Name: Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque de développer un modèle de souris de cancer du sein métastases cérébrales Suivi par IRM longitudinale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-06T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez comment établir un modèle de métastases cérébrales du cancer du sein chez la souris par injection intracardiaque guidée par échographie. Le suivi longitudinal par IRM haute résolution permet de surveiller la progression tumorale de manière non invasive.

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Nous sommes reconnaissants à MM. Diane Palmieri et Patricia Steeg de NCI pour nous fournir des cellules MDA-MB231Br. Nous remercions le Dr Ralph Mason, M. Jason Reneau et Mme Ramona Lopes pour le support technique et collégiale. Ce travail a été financé en partie par l&#39;IDEA DOD Prix W81XWH-08-1-0583 et W81XWH-12-1-0317. Expériences d&#39;IRM ont été réalisées dans le Centre d&#39;imagerie de recherche avancée, une installation NIH BTRP # P41-RR02584, et l&#39;injection intracardiaque guidée par échographie a été réalisée avec VisualSonics Vevo 770 sous 1S10RR02564801.

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université du Texas Southwestern Centre médical. Une. Préparation des cellules MDA-MB231/Br-GFP <ol><li> Récupérer et culture des cellules MDA-MB231/Br-GFP (aimablement fournies par les Drs. Palmieri et Steeg, NCI) dans du milieu DMEM contenant 10% de FBS, 1% de glutamine et 1% de pénicilline / streptomycine. </li><li> Observer l&#39;état des cellules et la couleur du support, et de le remplacer milieu tous les 2-3 jours. </li><li> Trypsiniser et recueillir les cellules lorsque 80% de confluence est atteinte, comme indiqué dans les étapes 1.3.1-1.3.5: <ol><li> Retirer l&#39;ancien milieu complètement et ajouter 5 ml de PBS (1x) pour laver en douceur les cellules. Retirez le PBS dans le plat. </li><li> Ajouter 1,5 ml de trypsine dans le plat, incliner le plat doucement pour assurer toutes les cellules sont couverts par la trypsine. Mettre le plat de nouveau à l&#39;incubateur de cellules et le maintenir à 37 ° C pendant 1 min. </li><li> Sortez le plat du incubateur et observerles cellules sous le microscope optique pour s&#39;assurer que les cellules se détachent de l&#39;antenne. </li><li> Ajouter 3 ml de milieu pour arrêter l&#39;effet de la trypsine. Recueillir le mélange de cellules dans un tube de centrifugation. Centrifuger le mélange à 2000 tpm pendant 5 min. </li><li> Retirer soigneusement le milieu et remettre en suspension les cellules dans un milieu exempt de 5 ml de sérum jusqu&#39;à homogénéité. </li></ol></li><li> Compter le nombre approprié de cellules et remettre en suspension dans du milieu DMEM sans sérum avec une concentration finale de 1,75 x 10 5 cellules dans un volume de 100 ul. <ol><li> Prenez mélange de cellules pi 50 et ajouter 50 ul bleu Trypan. Après le mélange, prendre 10 mélange de pi et soigneusement ajouter à la diapositive de comptage de cellules. Utilisez plusieurs tests afin de s&#39;assurer précise le nombre de cellules estimation. </li><li> Coller à la lame de comptage des cellules, une extrémité à la fois et le compteur de cellules commence à compter automatiquement. Prendre la moyenne de tous les résultats de comptage et calculer le nombre total de cellules. </li><li> Centrifuger les cellules et remettre en suspension à nouveau dans lesle volume approprié de milieu sans sérum pour aboutir à la concentration finale de 1,75 x 10 5 cellules/100 ul volume. </li></ol></li><li> La place des cellules sur la glace avant injection intracardiaque. </li></ol> 2. Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque <ol><li> Utilisez la souris nu féminin (BALB / c nu / nu) entre 6-8 semaines. </li><li> Connectez-vous au système d&#39;imagerie. Initialiser le transducteur 704 (40 MHz). </li><li> Lancer une nouvelle étude et remplir les informations. </li><li> Anesthésier (3% isoflurane/100% O 2 dans une chambre d&#39;induction) et de maintenir les animaux avec de l&#39;isoflurane (2%) à 100% de O 2 (1 dm 3 / min) pendant l&#39;ensemble de la procédure par l&#39;intermédiaire d&#39;un cône de nez. L&#39;anesthésie est confirmé en l&#39;absence de réflexe de retrait est observé avec pincement de l&#39;orteil. </li><li> Régler la température de la table de formation d&#39;image à 37 ° C. Collez la souris anesthésiée à la table d&#39;imagerie chauffée en position couchée. </li><li> Gardez le gel à ultrasons à 37 ° C avant l&#39;imvieillissement. Appliquer le gel sur la poitrine de la souris. </li><li> Montez la sonde dans le support. Abaissez le transducteur jusqu&#39;à la profondeur d&#39;imagerie désirée est atteinte. Déplacez la scène jusqu&#39;à ce que le ventricule gauche est identifié avec l&#39;aorte ascendante comme le point de repère (figure 1A). Verrouiller le stade où une vision claire de ventricule gauche est visualisée. </li><li> Tracer 100 ul de mélange de cellules dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 22 G. Placer et fixer la seringue sur le montage de seringue. </li><li> Déplacez la seringue vers l&#39;avant vers la poitrine de la souris et déplacer avec précaution côté à l&#39;autre jusqu&#39;à ce que la pointe de l&#39;aiguille est dans le champ de vision d&#39;imagerie (avant d&#39;entrer dans la souris). </li><li> Réglez la hauteur de l&#39;aiguille et de l&#39;angle de viser vers le bas le ventricule gauche. </li><li> Pénétrer l&#39;aiguille de la seringue dans l&#39;espace intercostale rapidement à travers les couches de la peau et des muscles dans le ventricule gauche, sous la direction de l&#39;imagerie par ultrasons. Une indication de l&#39;insertion réussie de l&#39;aiguille dans le ventricule gauchecle est le reflux de sang artériel frais (de couleur rose à la différence de sang veineux rouge sombre) dans la seringue, </li><li> Injecter le mélange de cellules lentement (figure 1B). </li><li> À la fin, retirer l&#39;aiguille, soulever le transducteur, nettoyer le gel à ultrasons avec de la gaze humide et enlever le ruban. </li><li> Préparer une cage propre avec un tampon préchauffé. </li><li> Placez l&#39;animal sur le pavé et observer l&#39;animal jusqu&#39;à guérison complète. </li><li> Surveiller le comportement de l&#39;animal toutes les 24 heures pendant deux jours. </li><li> Conditions générales et les signes neurologiques de complications chez les souris expérimentales sont régulièrement contrôlés. </li></ol> 3. Surveillance IRM de la tumeur intracrânienne développement <ol><li> Utilisez un aimant Tesla 9.4 pour suivre le développement intracrânienne des métastases cérébrales. </li><li> Initier IRM deux semaines après implantation de la tumeur et répéter une fois par semaine pendant trois semaines. </li><li> Endormir les animaux avec 3% d&#39;isoflurane et de les maintenir sous gèneanesthésie ral (1,5% de l&#39;isoflurane). </li><li> Surveiller et maintenir la température du corps de l&#39;animal et de la respiration constante tout au long de l&#39;expérience. </li><li> Résolution multislice élevé (14 tranches avec 1 mm d&#39;épaisseur, pas d&#39;écart) T 1 - et T 2 pondéré images coronales, couvrant la région du lobe frontal à la fosse postérieure, sont acquises avec les paramètres suivants: T images 1-pondérés: écho de spin tranche multiple (SEMS), TR / TE = 400 ms msec/20, matrice: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, en résolution du plan: 78 x 78 um 2. T images 2-pondérés: écho de spin rapide tranche multiple (FSEMS) des séquences, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 trains d&#39;écho, matrice: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, en résolution du plan: 78 x 78 um 28,9. lésions tumorales semblent plus lumineux que les tissus cérébraux normaux sur des T-images 2-pondérés. </li><li> taille de la tumeur est déterminée sur T images 2-pondérés en décrivant manuellement le enhanpartie de la masse cement sur ​​chaque image à l&#39;aide de programmes MATLAB écrites par nous 8. Compte tenu de la majeure partie de la tumeur diamètres sont plus petits que l&#39;épaisseur des tranches (1 mm), la taille de la tumeur est présenté comme dans la zone de plan plutôt que le volume. </li></ol> 4. H &amp; E coloration Confirmant les métastases <ol><li> Sacrifier les souris immédiatement après le dernier MR scanner, disséquer les cerveaux porteurs de tumeurs et l&#39;intégrer dans un milieu PTOM et figé dans -80 ° C. </li><li> Section d&#39;une série de 10 um d&#39;épaisseur cerveau coronale spécimens avec cryostat. </li><li> Effectuer coloration H &amp; E de sections de cerveau. </li></ol>

<ol><li>Schouten, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+brain+metastases+in+a+cohort+of+patients+with+carcinoma+of+the+breast%2C+colon%2C+kidney%2C+and+lung+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma.</a> Cancer. 94, 2698-2705 (2002).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans la présente étude, nous avons démontré que l&#39;injection ventriculaire gauche imagerie guidée ultrasons garantit la précision de sorte que tous les animaux de cette étude développé des métastases cérébrales et aucune mort de l&#39;animal a été observé. La beauté de l&#39;injection guidée par l&#39;image, c&#39;est que le chemin de la pénétration de l&#39;aiguille de la peau et enfin dans le ventricule gauche peut être contrôlé et ajusté sous l&#39;image, qui est distincte de la procédure manuelle nécessitant des ...

métastases du cerveau est la tumeur maligne la plus fréquente intracrânienne chez les adultes. Le pronostic est très mauvais, avec une médiane de survie de 4-6 mois, même avec un traitement agressif. Le cancer du sein est l&#39;un des trois principaux cancers primaires avec une morbidité élevé de métastases cérébrales 1-3. Plusieurs lignées de cancer du sein cerveau-tropique sont capables de développer des métastases cérébrales après injection intracardiaque ou intracarotidienne 4. L&#39;injection directe de cellules tumorales dans le ventricule gauche peut contourner le lit capillaire pulmonaire et d&#39;augmenter ainsi l&#39;incidence de la formation de métastases cérébrales, tout en minimisant les métastases viscérales. La ligne MDA-MB231Br est l&#39;une des lignées de cancer du sein le plus largement utilisé droits pour développer des métastases cérébrales dans des modèles rongeurs 5,6. Comme de nombreuses autres études 4,7, nous avons effectué une procédure manuelle de l&#39;injection intra-cardiaque dans nos études précédentes. Cependant, seulement 50% de taux de succès a été obtenu avec l&#39;emploiinjection et une fraction de souris sont mortes des procédures invasives répétées si les essais antérieurs ont échoué. Ici, nous présentons l&#39;utilisation d&#39;une procédure d&#39;imagerie guidée pour garantir l&#39;injection de cellules de cancer du sein cerveau cherchant dans le ventricule gauche de souris athymiques. Longitudinal IRM à haute résolution est appliqué à suivre le développement intracrânienne des métastases cérébrales.

<table><tbody><tr><td></td><td>DMEM HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Mediatech</td><td>25-051-C1</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Compteur automatique</td><td>de cellules BioRad</td><td>TC10</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter International Inc.</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie haute résolution VisualSonics Vevo 770</td><td>Sons visuels Inc.</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Aimant à alésage horizontal de 9,4 T avec système Varian INOVA Unity&nbsp ;</td><td>Agilent</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>O.C.T COMPOUND</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

ultrasound imaging guidée injection intracardiaque de développer un modèle de souris de cancer du sein métastases cérébrales suivi par irm longitudinale

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

cerveau du cancer du sein métastatique, survenant dans 30% des patients atteints de cancer du sein au stade IV, est associée à une mortalité élevée. La médiane de survie est de seulement 6 mois. Il est essentiel d&#39;avoir des modèles animaux appropriés pour imiter la propagation de l&#39;hémodynamique des cellules métastatiques dans le scénario clinique. Ici, nous présentons l&#39;utilisation de l&#39;imagerie du petit animal ultrasons pour guider une injection précise des cellules cancéreuses du sein tropicale du cerveau dans le ventricule gauche de la souris nude athymiques. IRM longitudinal est utilisée pour l&#39;évaluation de l&#39;initiation et de la croissance intra-crânienne de métastases cérébrales. Injection intracardiaque guidée par échographie assure non seulement une injection précise et présente un taux de réussite plus élevé, mais a également diminué de manière significative le taux de mortalité, par rapport à notre manuel de procédure précédente. In vivo IRM à haute résolution permet la visualisation des lésions multifocales hyperintenses, aussi petit que 310 um de diamètre sur T 2 images pondéré à 3 semaines après l&#39;injection. Follow-up IRM révèle une croissance de tumeur intracrânienne et l&#39;augmentation du nombre de métastases qui distribuent tout au long de l&#39;ensemble du cerveau.

Avec la haute résolution spatiale de l&#39;IRM (78 um dans la résolution de l&#39;avion), les lésions hyperintenses peuvent être identifiés aussi petit que 310 m de diamètre (figure 2). Depuis les métastases dans cette étude sont très faibles et le développement de la nécrose et de l&#39;œdème est minime, la lésion hyperintense en T 2 images pondérées représentait vraiment la masse de la tumeur. Des études longitudinales permettent d&#39;IRM dans l&#39;év...

Un modèle murin de cancer du cerveau de métastase est établi par échographie injection intracardiaque guidée par imagerie de cellules MDA-MB231/Br-GFP. Développement des métastases intracrâniennes multifocales a été suivie longitudinalement en utilisant à haute résolution de 9,4 T IRM.

Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque de développer un modèle de souris de cancer du sein métastases cérébrales Suivi par IRM longitudinale

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une échoguidance pour établir un modèle murin de métastases cérébrales du cancer du sein, qui pourra ensuite être surveillé par IRM. Cela est réalisé en collectant des cellules cancéreuses du sein à tropisme cérébral et en les injectant dans le ventricule gauche. À l'aide de l'échoguidance, le développement tumoral intracrânien est ensuite suivi.L'utilisation de l'IRM et la confirmation des métastases par coloration hématoxyline-éosine permettent finalement une injection précise guidée par imagerie, ce qui peut augmenter significativement la réussite du suivi, de la formation et du développement des métastases cérébrales du cancer du sein. L'IRM longitudinale permet un suivi non invasif de la formation et du développement du cancer du sein.Tous les protocoles animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Centre médical de l'Université du Texas Southwestern. Pour ce protocole, préparez des cellules M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P cultivées dans un milieu DMEM contenant 10 %FBS, 1 %glutamine et 1 %pénicilline. La streptomycine surveille toujours l'état des cellules et remplacez le milieu tous les deux à trois jours. Lorsqu'une confluence de 80 % est atteinte, détachez les cellules à l'aide de trypsine et récupérez-les.Commencez par éliminer complètement le milieu ancien à l’aide d’une pipette à vide. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de PBS pour laver doucement les cellules jusqu’à ce que toutes soient recouvertes de PBS. Puis, retirez le liquide de lavage.Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de trypsine dans la boîte. Inclinez doucement la boîte pour vous assurer que toutes les cellules soient recouvertes de trypsine. Replacez la boîte dans l’incubateur à cellules à 37 degrés Celsius.Attendre une minute et observer les cellules au microscope. Si elles sont rondes et flottantes, elles se sont détachées. Ajouter trois millilitres de milieu pour arrêter la digestion et transférer le mélange cellulaire dans un tube de centrifugation à l’aide d’une pipette.Centrifuger le mélange à 1 160 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, retirer soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette à vide. Puis, resuspendre délicatement les cellules dans cinq millilitres de milieu sans sérum à l’aide d’une pipette, jusqu’à ce qu’aucun culot cellulaire évident ne soit visible et que la solution paraisse homogène à 50 microlitres du mélange cellulaire.Ajouter 50 microlitres de bleu de trypan une fois bien mélangé. Ajouter des aliquotes de 10 microlitres à plusieurs lamelles de numération cellulaire. Ensuite, compter les cellules à partir des valeurs du compteur de cellules.Calculez et utilisez la moyenne de tous les dénombrements par once. Préparez maintenant une suspension cellulaire plus précise. Centrifugez-les à nouveau et resuspendez-les à raison de 175 000 cellules par 100 microlitres de milieu sans sérum.Ensuite, conserver les cellules sur de la glace pour l'injection intracardiaque. Pour ce protocole, utiliser des souris femelles BC nude âgées de six à huit semaines. Se connecter au système d'imagerie et initialiser le transducteur.7 0 4 à 40 mégahertz. Commencez une nouvelle étude et remplissez les invites d'information en conséquence. Ensuite, anesthésiez la souris et administrez l'anesthésique au moyen d'un cône nasal.Pendant l'injection guidée, régler la température de la table d'imagerie à 37 degrés Celsius et fixer la souris sur la table en position supine. Maintenir le gel échographique à 37 degrés Celsius avant l'imagerie et en appliquer sur la poitrine de la souris. Placer maintenant le transducteur dans son support et l'abaisser à la profondeur d'imagerie souhaitée.Ensuite, déplacez la platine jusqu'à ce que le ventricule gauche soit identifié en utilisant l'aorte ascendante comme repère, puis verrouillez la platine à l'endroit où la vue est la plus nette. Prélevez maintenant 100 microlitres du mélange cellulaire refroidi dans une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 22. Fixez la seringue chargée sur le support de seringue.Ensuite, déplacez la seringue vers la poitrine. Avant d'entrer dans la souris, déplacez-la soigneusement de côté jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille se trouve dans le champ d'imagerie. Ajustez la hauteur et l'angle de l'aiguille pour viser le ventricule gauche, puis, une fois en position, pénétrez rapidement l'aiguille à travers les couches cutanée et musculaire jusqu'au ventricule gauche.Sous la guidance de l'image échographique, un signe d'insertion réussie dans le ventricule gauche est le reflux de sang artériel rouge vif dans la seringue. Injectez ensuite lentement le mélange cellulaire une fois l'insertion terminée, retirez l'aiguille, soulevez le transducteur et nettoyez le gel échographique avec une compresse humide. Puis libérez l'animal du ruban adhésif et transférez-le dans une cage propre équipée d'un tapis chauffant préalablement réchauffé.Observer la souris jusqu'à ce qu'elle récupère complètement, puis la surveiller quotidiennement pendant quelques jours. En utilisant une résolution de 78 micromètres carrés en mode standard, des lésions hyperintenses en IRM peuvent être identifiées à un diamètre de 310 micromètres. Étant donné que les métastases dans cette étude étaient très petites et que la nécrose et l'œdème étaient minimes, la lésion hyperintense sur les images pondérées en T2 représentait fidèlement la tumeur.Les études longitudinales par IRM de masse permettent une évaluation in vivo non invasive de la croissance tumorale. L'IRM à haute résolution a permis de détecter plusieurs petites lésions trois semaines après l'injection intracardiaque ; à la quatrième semaine, toutes les lésions observées lors de l'examen précédent avaient augmenté de taille. De nouvelles lésions sont apparues sur les images pondérées en T2.La coloration H et E a révélé des lésions métastatiques diffuses ou la coloration H et E a mis en évidence des lésions métastatiques de type en grappes. Des vaisseaux élargis étaient souvent observés autour de la tumeur, indiquant qu'une angiogenèse non par bourgeonnement était en cours. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière réaliser une injection guidée par imagerie échographique dans le ventricule gauche du cœur d'une souris.

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Ce travail préséque un protocole avancé pour évaluer avec précision la charge tumorale par la détection de protéines fluorescentes vertes et de signaux de bioluminescence ainsi que l’intégration de la technique quantitative de détection moléculaire.

Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein

La modélisation intracrânienne de métastase de cerveau est compliquée par une incapacité de surveiller la taille et la réponse de tumeur au traitement avec des méthodes précises et opportunes. La méthodologie présentée couple l’injection intracrânienne de tumeur avec l’analyse de formation image de résonance magnétique, qui une fois combinée, cultive des injections précises et cohérentes, la surveillance accrue d’animal, et les mesures précises de volume de tumeur.

Modélisation des métastases cérébrales par injection intracrânienne et imagerie par résonance magnétique

Nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales du cancer du sein générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire de cancer inflammatoire du sein amplifiée par HER2 de manière endogène.

Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein

Les métastases cérébrales sont une cause de morbidité et de mortalité sévères chez les patients atteints de cancer. La plupart des modèles murins de métastases cérébrales sont compliqués par des métastases systémiques confondant l’analyse de la mortalité et des résultats des interventions thérapeutiques. Présenté ici est un protocole pour l’injection carotidienne interne de cellules cancéreuses qui produit des tumeurs intracrâniennes cohérentes avec des tumeurs systémiques minimales.

Modélisation des métastases cérébrales par injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide interne

Découvrez comment établir un modèle de métastases cérébrales du cancer du sein chez la souris par injection intracardiaque guidée par échographie. Le suivi longitudinal par IRM haute résolution permet de surveiller la progression tumorale de manière non invasive.

Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque de développer un modèle de souris de cancer du sein métastases cérébrales Suivi par IRM longitudinale (Vidéo) | JoVE Journal

Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque de développer un modèle de souris de cancer du sein métastases cérébrales Suivi par IRM longitudinale

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