en inversant.</li>
	<li>Incuber le tissu en solution à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire en rotation pendant 30 min.</li>
	<li>Triturer avec une pipette de 2 ml et arrêter la digestion ou retourner à l’incubateur pour une autre incubation de 15 à 30 minutes en fonction du niveau de digestion.</li>
	<li>Arrêtez la digestion en ajoutant 2 volumes de Stop Solution et triturez mécaniquement avec une pipette sérologique de 5 ml.</li>
	<li>Filtrer le matériau non digéré à travers une passoire cellulaire de 40 μm. Granulé les cellules à 800 x g pendant 5 min à température ambiante, suivi d’un lavage 3x dans 10 ml de DMEM/F12.</li>
	<li>Ressusciter le culot cellulaire final dans 5 ml de DMEM/F12.</li>
	<li>Couchez lentement la suspension cellulaire sur 5 ml de Lympholyte-M et de granulés à 1 300 x g pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Transférer la couche d’interface contenant les cellules nucléées dans un tube de 15 ml contenant 10 ml de DMEM/F12.</li>
	<li>Granuler les cellules à 800 x g pendant 5 min à température ambiante. Répétez le lavage avec DMEM / F12 2x plus.</li>
	<li>Cryoconserver les cellules individuelles résultantes pour une utilisation ultérieure en remettant la pastille dans le milieu de congélation des cellules de récupération, en aliquote dans les cryovials, en lente et en stockant dans de l’azote liquide.</li>
	<li>Pour la culture, ressusciter les cellules dans le milieu neurosphère complété par des facteurs de croissance (NMGF), et plaque à densité relativement faible (<1 x 105 cellules/ml) dans une fiole de culture tissulaire T25 régulière dans des conditions standard, 5%co2,37 °C, incubateur de culture tissulaire humidifié(Figure 1A).<ol>
<li>Préparez NMGF en utilisant la recette suivante<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">Pour 500 ml de DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Solution mère</td>
					<td>volume</td>
					<td>concentration finale</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Supplément de N2 (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 mg/ml de solution mère de BSA</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml de réactif de gentamicine</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibiotique/antimycotique</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5 x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml de bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml d’EGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transférer les neurosphères qui se forment sur une 1 à 3 semaines (figures 1B-E) dans des flacons frais, afin de les séparer des cellules et des débris attachés. Effectuez des modifications partielles du média tous les 3-4 jours. REMARQUE: Si dissociant la tumeur orthotopic de xénogreffe utilisant le protocole ci-dessus, les étapes 1.11-1.13 peuvent être omises.</li>
</ol>2. Maintien de la culture neurosphère du glioblastome et applications en aval
<ol><li>
Dissociation: Surveiller les cultures de la neurosphère et effectuer des changements partiels du milieu tous les 3-4 jours. Lorsque la plupart des neurosphères multicellulaires dans le ballon atteignent 100 μm de diamètre, dissociez-les en une seule suspension cellulaire:<ol>
<li>Transférer le milieu contenant les neurosphères dans un tube de 15 ml, sédimenter par gravité les neurosphères pendant environ 5 min, retirer le milieu et ressusciter le culot cellulaire dans 10 ml de DPBS sans calcium et magnésium.</li>
		<li>Mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante, car les cellules sédimentent par gravité.</li>
		<li>Retirer 7-8 ml de DPBS puis dissocier mécaniquement les neurosphères avec une pipette sérologique préwetted.</li>
		<li>Granuler les cellules dissociées à 800 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging: Remettre en suspension les cellules dissociées (étape 2.1.) dans le NMGF et les diviser en nombre nécessaire de fioles (1:3), et incuber dans des conditions standard. Des neurosphères secondaires se formeront et devraient ensuite être dissociées pour la formation de sphères tertiaires.</li>
	<li>
Évaluation de l’auto-renouvellement à long terme: Répétez la procédure de dissociation jusqu’à ce que la culture neurosphère atteigne au moins 10 passages, soit l’équivalent d’un minimum de 2 mois en culture.</li>
	<li>
Congélation: Pour cryoconserver les neurosphères, dissocier les neurosphères (étape 2.1.) et remettre en suspension le culot cellulaire dans le milieu de congélation des cellules de récupération, aliquote dans les cryovials, gel lent et stockage dans de l’azote liquide.<ol>
<li>Pour faire la culture de cellules neurosphères à partir d’un stock congelé : décongeler les cellules à 37 °C et les transférer immédiatement dans un tube de 15 ml contenant 10 ml de DMEM/F12. Mélanger doucement le tube, puis faire tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Laver le culot cellulaire une fois de plus et ressusciter les cellules dans NMGF et les transférer dans une fiole de culture tissulaire T25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Suspension cellulaire pour implant intracrânien chez une souris immunodéprimée:<ol>
<li>Dissociez les neurosphères (étape 2.1.) et ressuscitez la pastille cellulaire dans le DPBS sans calcium et sans magnésium. Comptez les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’une exclusion bleue trypan.</li>
		<li>Calculer le nombre de cellules nécessaires pour l’implant, généralement 3 x 105 cellules/souris, transférer le nombre souhaité de cellules dans un flacon et granuler les cellules à 1 000 x g.</li>
		<li>Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié pour l’implant (5 μl/souris) en tapotant doucement le tube de microcentrifugation. Placez la suspension cellulaire sur de la glace et utilisez-la dans les 2 heures.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Protocole alternatif pour la culture de cellules de glioblastome tumorigène (pour les cas où la culture de la neurosphère échoue)
<ol><li>Compléter le milieu NMGF avec du sérum bovin fœtal à une concentration finale de 2% FBS/NMGF.</li>
	<li>
En commençant par les cellules en culture NMGF: Récolter des cellules viables dans la fiole NMGF(figure 1F),les ressusciter dans 2% FBS/NMGF et la plaque à une densité relativement faible (<1 x 105 cellules/ml) dans une fiole de culture tissulaire T25 régulière, et la culture dans des conditions standard, 5%CO2,37 °C, incubateur de culture tissulaire humidifié(figure 1G).</li>
	<li>
En commençant par des cellules congelées jamais cultivées (étape 1.14.) : Décongeler les cellules, laver en milieu sans sérum et en plaque à 2 % fbs/nmgf et culture comme décrit à l’étape 3.2. La culture dans NMGF pendant 3 jours avant de transférer des cellules viables à 2% FBS / NMGF est une alternative pour présélectionner les cellules différenciées.</li>
</ol>4. Analyse morphologique et moléculaire des neurosphères par immunohistochimie
<ol><li>Culturez les neurosphères jusqu’à ce que la plupart des sphéroïdes multicellulaires flottants atteignent 100 μm de diamètre.</li>
	<li>Retirer les fioles de culture de l’incubateur et granuler immédiatement les neurosphères, enlever le milieu et ajouter 10 ml de DPBS sans perturber le culot. Retirer le DPBS, ressusciter dans 10% de forcine tamponnée neutre et incuber pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Granuler les sphéroïdes, ressusciter dans de l’éthanol à 30% et incuber pendant 30-45 min.</li>
	<li>Remplacer l’éthanol à 30 % par de l’éthanol à 50 %, incuber pendant 15 min et remplacer par de l’éthanol frais à 50 %, incuber 30 min supplémentaires.</li>
	<li>Répéter (étape 4.4.) avec de l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Remplacer par de l’éthanol à 95% deux changements de 10 à 20 minutes chacun, et répéter avec de l’éthanol absolu jusqu’à ce que les sphéroïdes soient blanc vif et condensés.</li>
	<li>Faites un petit cône de papier filtre en papier de lentille et placez-le dans un petit entonnoir dans un bécher. Mouiller le papier de lentille avec de l’alcool absolu.</li>
	<li>Desserrez légèrement le culot avec de l’éthanol frais à 100%, versez l’excès d’éthanol et versez les sphéroïdes à travers le cône de papier de la lentille, en vous assurant qu’ils vont à l’extrémité du cône. Rincez le tube avec de l’éthanol absolu supplémentaire et versez tous les sphéroïdes restants à travers le cône de papier de la lentille.</li>
	<li>Retirez le cône de papier de l’entonnoir et déplacez soigneusement les sphéroïdes dans le fond du cône. Pliez le papier dans un carré et assurez-vous que les sphéroïdes sont aussi bien fermés que possible.</li>
	<li>Transférer les neurosphères emballées sur une cassette et transférer vers un processeur de tissus automatique.</li>
	<li>Programmez le processeur automatique de tissu comme suit: éthanol absolu, 10 min, xylène, 15 min (2x), paraffine, 10 min (4x).</li>
	<li>Retirez la cassette du processeur et placez-la sur la partie chauffée d’un système d’encastrement de paraffine. Assurez-vous que toute la surface est exempte de fragments, de poussière ou d’autres débris et siphonnez toute la paraffine des puits de réchauffement des pinces. Réchauffez les pinces sans paraffine et ajoutez une petite quantité de paraffine à un moule de base chauffé.</li>
	<li>Ouvrez la cassette, retirez-la et placez-la sur la partie chauffée du système d’intégration. Ouvrez soigneusement le cône de papier jusqu’à ce que les sphéroïdes soient visibles. Rassemblez autant de matériau que possible avec des pinces pré-indemnes et transférez-la dans la paraffine liquide dans le moule de base.</li>
	<li>Répétez l’opération si nécessaire pour récupérer autant d’asphéroïdes que possible. Grattez doucement le papier de soie avec une lame de rasoir propre et pré-nauséagée qui a été essuyée avec de l’éthanol pour recueillir les sphéroïdes résiduels sans entrer de papier dans le bloc.</li>
	<li>Brisez soigneusement les touffes sphéroïdes avec des pinces chaudes. Éloignez les sphéroïdes des coins dans un calque central uniforme. Déplacez le moule de base vers la zone de refroidissement pour fixer les sphéroïdes en place, ajoutez la cassette, remplissez lentement avec de la paraffine et refroidissez bien.</li>
	<li>Le bloc de paraffine de neurosphère peut être employé pour la section normale et immunohistochemistry.</li>
</ol>

<ol><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La dissociation enzymatique appropriée de cellules de tumeur est une étape critique dans ce protocole. Le tissu doit être haché bien avant l’incubation dans une solution de dissociation cellulaire à 37 °C en rotation, pendant au moins 30 min, lorsque le tissu doit être trituré mécaniquement et que l’extension de la dissociation doit être vérifiée. Selon le degré de cohésion tissulaire, l’incubation peut être prolongée de 15 à 30 minutes supplémentaires, au besoin, pour compléter la dissociation en cellules individuelles. L’incubation dans une solution de dissociation pendant plus de 1 heure n’est pas recommandée en raison d’une diminution de la viabilité cellulaire. Bien que la quantité optimale de tissu de départ soit mg 200-500, ce protocole a mené aux cultures réussies de neurosphère d’aussi peu que mg 50 de tissu de tumeur.
Nmgf sans sérum est un milieu sélectif, et un pourcentage de cellules néo-plastiques comprenant la majeure partie de la tumeur, aussi bien que les cellules de centre serveur, ne survivra pas, tandis que d’autres se fixeront à la fiole traitée de culture de tissu après placage. Il est essentiel que les neurosphères qui se formeront sur 1 à 3 semaines(figures 1B-E)soient transférées dans des flacons frais, afin de les séparer des cellules tumorales et des débris différenciés.
Les cellules GBM enzymatiquement dissociées et jamais cultivées (étape 1.10) peuvent être cryoconservées comme source de sauvegarde des cellules à la culture dans des milieux alternatifs, au cas où la culture de la neurosphère échouerait. Nous avons obtenu avec succès des cultures de neurosphère à partir de ces stocks congelés, ainsi que des cellules monocouches poussant dans 2% FBS / NMGF.
Conceptuellement, la « cellule souche cancéreuse » est un travail en cours et ce domaine émergent bénéficiera d’une clarification supplémentaire, car les implications cliniques sont considérables, en particulier dans la génération d’hétérogénéité tumorale, de plasticité et de résistance à la thérapie19,20. En plus d’être vitales pour générer des modèles animaux GBM spécifiques au patient, les cultures neurosphères sont également précieuses pour des études in vitro telles que l’altération de la signalisation cellulaire et de l’expression des gènes en réponse aux facteurs de croissance, à l’hypoxie et aux agents pharmacologiques11,21. Nous avons opté pour l’utilisation de coupes transversales de neurosphères fixes au for forine et de paraffine incorporées, en préservant l’architecture 3D, pour étudier l’expression des protéines et les modifications post-traductionnelles par immunohistochimie11, en raison de la localisation subcellulaire supérieure par rapport à la méthode plus courante de étiquetage et d’imagerie de la sphère entière.
Il a été démontré que toutes les cellules des neurosphères dérivées du cerveau de mammifères adultes ne sont pas des cellules souches22. De même, les neurosphères cultivées à partir de tumeurs GBM ne sont probablement pas clonales, en raison de la présence de cellules progénitrices cancéreuses plus différenciées et de l’auto-agrégation, connue pour se produire à des densités cellulaires élevées23, ce qui est considéré comme une limitation de cette méthode par certains. Pour favoriser l’enrichissement pour les cellules souches autorenouvatrices à long terme, par opposition aux progéniteurs qui peuvent se développer transitoirement sous forme de neurosphères22,les neurosphères primaires sont dissociées pour la formation de neurosphères secondaires, et ensuite croisées pendant un minimum de 10 passages, soit à peu près l’équivalent de 2 mois en culture continue, ce qui est une indication d’une population enrichie en cellules souches22. D’après notre expérience, les cultures de neurosphère GBM qui atteignent cette marque peuvent continuer à être étendues en tant que neurosphères indéfiniment. L’importance de catégorie de tumeur, puisque nous avons obtenu les cultures réussies des GBMs et des astrocytomas anaplastiques, la catégorie IV et III d’OMS, respectivement, mais pas des gliomas de qualité inférieure.
La méthode la plus répandue de culture de cellules de glioblastome, dans le milieu de croissance traditionnel complété par 10% FBS, conduit à une divergence génomique et phénotypique considérable par rapport aux tumeurs originales 4. D’autre part, les cultures de neurosphère sont une source stable et à long terme de cellules présentant le phénotype de cellules souchescancéreuses 4. La méthode de neurosphère est devenue de plus en plus populaire pour l’enrichissement du CSC dans les cultures à long terme pour les modèles orthotopiques de xénogreffe de souris, en dépit de ne pas être réussie pour tous les échantillons de haut grade d’astrocytoma, qui représente la faiblesse principale de cette méthode. Des études visant à comprendre comment les caractéristiques moléculaires des tumeurs parentales peuvent affecter la formation de la neurosphère sont en cours. L’exploration de méthodes alternatives pratiques à la culture de gliomes de haut grade, suivie d’une validation approfondie, est accordée, étant donné les avantages considérables d’avoir des modèles gbm spécifiques au patient, alors que nous avançons dans une ère de médecine personnalisée, alimentée par l’accessibilité de l’information « omique » et le nombre accru de thérapies ciblées potentielles.

Le glioblastome (GBM), un astrocytome de grade IV de l’OMS, est la tumeur cérébrale primaire la plus répandue et la plus agressive. Divers phénotypes développementaux sont adoptés par les cellules tumorales GBM, y compris les cellules présentant des caractéristiques de « cellules souches cancéreuses » (CSC), telles que l’expression des marqueurs de cellules souches neurales (NSC), l’auto-renouvellement à long terme et le potentiel de donner naissance à des cellules plus différenciées exprimant des marqueurs astrocytaires et formant la majeure partie de la tumeur1-3. Bien que des éclaircissements soient encore nécessaires concernant l’identité moléculaire et les implications cliniques du CSC, le présent travail est axé sur la définition opérationnelle du CSC : l’auto-renouvellement à long terme in vitro et la capacité de différencier et de reproduire la tumeur originale lors de l’implantation orthotopique chez les rongeurs immunodéprimés.
Les cellules de glioblastome ont été cultivées pendant des décennies dans un milieu traditionnel contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et plusieurs lignées cellulaires gbm cultivées en sérum à passage élevé disponibles dans le commerce sont tumorigènes chez les rongeurs immunodéprimés, mais il existe une divergence génomique et moléculaire considérable par rapport à la tumeur originale4,limitant leur utilisation en tant que modèles cliniquement pertinents. Plus récemment, des cellules dont le phénotype souche/progéniteur répondait à l’EGF et au bFGF ont été identifiées dans des GBM2. Par la suite, des échantillons dissociés de tumeur GBM ont été cultivés dans un milieu sans sérum3,formulé à l’origine pour la sélection et l’expansion des cellules souches neurales du cerveau des mammifères adultes5. Ces conditions de culture entravent la croissance de la plupart des populations de cellules tumorales non néoplasiques et plus différenciées, tout en favorisant la croissance des cellules souches et progénitrices sous forme de sphéroïdes multicellulaires flottants, ou neurosphères3,imitant le comportement des cellules souches neurales de mammifères adultes5. La comparaison côte à côte complète des cellules primaires de GBM cultivées dans le milieu de neurosphère complété avec des facteurs de croissance (NMGF) ou dans le milieu de croissance traditionnel complété avec 10% FBS, a indiqué que les neurosphères de GBM étaient tumorigènes, a présenté le potentiel de différenciation de multilineage, et a préservé le génotype de la tumeur originale, contrairement aux cultures de 10% de FBS qui n’étaient pas tumorigènes aux bas passages et considérablement divergé des tumeurs originales aux passages tardifs4.
L’isolement du CSC des tumeurs dissociées de GBM par tri cellulaire basé sur l’expression du marqueur csc putatif CD133 a également été proposé6,7,mais d’autres travaux ont indiqué que le phénotype csc n’est pas définitivement associé à l’expression de tels marqueurs8-10,diminuant l’enthousiasme initial pour cette stratégie, tandis que de nouveaux marqueurs sont encore en cours de test10. L’indisponibilité à ce jour d’un ensemble validé de marqueurs définissant le CSC, ainsi que l’objectif d’amplification à grande échelle de ces cellules pour les études précliniques, rend l’utilisation du tri cellulaire peu pratique pour les cultures de routine enrichies de CSC. Les cellules GBM sélectionnées par la capacité de se développer sous forme de neurosphères dans NMGF expriment invariablement des marqueurs de cellules souches neurales. Nous avons observé que Sox2 et la nestine sont omniprésentes dans les cultures de la neurosphère, tandis que la protéine CD133 est présente dans un sous-ensemble des neurosphères GBM (données inédites et référence11).
Plusieurs laboratoires poursuivent des cultures de neurosphère à partir de tumeurs de glioblastome en utilisant la même approche générale de dissociation enzymatique et de culture dans un milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance3,4,11-14,tandis que d’autres collègues ont signalé des tentatives de culture de neurosphère à long terme à partir d’échantillons de GBM sans succès. La méthode générale pour la dissociation enzymatique et la culture de neurosphère des gliomes de haut grade présentée ici est semblable à ce qui a été décrit dans les publications ci-dessus. Nous avons optimisé le protocole en fonction de notre expérience de dissociation et de culture de plus de 100 échantillons GBM. L’efficacité de l’obtention de cultures neurosphères à long terme à partir d’échantillons frais de GBM appliquant le protocole présenté ici est supérieure à 40%, similaire aux quelques rapports montrant des données d’efficacité3,15,conduisant à l’exploration de protocoles alternatifs tels que la culture de cellules continuellement ou par intermittence en milieu sans sérum en présence d’EGF et de bFGF en tant que monocouches sur des surfaces recouvertes de protéine ECM16,17. Les cultures de neurosphère sont toujours l’approche la plus validée et de plus en plus populaire pour préserver les caractéristiques moléculaires des tumeurs GBM et le potentiel tumorigène3,4,11-14,donc notre approche est de tenter d’abord des cultures de neurosphères, tout en testant simultanément des méthodes alternatives pour la culture des cellules GBM qui ne parviennent pas à former des neurosphères autorenouvatrices à long terme ( Figure1), pour augmenter la représentation des tumeurs GBM qui peuvent être utilisées dans des modèles animaux. Nous présentons ici un protocole pour la culture des neurosphères des GBM. Pour les cellules qui ne parviennent pas à former des neurosphères, nous montrons une modification simple dans le milieu de croissance, comme la première tentative de culture de cellules tumorigènes à partir de SGB nonneurosphere formant, avec des résultats prometteurs et subissant encore une validation approfondie.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine - EDTA 0.05 %</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée, sans calcium ni magnésium</td><td>Life Technologies</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solution saline équilibrée, avec du calcium et du magnésium</td><td>Life Technologies</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type 4</td><td>Worthington</td><td>5004188</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine</td><td>Sigma</td><td>T7659</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Supplément N2 (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin, qualité de culture cellulaire</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Solution de réactif de gentamicine</td> Life <td>Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique/Antimycosique</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>EGF humain recombinant</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte-Mouse</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL5031</td><td></td></tr><tr><td>Congélation de la culture cellulaire de récupération Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules stériles, 40 &mu ; m</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039 ; s Saline tamponnée au phosphate (DPBS), sans calcium et sans magnésium</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Coloration au bleu de trypan, 0,4 %</td> Life <td>Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Protocole</td> de<td>formol tamponné neutre</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes de tissus Histoplex</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-146-426</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur</td><td>Miltenyi BioTec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp ; Supplément</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Supplément neuronal Stem Pro&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie</td><td>A1058-01</td><td></td></tr></tbody></table>

optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3d

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Les glioblastomes, la forme la plus commune et la plus agressive d’astrocytoma, sont réfractaires à la thérapie, et moléculairement hétérogènes. La capacité d’établir des cultures cellulaires qui préservent le profil génomique des tumeurs parentales, pour une utilisation dans des modèles in vitro et in vivo spécifiques aux patients, a le potentiel de révolutionner le développement préclinique de nouveaux traitements pour le glioblastome adaptés aux caractéristiques moléculaires de chaque tumeur.
En commençant par des tumeurs fraîches d’astrocytome de haut grade dissociées en cellules simples, nous utilisons l’analyse de neurosphère comme méthode d’enrichissement pour les cellules présentant le phénotype de cellule souche cancéreuse, y compris l’expression des marqueurs neuronaux de cellules souches, l’auto-renouvellement à long terme in vitro,et la capacité de former des tumeurs orthotopiques de xénogreffe. Cette méthode a déjà été proposée et est maintenant utilisée par plusieurs chercheurs. Basé sur notre expérience de dissocier et de cultiver 125 spécimens de glioblastoma, nous sommes arrivés au protocole détaillé que nous présentons ici, approprié pour la culture courante de neurosphère des astrocytomas à haute teneur et l’expansion à grande échelle des cellules tumorigènes pour des études précliniques. Nous rendons compte de l’efficacité des cultures à long terme réussies utilisant ce protocole et proposons des alternatives abordables pour la culture des cellules dissociées de glioblastoma qui ne se développent pas comme neurosphères. Nous décrivons également en détail un protocole pour préserver l’architecture 3D des neurosphères pour immunohistochemistry. Les cultures cellulaires enrichies en CSC, capables de générer des modèles de xénogreffe orthotopique qui préservent les signatures moléculaires et l’hétérogénéité des GBM, deviennent de plus en plus populaires pour l’étude de la biologie des GBM et pour l’amélioration de la conception des tests précliniques des thérapies potentielles.

Nous avons appliqué le protocole décrit ci-dessus pour dissocier et faire la culture de 125 échantillons frais de glioblastome chirurgical(figure 1),de 88 tumeurs nouvellement diagnostiquées et de 37 tumeurs récurrentes(tableau 2),avec le consentement approuvé du patient et selon les lignes directrices de l’établissement. L’efficacité du protocole pour établir des cultures de neurosphère à long terme était de 41,6%, et similaire pour les tumeurs nouvellement diagnostiquées et les tumeurs récurrentes(tableau 2). Pour certains échantillons de GBM, des neurosphères se forment dans les premiers jours(figures 1B et 1C),tandis que pour d’autres, un temps de culture plus long est nécessaire(figures 1D et 1E).
L’efficacité de la formation de la neurosphère ne dépendait pas exclusivement du niveau de nécrose dans le tissu, comme en témoignent les résultats d’une tumeur nouvellement diagnostiquée à haute densité cellulaire (GBM1) et d’une tumeur récurrente et nécrotique (GBM2) traitée selon les protocoles 1 et 2, les deux produisant des cultures de neurosphère(figure 2).
Tester le potentiel tumorigène de chaque culture neurosphère chez des souris immunodéprimées est la validation cruciale de cette approche pour l’enrichissement des CSC. En utilisant un protocole similaire à celui décrit précédemment18,les neurosphères GBM1 et GBM2 ont été implantées dans le cerveau de souris immunodéprimées, conformément aux lignes directrices en matière de soins aux animaux de l’IACUC et de l’IACUC. Les tumeurs de xénogreffe présentent des caractéristiques morphologiques des GBM, telles que l’invasion dans le parenchyme cérébral et la nécrose (Figure 2).
Gbm3 a été dissocié(Figure 1A)et cultivé dans un milieu neurosphère(figures 1D et 1E),et dans 2% FBS/NMGF(Figures 1D, 1G et 1H). Les cellules monocouches cultivées dans 2% fbs/nmgf et les cellules neurosphère cultivées dans NMGF ont été dissociées et le même nombre de cellules ont été implantées chez la souris nue, en utilisant la même procédure que sur la figure 2. Aucune différence dans la survie, la dynamique de croissance tumorale ou la morphologie n’a été observée entre les deux méthodes de culture préimplantes(figures 3A-C). Les caractéristiques de croissance de tumeur ne changent pas jusqu’au dernier passage examiné, P20 pour des neurosphères, et P10 pour 2% FBS/NMGF. Alors que les marqueurs de cellules souches neurales, y compris Sox2, sont régulés à la baisse dans la plupart des cellules GBM primaires cultivées dans 10% FBS 3,4,11,NMGF complété par 2% FBS permet la rétention de l’expression Sox2 (Figure 3D).
Les neurosphères ont été traitées conformément au Protocole 4, et étiquetées avec H&E(figure 4A),anticorps anti-Sox2, montrant la localisation nucléaire(figure 4B),et anticorps EGFR, localisation de la membrane cellulaire(figure 4C). Ce protocole a été appliqué pour accéder aux altérations stimuli-dépendantes de l’expression du nestin, du GFAP, et du marqueur de prolifération Ki6711.
Tableau 2. Efficacité de la dérivation de cultures neurosphères auto-renouvelées à long terme à partir de GBM.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Pathologie</td>
			<td>N</td>
			<td>Pourcentage d’échantillons produisant des neurosphères auto-renouvelées à long terme (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastome - non traité, première chirurgie</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastome - récidive</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Figure 1. Culture cellulaire à partir d’échantillons chirurgicaux de glioblastome frais. Les tumeurs fraîches sont enzymatiquement dissociées en cellules simples. L’interface cellulaire nucléée à partir du milieu de séparation de densité est ensuite plaquée en NMGF. Les neurosphères dissociées sont plaquées en NMGF, et généralement 1 jour après le placage, il y a des cellules mortes, des débris, des cellules individuelles attachées et des cellules de division occasionnelles en suspension(A). La formation de la neurosphère est plus rapide dans certains cas(B,C),et plus lente pour d’autres(D,E). Toutes les neurosphères sont dissociées et replaquées pendant au moins 10 passages, 41,6% des GBM produisent des neurosphères auto-renouvelées à long terme. Les cellules dissociées de GBM viables qui ne parviennent pas à se développer sous forme de neurosphères(F)peuvent être transférées vers des conditions de culture alternatives, par exemple 2% FBS / NMGF (G, H). Bar(A),100 μm, s’applique à toutes les images. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Figure 2. Génération de Neurosphere et xénogreffes orthotopic de souris des tumeurs de GBM. Un échantillon de tumeur présentant la densité élevée de cellules (GBM1) et une tumeur avec le contenu nécrotique élevé (GBM2) ont été dissociés et neurospheres cultivés pour 10 passages selon les protocoles 1 et 2. Des souris immunodéprimées ont été implantées avec 3 x 105 cellules de neurosphère dissociées et sacrifiées lorsqu’elles étaient moribondes. Des cerveaux de souris ont été forcéine fixes et paraffine incorporés pour la souillure de H&E et la détection immunohistochemistry des marqueurs humains, des mitochondries humaines (hMit) ou de la sous-unité principale HLA-A de la classe I d’histocompatibilité (MHC-I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Figure 3. Croissance tumorale similaire chez les souris implantées intracrâniennement avec des cellules GBM3 cultivées sous forme de neurosphères dans NMGF ou sous forme de monocouches dans 2% FBS / NMGF. (A) Les courbes de survie de Kaplan-Meier pour GBM3 cultivé sous forme de neurosphères dans NMGF ou de monocouches dans 2% FBS/NMGF (passage <10) ne montrent aucune différence de survie (n= 10, p = 0,7174, test log-rank). (B) La croissance tumorale surveillée par imagerie par bioluminescence vivante (BLI) ne montre aucune différence significative dans la dynamique de croissance tumorale entre les deux groupes. (C) La morphologie tumorale est indiscernable pour 4 xénogreffes GBM3, 2 cultivées en NMGF et 2 cultivées dans 2% FBS/NMGF. Coloration du CMH-I décrite sur la figure 2. Écaille, 600 μm. (D) Western blot montrant l’expression Sox2 du fabricant de cellules souches conservée dans les cultures FBS/NMGF à 2% utilisées pour initier les tumeurs de xénogreffe(A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Figure 4. Analyse de l’expression des protéines dans les sections de la neurosphère par immunohistochimie. Des cultures de neurosphère ont été formaline-fixes et paraffine incorporées comme décrit dans la procédure 4, et souillées avec H&E(A),anticorps anti-Sox2(B),et anticorps anti-EGFR(C). Le substrat DAB a été utilisé pour visualiser(B,C). Bar, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>

Protocole pour la propagation des spécimens chirurgicaux à haute teneur dissociés de gliome dans le milieu sans sérum de neurosphère pour sélectionner pour des cellules avec le phénotype de cellules souches cancéreuses. Pour les spécimens qui ne se développent pas en tant que neurosphères, un protocole alternatif est suggéré. Une technique de incorporation de paraffine pour maintenir l’architecture 3D de neurosphère pour immunocytochemistry est décrite.

Optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3D

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

L'objectif général de cette procédure est de mettre au point une culture de neurosphères à partir d'astrocytomes de haut grade et d'obtenir une expansion à grande échelle de cellules tumorigènes pour des études précliniques. Cela est réalisé en dissocinant d'abord rapidement des prélèvements tumoraux frais et en séparant les cellules individuelles des globules rouges et des débris. Dans une deuxième étape, les cellules tumorales sont cultivées dans un milieu de neurosphères enrichi de facteurs de croissance jusqu'à l'observation de neurosphères.Les neurosphères peuvent être cultivées pour des expériences in vivo et une caractérisation moléculaire, ou bien fixées et incluses dans la paraffine pour une caractérisation immunologique. En fin de compte, on peut évaluer l'auto-renouvellement à long terme, la formation tumorale orthotopique et le profilage moléculaire des cultures de neurosphères. Le principal avantage par rapport aux méthodes existantes, telles que les cultures longues en sérum à 10 % FBS, est que cette technique préserve les caractéristiques moléculaires et génétiques de la tumeur d'origine.Cette méthode permet la création d'une banque de tumeurs vivantes destinée à la génération de cultures cellulaires de glioblastome spécifiques aux patients et de modèles animaux pour des recherches cliniquement pertinentes. Les implications de ce modèle pour les tests thérapeutiques chez les patients atteints de gliome malin sont évidentes. Le modèle représente au plus près la tumeur primitive et permet la réalisation de tests thérapeutiques dans un environnement préclinique.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les gliomes de haut grade, elle peut également être appliquée à d'autres tumeurs humaines et animales. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car elle exige des techniques stériles rigoureuses, des précautions particulières et plusieurs étapes afin de favoriser la viabilité cellulaire à long terme. Nous avons eu l'idée de la méthode d'histologie 3D en raison de la meilleure localisation subcellulaire des protéines marquées et des coupes, par rapport aux méthodes plus courantes d'étiquetage et d'imagerie des neurosphères entières ou de dissociation des cellules.La démonstration visuelle de cette méthode d'histologie est essentielle, car les étapes de fixation, de clarification, de traitement et d'incorporation sont difficiles à maîtriser. Il est nécessaire de faire preuve de soin afin de garantir que toutes les neurosphères soient correctement exposées aux réactifs et traitées de manière uniforme, afin d'obtenir le meilleur culot possible pour l'analyse morphologique et l'immunohistochimie. À partir de 200 à 500 milligrammes d'échantillon tumoral, utilisez une lame de scalpel pour hacher finement le tissu.Transférez les morceaux dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu, puis retournez plusieurs fois la suspension pour mélanger la solution tissulaire. Laissez les morceaux de tumeur sédimenter par gravité, puis retirez le milieu. Poursuivez le lavage des débris provenant des morceaux de tumeur jusqu’à ce que le milieu ne soit plus trouble.Ensuite, retirez le milieu. Ajoutez deux millilitres de solution enzymatique de dissociation tissulaire par 0,5 gramme d'échantillon tumoral mixte et mélangez délicatement la solution par retournement. Incubez la solution tissulaire à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire sous agitation tournante.Après 30 minutes, trier la suspension à l’aide d’une pipette de deux millilitres. Lorsque la tumeur est digérée en une suspension majoritairement monocellulaire, arrêter les enzymes avec deux volumes de solution d’arrêt et mélanger la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres. Filtrer ensuite tout matériau non digéré à travers un tamis cellulaire de 40 micromètres et centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 800 ×g et à température ambiante.Ensuite, après trois lavages dans 10 millilitres de milieu, resuspendez le culot cellulaire final dans cinq millilitres de milieu. Superposez lentement cette suspension cellulaire sur cinq millilitres de lympho light M, puis séparez les populations cellulaires pendant 20 minutes à 1300 ×g et à température ambiante. Prélève maintenant la couche d'interface contenant les cellules nucléées dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu.Ensuite, resuspendez les cellules dans un milieu pour sphéroïdes neuronaux enrichi avec des facteurs de croissance, et semez-les à une concentration inférieure à 1 × 10⁵ cellules par millilitre. Dans un flacon de culture tissulaire T25 irrégulier, à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone, dans un incubateur de culture tissulaire humidifié.Transférez les neurosphères flottantes qui se forment au bout d'une à trois semaines dans un nouveau flacon afin de les séparer des cellules adhérentes et des débris. Pour analyser les neurosphères par immunohistochimie, commencez par former un culot de neurosphères, en prenant soin de ne pas perturber le culot. Éliminez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de DPBS dans le tube.Ensuite, retirez le DPBS, resuspendez le culot dans du formol tamponné neutre à 10 % et incubez les cellules pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir à nouveau centrifugé les stéroïdes, resuspendez-les dans une série d'incubations à l'éthanol. Après la deuxième incubation à l'éthanol à 95 %, resuspendez les PHE dans de l'éthanol absolu jusqu'à ce que les cellules deviennent brillantes, blanches et condensées.Ensuite, façonnez un petit cône avec du papier filtre. Placez-le dans une petite éprouvette graduée posée sur un bécher et humidifiez le papier filtre avec de l'alcool absolu. Desserrez légèrement le culot avec de l'éthanol à 100 % frais, puis versez délicatement l'excès d'alcool.Versez les sphères à travers le cône en papier filtre, en veillant à ce qu'elles atteignent la pointe, puis rincez le tube avec de l'éthanol absolu supplémentaire. Versez tout stéroïde restant à travers le cône en papier filtre, puis retirez le cône du funneau. Rabattez ensuite le papier filtre en un carré, en enfermant aussi solidement que possible les stéroïdes, et transférez le paquet de neurosphères dans une cassette.Maintenant, placez la cassette dans un appareil automatique de traitement des tissus et faites fonctionner l'appareil. Ensuite, retirez la cassette et placez-la sur la partie chauffée d'un système d'inclusion en paraffine. Après avoir vérifié que la surface est exempte de fragments, de poussière ou d'autres débris, aspirez toute la paraffine des pinces dans les puits de réchauffage.Ensuite, réchauffez une paire de pinces propres et sans paraffine, puis ajoutez une petite quantité de paraffine sur un moule de base préalablement chauffé. Retirez maintenant le paquet de la cassette et placez-le sur la partie chauffée du système d'inclusion. Ouvrez soigneusement le papier jusqu'à ce que les sphères soient visibles.Utilisez la pince préchauffée pour ramasser autant de matériau que possible, puis transférez les sphéroïdes dans le paraffine liquide du moule de base. Décomposez soigneusement tous les agrégats et déplacez le stéroïde loin des coins afin de former une couche centrale uniforme. Déplacez le moule de base vers la zone de refroidissement pour fixer le stéroïde en place.Enfin, ajoutez la cassette et remplissez-la lentement avec du paraffine. Une fois que la cassette a complètement refroidi, le bloc de paraffine contenant les neurosphères peut être coupé en sections pour l'immunohistochimie, comme décrit dans le tableau. Le rendement de ce protocole pour établir des cultures de neurosphères à long terme à partir de 88 tumeurs nouvellement diagnostiquées et de 37 tumeurs récidivantes, soit un total de 125 tumeurs, était de 41,6 %, similaire pour les tumeurs nouvellement diagnostiquées et les tumeurs récidivantes.Pour certains échantillons de glioblastome, des neurosphères se sont formées au cours des premiers jours, tandis que d'autres ont nécessité un temps de culture plus long. L'efficacité de la formation des neurosphères ne dépendait pas exclusivement du degré de nécrose dans le tissu, comme le montrent les résultats obtenus à partir d'une tumeur nouvellement diagnostiquée, présentant une forte densité cellulaire, et d'une tumeur récidivante et nécrotique, toutes deux traitées comme vient de l'être et ayant produit des neurosphères permettant de tester le potentiel tumorigène de chaque neurosphère. La culture chez des souris immunodéficientes constitue une validation essentielle de cette approche pour l'enrichissement des cellules souches cancéreuses.Dans cette expérience, deux cultures différentes de neurosphères de glioblastome ont été implantées dans le cerveau de souris immunodéprimées. Les tumeurs xénogreffées présentaient des caractéristiques morphologiques de glioblastomes, telles que l'invasion du parenchyme cérébral et la nécrose. Dans cette expérience, les cellules qui n'avaient pas formé de neurosphères ont été cultivées dans un milieu pour neurosphères supplémenté avec 2 % de FBS, afin d'évaluer la formation tumorale de ces cellules en milieu alternatif.Par rapport au glioblastome, les cultures de neurosphères greffées chez des souris nues ont été évaluées. Aucune différence de survie, de dynamique de croissance tumorale ou de morphologie n’a été observée entre les deux méthodes de culture préalables à la greffe.Alors que les marqueurs des cellules souches neuronales, notamment SOX2, sont régulés à la baisse dans la majorité des cellules de glioblastome primaire cultivées en présence de 10 % de FBS, les cellules de glioblastome cultivées en milieu de type neurosphères complémenté de 2 % de FBS conservent l'expression de SOX2 après le traitement tel que vient d'être démontré. Dans cette expérience, les neurosphères ont été marquées par un anticorps anti-SOX2 afin de démontrer la localisation nucléaire, et par un anticorps anti-facteur de croissance épidermique afin d'illustrer la localisation membranaire. Comme les images obtenues le montrent, la méthode démontrée optimise l'analyse de l'expression protéique et des modifications post-traductionnelles tout en préservant l'architecture tridimensionnelle des neurosphères. Une fois maîtrisée, cette technique de dissociation tissulaire peut être réalisée en environ deux heures si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que l'intervalle de temps entre la chirurgie et la dissociation, ainsi que la composition moléculaire hétérogène des gliomes de haut grade, peuvent influencer les résultats après cette procédure.D'autres méthodes, comme l'implantation intracrânienne, peuvent être réalisées afin de recréer la tumeur d'origine dans des modèles animaux. Cette technique révolutionne la neuro-oncologie en permettant des tests précliniques dans un environnement cliniquement pertinent. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment développer et maintenir des neurosphères à long terme, ainsi que comment produire des neurosphères formolées et incluses dans la paraffine pour des analyses moléculaires.N'oubliez pas que le travail avec des tissus humains peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que la protection individuelle, ainsi que l'utilisation d'agents compatibles et potentiellement dangereux, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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