Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Cette expérience permet de générer des virus vaccinia recombinants marqués par fluorescence selon une méthode modulaire et rapide fondée sur une sélection transitoire dominante. Tout d'abord, construisez un vecteur recombinant contenant une étiquette fluorescente encadrée par des régions homologues minimales synthétisées, ainsi que des marqueurs destinés à la sélection métabolique et fluorescente. Transfectez ce vecteur de recombinaison dans des cellules infectées et amplifiez les virus recombinants à l’aide d’une sélection métabolique et de la fluorescence. Ensuite, supprimez la sélection métabolique afin d’exciser le cassette marqueur et isolez les cellules contenant les virus recombinants par sélection au marqueur fluorescent. L’analyse des plaques virales sur des monocouches cellulaires permet de visualiser les particules virales individuelles caractéristiques du gène marqué par fluorescence.

Nous avons mis au point cette méthode afin de générer des virus recombinants portant plusieurs modifications génétiques, en utilisant une méthode de sélection pouvant être appliquée de façon répétée et universelle, indépendamment du marqueur utilisé. Bien que le principe de la sélection dominante transitoire ait déjà été décrit précédemment, nous souhaitions l'appliquer à une échelle plus grande et de manière modulaire, afin d'obtenir une plus grande flexibilité dans l'introduction de modifications génomiques. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le criblage et l'isolement des plaques virales recombinantes peuvent s'avérer délicats. En effet, leur fréquence peut être faible, ce qui nécessite des méthodes spécifiques pour une récupération efficace du virus.

Ainsi, marquez le gène viral d'intérêt à l'extrémité N ou C du protéine. Identifiez en conséquence des régions flanquantes d'homologie de 150 paires de bases. Concevez ensuite une séquence d'oligonucléotides comprenant les bras gauche et droit de 150 paires de bases, séparés par une paire de sites de restriction au choix. Flanquez également cette région d'une deuxième paire de sites de restriction, différente de la première, afin de permettre l'incorporation dans le vecteur TDS une fois la synthèse effectuée. Vérifiez maintenant que l'oligonucléotide avec les sites de restriction est conçu pour être en phase avec le site d'insertion souhaité. Pour la synthèse de l'oligonucléotide, assurez-vous que les sites de restriction intégrés entre les bras gauche et droit correspondent à ceux qui flanquent le cadre de lecture ouvert de la marque fluorescente choisie. Intégrez ces mêmes sites de restriction de part et d'autre de la marque fluorescente par PCR. Clonez le fragment synthétisé dans le vecteur TDS. Clonez également la marque fluorescente dans le vecteur de recombinaison obtenu en utilisant les sites de restriction situés entre les régions d'homologie des bras gauche et droit. Infectez une monocouche de cellules BS-C-1 avec le virus vaccinia dans un milieu sans sérum.

Une heure après l'infection, récupérez les cellules avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco. Transfectez avec un mélange de plasmide du vecteur de recombinaison et de réactifs de transfection dans un rapport de trois à un, en milieu sans sérum. Après 24 heures, grattez et récupérez les cellules dans du DMEM ne contenant pas de sérum bovin fœtal. Soumettez les cellules à trois cycles de congélation-décongélation afin de lyser les cellules et libérer les particules virales. Ensuite, pour obtenir une séparation adéquate des plaques individuelles, infectez des monocouches de cellules BS-C-1 à confluence de 100 % avec des dilutions sériées de la préparation de particules virales. Recouvrez avec un milieu liquide contenant 10 % de FBS et du DMEM additionné des réactifs de sélection GPT, puis incubez pendant 24 heures.

Aspirez la couche liquide et utilisez un microscope à fluorescence pour rechercher des plaques présentant une fluorescence rouge diffuse correspondant à l'incorporation de M-cherry provenant du vecteur TDS dans le virus. Selon le gène cible et la balise fluorescente choisie, une fluorescence localisée du gène marqueur peut également être observée dans la même plaque rouge.

Maintenant, pour chaque virus recombinant, sélectionnez plusieurs plaques, grattez-les avec la pointe de la pipette et transférez les cellules dans un tube Eppendorf à l’aide de 100 microlitres de DMEM contenant 5 % de FBS. Effectuez trois cycles de congélation-décongélation des cellules prélevées afin de libérer les virus recombinants.

Ajouter le DMEM contenant le virus congelé-dégelé à une monocouche de cellules dans une plaque de 12 puits afin d'amplifier les virus recombinants avec les réactifs de sélection GPT dans le milieu de croissance. Ensuite, racler les amplifications réussies 24 heures après l'infection. Pour un test de plaque des plaques correctement amplifiées, présentant une fluorescence rouge, ensemencer une plaque de 6 puits avec une monocouche de cellules BS-C-1.

Réalisez une dilution sérielle des virus recombinants et infectez les puits avec une dilution croissante de virus dans du DMEM sans FBS. Une heure après l'infection, retirez le milieu liquide et recouvrez chaque puits d'agarose à 0,5 % dans un milieu essentiel minimum complété. Trois jours après l'infection, sélectionnez les plaques présentant une fluorescence rouge ainsi que la couleur du marqueur fluorescent choisi.

Amplifiez-les à nouveau sans sélection par la GPT. Choisissez des plaques ayant perdu leur fluorescence rouge diffuse, mais conservant la fluorescence localisée correspondant à la marque au choix. Poursuivez la purification des plaques sans sélection afin d'obtenir un stock pur de virus recombinants ayant perdu les gènes de sélection M-cherry et GPT, mais conservant la fluorescence localisée correspondant à la marque choisie.

Évaluer la pureté des stocks à l'aide d'un dosage par plaque, en visant toutes les plaques présentant un phénotype de plaque similaire. Amplifier les stocks viraux testés dans une monocouche de cellules BS-C-1. Après 24 heures post-infection, racler les cellules infectées dans 250 microlitres de DMEM. Centrifuger les cellules infectées, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 500 microlitres de SDS 0,1 % dans un tampon TE. Vortexer pour lyser les cellules. Puis ajouter 500 microlitres de phénol, chloroforme, alcool isoamylique, et inverser pour mélanger. Centrifuger. Récupérer la phase supérieure et répéter l'extraction.

Ensuite, pour précipiter l'ADN de la couche aqueuse, ajoutez un millilitre d'éthanol glacé à 100 % et 50 microlitres d'acétate de sodium. Mélangez par retournement et placez l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir centrifugé pour former un culot d'ADN, éliminez tout le liquide, séchez le culot d'ADN à l'air et remettez-le en suspension dans 50 microlitres de tampon TE. Utilisez ce modèle d'ADN génomique pour cribler par PCR l'insertion virale. Générez des virus recombinants portant plusieurs marqueurs comme décrit dans le protocole écrit.

Ces virus vaccinia recombinants exprimentent des protéines marquées par des marqueurs fluorescents dirigés contre les protéines structurales virales A3 et F13, qui font partie respectivement du noyau interne du virus et de l'enveloppe externe. Les gènes correspondant aux protéines localisées dans le virion ont été choisis afin de visualiser les particules virales. A3 est une protéine du noyau du virion vaccinia, et F13 est une protéine de l'enveloppe virale.

Un virus doublement marqué, portant à la fois A3 et F13 marqués par fluorescence, est également présenté. Une microscopie à fluorescence en temps réel peut être réalisée avec un virus doublement marqué. Dans ce cas, la protéine du cœur interne du virus de la vaccine, A3, est marquée en rouge et la protéine de l’enveloppe externe F13 est marquée en vert.

Les particules virales non enveloppées provenant de l'usine à virus sont visualisées en rouge, tandis que les virions enveloppés sont représentés par la colocalisation des canaux rouge et vert. Une analyse quantitative a été utilisée pour déterminer les rendements de recombinaison entre les vecteurs recombinants et le génome du virus vaccinia. L'efficacité de la recombinaison homologue entre les vecteurs et le génome du virus vaccinia peut être détectée avec des régions d'homologie aussi courtes que 70 paires de bases.

Cette méthode a permis de créer des virus portant plusieurs marqueurs fluorescents et/ou plusieurs délétions géniques. Ces virus ont été utilisés pour étudier le cycle infectieux du virus, le rôle des protéines virales dans la subversion des systèmes de défense de l'hôte, ainsi que les interactions avec les voies de signalisation de l'hôte. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des virus de vaccine recombinants en utilisant une méthode modulaire quant aux marqueurs utilisés, rigoureuse dans l'identification des recombinants souhaités et applicable dans divers contextes de recherche.