Name: Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Découvrez une méthode modulaire et rapide pour générer des virus vaccinia recombinants marqués par fluorescence en utilisant la sélection dominante transitoire. Ce protocole simplifie les modifications génétiques multiples et améliore le criblage des plages virales fluorescentes.

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Ces travaux ont été financés par la subvention discovery project de l’Australian Research Council Federation #1096623.

1. Création du vecteur de recombinaison
<ol><li>Identifier les régions d’homologie flanquantes de 150 pb de long (appelées bras gauche et droit) nécessaires pour étiqueter le gène viral d’intérêt de manière terminale ou C (voir la figure 1b).</li>
	<li>Concevoir une séquence d’oligonucléotides comprenant les bras gauche et droit de 150 points d’ébullition séparés par une paire de sites de restriction de choix. Cette séquence entière doit également être flanquée d’une deuxième paire de sites de restriction (différente de la première paire) pour permettre l’incorporation dans le vecteur TDS une fois synthétisée. Veillez lors de la conception de l’oligonucléotide avec des sites de restriction que les séquences sont dans le cadre avec le site d’insertion souhaité.</li>
	<li>Incorporer des sites de restriction entre les bras gauche et droit lors de la conception de l’oligonucléotide pour la synthèse, qui doit correspondre à ceux flanquant le cadre de lecture ouvert de l’étiquette fluorescente de choix (voir figure 1b). Il est possible d’utiliser un site de restriction NotI comme un linker à trois acides aminés entre le bras gauche et le début de l’étiquette fluorescente.</li>
	<li>Incorporer ces mêmes sites de restriction de part et d’autre de l’étiquette fluorescente par PCR (voir figure 1c).</li>
	<li>Clonez le fragment synthétisé dans le vecteur TDS.</li>
	<li>Cloner l’étiquette fluorescente dans le vecteur de recombinaison résultant à l’aide des sites de restriction entre les régions d’homologie du bras gauche et droit (voir la figure 1d).</li>
</ol>2. Génération de virus recombinants
<ol><li>Conformément à la figure 2,infecter une monocouche de cellules BS-C-1 avec le virus de la vaccine dans des milieux sans sérum à une multiplicité d’infection (MOI) > 1.</li>
	<li>1 heure post-infection, cellules de sauvetage avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et transfect avec un mélange de plasmide vectoriel de recombinaison et de réactif de transfection dans un rapport de 3:1 dans des milieux sans sérum.</li>
	<li>Après 24 heures, grattez et récupérez les cellules dans le DMEM ne contenant pas de sérum fœtal bovin (FBS) et effectuez trois cycles de gel-dégel pour briser les cellules ouvertes et libérer des particules virales.</li>
	<li>Effectuer un essai de plaque avec une superposition liquide de 10 % de réactifs de sélection FBS DMEM et GPT, comme suit :<ol>
<li>Ensemencez une plaque de 6 puits avec une monocouche de cellules BS-C-1.</li>
		<li>Infecter les monocouches de cellules 100% confluentes avec des dilutions en série des cellulesgelées contenant des particules virales pour assurer une séparation adéquate des plaques individuelles.</li>
		<li>Recouvrur de liquide à 10 % de FBS contenant du DMEM contenant les réactifs de sélection gpt - acide mycophénolique et xanthine à des concentrations finales de 25 μg/ml et 250 μg/ml respectivement.</li>
	</ol></li>
	<li>Après une incubation de 24 heures, retirez la couche liquide et utilisez un microscope fluorescent pour rechercher des plaques présentant une fluorescence rouge diffuse correspondant à l’incorporation de mCherry du vecteur TDS dans le virus. En fonction du gène cible et de l’étiquette fluorescente choisie, une fluorescence localisée du gène marqué peut également être observée dans la même plaque rouge.</li>
	<li>Choisissez plusieurs plaques pour chaque virus recombinant en grattant localiséement avec une pointe de pipette et 100 μl de FBS à 5% contenant du DMEM pour transférer les cellules dans un tube Eppendorf, suivi de trois séries de gel-décongélation de cellules raclées pour libérer des virus recombinants.</li>
	<li>Ajouter le virus DMEM contenant le virus congelé-décongelé à une monocouche de cellules dans une plaque de 12 puits pour amplifier les virus recombinants avec des réactifs de sélection GPT dans le milieu de croissance. Gratter les amplifications réussies 24 heures après l’infection.</li>
	<li>Effectuez un test de plaque de plaques amplifiées avec succès présentant une fluorescence rouge, cette fois avec une superposition d’agarose et une sélection GPT, comme suit:<ol>
<li>Ensemencez une plaque de 6 puits avec une monocouche de cellules BS-C-1.</li>
		<li>Effectuer une dilution en série des virus recombinants et infecter les puits avec une dilution croissante des virus dans le DMEM libre de FBS.</li>
		<li>1 heure après l’infection, retirer le milieu liquide et superposer chaque puits avec 0,5 % d’agarose dans un milieu essentiel minimal (MEM) contenant 2,5 % de FBS, 292 μg/ml de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, ainsi que les réactifs de sélection gpt.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 jours après l’infection, choisissez des plaques affichant une fluorescence à la fois rouge et la couleur de l’étiquette fluorescente choisie pour amplifier à nouveau, cette fois sans sélection GPT.</li>
	<li>Effectuez le prochain test de plaque avec une superposition d’agarose sans sélection.</li>
	<li>Choisissez les plaques qui ont perdu leur fluorescence rouge diffuse mais conservez la fluorescence localisée correspondant à l’étiquette de choix.</li>
	<li>Continuer à purifier la plaque sans sélection pour obtenir un stock pur de virus recombinants qui ont perdu les gènes de sélection mCherry et gpt mais conservent la fluorescence localisée correspondant à la balise choisie. Vérifiez que les stocks sont purs par dosage de plaque, toutes les plaques doivent avoir un phénotype de plaque similaire.</li>
	<li>Utiliser le criblage PCR de l’ADN génomique pour s’assurer que les stocks viraux sont purs.<ol>
<li>Concevoir des amorces qui flanquent le site d’insertion du gène fluorescent et des amorces qui amplifient le gène fluorescent inséré lui-même. Différentes combinaisons de ces amorces produiront des amplicons PCR qui détecteront l’insertion de gènes et indiqueront la pureté.</li>
		<li>Amplifier les stocks viraux à filtrer par PCR dans un puits d’une monocouche de plaques de 12 puits de cellules BS-C-1.</li>
		<li>24 heures après l’infection, gratter les cellules infectées en 250 μl de DMEM.</li>
		<li>Centrifuger les cellules infectées (18 000 x g pendant 10 min, 4 °C), éliminer le surnageant et ressusciter les pastilles cellulaires dans 500 μl TE (Tris-HCl 10 mM et EDTA 1 mM, pH 8) avec une FDS de 0,1 % (v/v). Vortex pour lyser les cellules.</li>
		<li>Ajouter 500 μl d’acohol phénol-chloroforme-isoamyl, inverser pour mélanger. Centrifugeuse (18 000 x g pendant 4 min, 4 °C). Prenez le surnageant et répétez.</li>
		<li>Effectuer une précipitation d’éthanol sur le surnageant en ajoutant 1 ml d’éthanol à 100% (réfrigéré) et 50 μl d’acétate de sodium, inversé pour mélanger.</li>
		<li>Laisser passer à -20 °C pendant la nuit ou -80 °C pendant 1 h. Centrifuger (18 000 x g pendant 30 min, 4 °C), éliminer tout liquide et laisser sécher l’ADN précipité à l’air. Remise en suspension dans 50 μl TE.</li>
		<li>Utilisez-le comme modèle pour le dépistage par PCR de l’ADN génomique.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Génération de virus recombinants portant plus d’une étiquette
<ol><li>Co-infection de la même monocouche cellulaire avec des virus recombinants fluorescents pour créer des virus à double ou triple étiquette ou répéter la procédure du protocole 1) avec une étiquette différente.</li>
	<li>Purifier les virus à partir du phénotype de la plaque ou du dépistage par PCR de l’ADN génomique de l’isolat de virus.</li>
</ol>

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</ol>

Aucun conflit d’intérêts déclaré.

Cette technique décrit un protocole efficace et modulaire pour la création de virus recombinants qui expriment des protéines virales marquées par fluorescence. La méthode garantit que le seul changement apporté au génome viral est l’ajout d’une étiquette ou d’un marqueur, ne laissant derrière lui aucun marqueur de sélection. La courte longueur de bras requise pour la recombinaison homologue permet sa synthèse directe, éliminant plusieurs cycles chronophages de PCR et de clonage, tandis que la fluorescence de mCherry et la sélection métabolique GPT sont utilisées pour isoler les intermédiaires de recombinaison virale. Ces intermédiaires peuvent être résolus, après la suppression de la sélection, en un virus avec un gène marqué ou de retour au type parental. Une méthode similaire impliquant l’utilisation de la sélection fluorescente et métabolique a été décrite précédemment27 bien que la méthode utilisée dans cette étude utilise des régions plus courtes et synthétisées d’homologie, permettant l’identification du virus recombinant désiré par imagerie de la fluorescence du gène marqué d’intérêt. Cette sélection secondaire ne s’applique qu’au marquage de gènes viraux hautement exprimés qui produisent une fluorescence suffisante dans un essai de plaque. Alternativement, on pourrait envisager l’insertion d’une cassette d’expression complète, par exemple une protéine fluorescente sous un promoteur viral fort. Dans ce cas, les bras gauche et droit définiraient le point d’insertion plutôt que le gène viral à marquer.
Certaines étapes clés se sont avérées utiles au cours de la procédure expérimentale. La superposition liquide de l’étape 2.3.3 décrite ci-dessus s’est avérée cruciale pour la détection et l’isolement des plaques fluorescentes rouges/vertes. Nous croyons que la combinaison des réactifs de sélection GPT et de la superposition d’agarose a dissuadé la croissance des virus recombinants et est donc passée à une superposition liquide pour la première étape de l’amplification des virus après transfection. Il est également important de choisir des plaques fluorescentes montrant une fluorescence localisée de la couleur de l’étiquette pour l’enrichissement et la purification, car les intermédiaires résultant de la recombinaison du bras gauche peuvent entraîner une fluorescence diffuse observée dans les plaques si le bras gauche contient également une séquence promotrice. Le gène marqueur mCherry dans le vecteur TDS peut également être remplacé par gfp,par exemple, pour permettre l’incorporation et la sélection faciles de mCherry comme une étiquette fluorescente.
Certaines techniques décrites ci-dessus diffèrent légèrement des méthodes établies de création du virus de la vaccine recombinante. Par exemple, le MOI du virus utilisé pour créer des recombinants est normalement inférieur à 128, mais l’utilisation de MOIs plus élevés a été suffisante pour la création du virus de la vaccine recombinante par cette méthode. L’utilisation de réactifs de sélection GPT nécessite normalement une préincubation des cellules avec des réactifs de sélection18,mais leur ajout lors de la phase de sauvetage post-infection a tout de même fourni une sélection suffisante de recombinants souhaités, en particulier en raison de la présence d’un marqueur de sélection fluorescent.
Comme mentionné précédemment, l’une des limites de cette technique est que l’étape de sélection de la fluorescence secondaire repose sur la protéine d’intérêt marquée étant fortement exprimée, à un niveau qui permet sa détection par l’œil dans un dosage de plaque. Sans cela, il serait possible de purifier les virus qui ne présentent que la fluorescence mCherry, dont au moins 50% contiendraient les virus recombinants souhaités, qui pourraient être identifiés par des stratégies moléculaires telles que la PCR décrite à l’étape 2.12 ci-dessus. Une autre limitation pourrait être l’inactivation de certaines protéines à la suite de leur marquage. L’étiquette fluorescente peut subir des mutations ou être excisée par le virus recombinant avec passaging au fil du temps. Par conséquent, un échantillonnage régulier des stocks de virus recombinants par microscopie et PCR est recommandé. Enfin, il peut y avoir une limite au nombre de protéines marquées par fluorescence qui peuvent être incorporées dans un seul virus. Un aspect de ceci est la possibilité de les visualiser tous simultanément; étant donné la nature de chevauchement des spectres d’émission des étiquettes fluorescentes disponibles, il est important de les sélectionner avec soin pour assurer un fond perdu spectral minimal. En outre, l’utilisation de balises étroitement liées telles que GFP et Cerulean ouvre la possibilité d’une recombinaison entre les deux, en fonction de leur emplacement dans le génome recombinant.
La nature modulaire de cette technique permet la substitution simple d’étiquettes fluorescentes en fonction de la compatibilité avec d’autres choix de coloration et/ou d’étiquettes. En éliminant les marqueurs sélectionnables, la méthode TDS permet l’ajout en série de diverses protéines fluorescentes ou la combinaison du marquage à base de TDS avec des délétions de gènes à base de TDS pour des analyses phénotypiques29. À titre d’exemple de l’utilité de cette approche, un virus fluorescent à double marquage qui marque les cœurs de virus et la membrane WV a été généré. Les études d’imagerie avec ce virus pourraient être utilisées pour étudier le mouvement, la morphogenèse et l’enveloppement du virus pendant la réplication du virus. Jusqu’à présent, des protéines virales de vaccinia non caractéristiques peuvent également être marquées et étudiées par cette technique.
Le virus de la vaccine a été largement utilisé dans les études d’imagerie en raison de nombreuses caractéristiques du virus qui sont favorables à la microscopie à cellules vivantes. Les étiquettes fluorescentes sont exprimées à partir du génome viral, éliminant le besoin de transfection, permettant aux cellules primaires dérivées d’animaux infectés ou de cellules non transmissibles d’être facilement analysées. Initialement, les VCA fluorescents ont été utilisés pour le suivi subcellulaire simple du mouvement du virus30,mais des approches plus récentes ont élargi leur utilité pour inclure les études FRET31,le FRAP à des particules virales uniques32,les reporters promoteurs33,l’imagerie intravitale34et les études structurelles35-37. Toutes ces techniques pourraient être plus faciles et plus proches couplées à cette méthode de création de virus fluorescents recombinants.

Le virus de la vaccine (VCA) est le poxvirus prototypique et fortement apparenté au virus de la variole, l’agent causal de la variole. Ces deux virus sont membres du genre orthopox qui comprend d’autres agents pathogènes notables tels que la variole du singe et le virus ectromelia (mousepox)1. Les orthopoxvirus ont de grands génomes d’ADN double brin (180-220 kb) qui codent plus de 200 cadres de lecture ouverts prédits2,3. La réplication de ces virus implique la formation d’une usine de virus périnucléaires, où des virus matures (MV) sont fabriqués, et du réseau trans-Golgi où un sous-ensemble de MV acquiert deux membranes supplémentaires pour générer des virus enveloppés (WV) (examiné par Roberts et Smith4). Les génomes orthopox sont très sensibles à la manipulation génétique en raison du degré élevé de recombinaison génétique qui est une caractéristique de la réplication du génome VACV et est médiée par l’ADN polymérase virale5. La génération de virus recombinants repose sur une recombinaison homologue et des molécules d’ADN linéaires avec des homologies aussi petites que 12 pb étant suffisantes pour arbitrer la recombinaison dans les cellules infectées par le virus de la vaccine6. Le étiquetage fluorescent du virus de la vaccine peut produire des particules virales extrêmement brillantes en raison de la grande taille des particules d’orthopox, ce qui permet l’incorporation de nombreuses protéines fluorescentes par virion7. La vaccine a la capacité de transporter de gros fragments d’ADN étranger8 et de plus, l’absence de symétrie rigide des capsides peut permettre un certain degré de flexibilité lors de l’expression de fusions de gènes de protéines virales à partir de leurs loci endogènes9. Le marquage fluorescent des protéines VACV s’est avéré inestimable pour l’étude des interactions hôte-pathogène au niveau subcellulaire, en particulier dans le domaine de l’entrée du virus10,du transport11-13,et de la morphogenèse, en particulier des virions enveloppés7.
Les virus recombinants peuvent être sélectionnés par le sauvetage d’un phénotype de croissance atténuée14,15,la sélection métabolique16-18,ou par l’expression d’un gène marqueur(par exemple X-gal19 ou protéine fluorescente13,20). Nous décrivons ici la sélection de virus fluorescents à l’aide d’une puissante combinaison de sélection fluorescente et métabolique. Les vecteurs de sélection dominante transitoire (TDS), développés par Faulkner et Moss (1990)21, permettent d’intégrer les marqueurs avec le gène d’intérêt marqué par fluorescence souhaité. Lorsque la sélection métabolique est supprimée, un événement de recombinaison secondaire peut se produire qui excise les gènes de sélection, mais laisse intacte la protéine virale marquée par fluorescence. La figure 2 ci-dessous donne un aperçu de la procédure expérimentale. Les gènes de sélection utilisés dans cette étude sont mCherry et le gène Escherichia coli guanine phosphoribosyltransférase(gpt),tous deux exprimés à partir d’un promoteur viral synthétique précoce/tardif et utilisés précédemment par Cordeiro et al. 22 En outre, il existe une fluorescence de la protéine de fusion marquée d’intérêt. Lorsque la sélection métabolique est supprimée, les marqueurs sélectionnables (mCherry et gpt) sont excisés, ne laissant que la fluorescence du gène marqué, ce qui permet d’identifier les virus recombinants corrects. L’excision des marqueurs de sélection offre la possibilité de combiner plusieurs étiquettes fluorescentes, ce qui nous permet de créer des virus avec la capacité d’étiqueter par fluorescence plusieurs protéines virales simultanément. Des études antérieures ont déterminé les exigences minimales en matière d’homologie pour la recombinaison de la vaccine des molécules d’ADN linéaires et circulaires transfectées en cellules infectées par le virus de la vaccine6. Nous voulions déterminer les efficacités de recombinaison des longueurs variables d’homologie des bras flanquants dans le vecteur TDS gpt-mCherry par son incorporation dans le génome viral de la vaccine. Il a été déterminé que les régions homologues de 100 pb dans le vecteur TDS sont suffisantes pour cibler et arbitrer l’insertion d’ADN recombinant dans le génome vacv par recombinaison homologue (Figure 4). Alors que des longueurs d’homologie plus petites permettraient également la recombinaison, des longueurs d’homologie de 100 pb ont fourni suffisamment de virus recombinants qui pourraient être facilement identifiés avec la sélection métabolique et fluorescente. Des fragments d’ADN de cette taille peuvent être synthétisés commercialement à un coût relativement faible et facilite grandement la production de vecteurs multiples pour la création de virus recombinants. Nous avons choisi d’augmenter la longueur d’homologie à 150 pb pour fournir une plus grande fréquence de recombinaison tout en maintenant bas les coûts de synthèse de la séquence d’oligonucléotide des régions flanquantes.

<table><tbody><tr><td>Acide mycophénolique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>Dissoudre dans 0,1 N NaOH</td></tr><tr><td>Xanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>Dissoudre dans 0,1 N NaoH</td></tr><tr><td>FuGENE HD réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence équipé de filtres Chroma 31001, 31002</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus) ; 31001, 31002 (Chroma)</td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Le marquage des protéines virales avec des protéines fluorescentes s’est avéré une approche indispensable pour approfondir notre compréhension des interactions virus-hôte. Le virus de la vaccine (VVAC), le vaccin vivant utilisé dans l’éradication de la variole, se porte particulièrement bien à la microscopie fluorescente à cellules vivantes en raison de sa grande taille de virion et de la facilité avec laquelle il peut être conçu au niveau du génome. Nous rapportons ici un protocole optimisé pour générer des virus recombinants. Les exigences minimales pour la recombinaison homologue ciblée pendant la réplication de la vaccine ont été déterminées, ce qui permet de simplifier la génération de construction. Cela a permis l’alliance de la sélection dominante transitoire (TDS) avec un rapporteur fluorescent et une sélection métabolique pour fournir une approche rapide et modulaire aux protéines virales d’étiquette fluorescente. En rationalisant la génération de virus recombinants fluorescents, nous sommes en mesure de faciliter les applications en aval telles que l’analyse d’imagerie avancée de nombreux aspects de l’interaction virus-hôte qui se produit lors de la réplication du virus.

La figure 1 répertorie les différentes constructions requises pour cette procédure, qui sont soit synthétisées(figures 1b et 1c),soit créées par des étapes de clonage(figure 1d). La figure 2 donne un aperçu de la procédure expérimentale avec des images représentatives de plaque fluorescente d’un VCA recombinant A3-GFP représentées pour chaque étape du processus de sélection. Sur la figure 3, onmontre des virus de la vaccine recombinante exprimant des protéines marquées à l’aide de marqueurs fluorescents ciblant les protéines structurelles virales A3 et F13, qui font partie du noyau interne du virus23 et de l’enveloppe externe24,respectivement. Les observations de plaques virales et de cellules infectées pour chacun des virus recombinants créés sont représentées. L’efficacité de la recombinaison homologue des vecteurs avec le génome vacv, contenant aussi peu que 70 bp régions d’homologie à celui-ci, a été testée et les résultats sont représentés à la figure 4. Le succès relatif de l’identification des plaques virales faites de la recombinaison avec des vecteurs contenant l’homologie de 100 points d’ébullition était le raisonnement derrière le choix de synthétiser les bras gauches et droits de longueur de 150 points d’ébullition de l’homologie au gène cible.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Figure 1. Vecteur de recombinaison TDS (Transient Dominant Selection). (a) Vecteur TDS avec marqueurs de sélection gpt et mCherry. (b) Les bras gauche et droit d’homologie sont conçus avec des sites de restriction spécifiques entre les deux et flanquant les bras d’homologie. Les sites de restriction entre les bras gauche et droit utilisés dans cette méthode étaient NotI et BamHI, le site NotI étant également utilisé comme agent de liaison entre le gène et l’étiquette fluorescente. c)Les étiquettes fluorescentes compatibles avec cette méthode sont flanquées de sites de restriction correspondants. Certains tags employés sont GFP (green fluorescent protein), RFP (red fluorescent protein), Cerulean (une amélioration par rapport à ECFP, une protéine fluorescente cyan, par mutagenèse dirigée vers site25)et mini-SOG, une protéine fluorescente fabriquée à partir de GFP qui crée un produit résolvable par EM sur l’éclairage26. (d)Étapes de clonage impliquées dans la génération du vecteur de recombinaison TDS final. L’oligonucléotide synthétisé contenant les bras flanquant gauche et droit est d’abord cloné dans le vecteur TDS. Cela fournit un vecteur de recombinaison dans lequel toute balise de choix peut être transférée dans et hors par clonage dans les sites de restriction incorporés entre les bras gauche et droit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Figure 2. Aperçu de la procédure expérimentale pour créer un virus de la vaccine recombinante. Les événements survenant aux niveaux génétique et cellulaire sont décrits, ainsi que des images de plaque représentatives décrivant les étapes suivant la création d’un virus de la vaccine fluorescent marqué par A3-GFP. (A) Les cellules infectées par le virus de la vaccine sont transfectées avec le vecteur de recombinaison TDS. (B) Dans cette figure, seul le résultat de la recombinaison de gauche est représenté et l’exemple utilise GFP comme étiquette fluorescente de choix. La recombinaison à droite entraînerait l’incorporation du plasmide TDS entier dans le génome d’une manière similaire, sauf que l’étiquette serait fusionnée à l’ensemble du gène cible à l’étape intermédiaire, c’est-à-dire à l’étape C. Un dosage de plaque est effectué sur une monocouche cellulaire avec le mélange de recombinaison et soumis à la sélection GPT. (C) Les plaques présentant à la fois une fluorescence rouge et verte, correspondant respectivement à l’expression mCherry et GFP, sont cueillies et amplifiées. Une fois la sélection supprimée, il y aura perte de fluorescence rouge correspondant à la perte des gènes gpt et mCherry (D)et des plaques présentant exclusivement une fluorescence verte sont cueillies et amplifiées(E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Figure 3. Résultats représentatifs du système de recombinaison TDS. Les images représentent des plaques entières de cellules recombinantes infectant le VCA après 48 heures(a, c, e; barre d’échelle 100 μm), accompagnées d’une image d’une seule cellule infectée par le virus recombinant correspondant après 8 heures(b,d, f; barre d’échelle10 μm). Des gènes correspondant à des protéines localisées par virion ont été sélectionnés pour visualiser les particules virales. A3 est une protéine centrale de la virion vaccinia (a, b) et F13 (c, d ) est une protéine del’enveloppe virale. Un virus à double marquage avec A3 et F13 (e, f) marqués par fluorescence est également montré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Figure 4. Analyse quantitative de l’efficacité de recombinaison entre les vecteurs recombinants et le génome vacv. Des monocouches BS-C-1 ont été infectées par VACV et ont transfecté 1 heure poteau-infection avec trois vecteurs de recombinaison contenant des régions d’homologie de 500 points d’ébullition, de 100 points d’ébullition, ou de 70 points d’ébullition au génome de VACV. Chaque vecteur contenait également la cassette TDS comprenant les gènes de sélection gpt et mCherry. Des cellules ont été récupérées 24 heures poteau-infection et lysées pour libérer les virus de recombinaison formés. Des analyses de plaque ont été exécutées sur des lysats de cellules avec des médias de sélection de GPT et des plaques montrant la fluorescence de mCherry ont été comptées en tant que recombinaison réussies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Figure 5. Carte du vecteur TDS gpt-mCherry montrant le site de clonage multiple. Le vecteur a été décrit précédemment22 et la carte vectorielle a été créée à l’aide de la carte plasmidique EZ v1.9 du Zhang Lab Group (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.

Un protocole rapide et modulaire pour la génération de virus de vaccinia recombinants exprimant des protéines fluorescentement marquées simultanément utilisant la méthode de sélection dominante transitoire est décrit ici.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Cette expérience permet de générer des virus vaccinia recombinants marqués par fluorescence selon une méthode modulaire et rapide fondée sur une sélection transitoire dominante. Tout d'abord, construisez un vecteur recombinant contenant une étiquette fluorescente encadrée par des régions homologues minimales synthétisées, ainsi que des marqueurs destinés à la sélection métabolique et fluorescente. Transfectez ce vecteur de recombinaison dans des cellules infectées et amplifiez les virus recombinants à l’aide d’une sélection métabolique et de la fluorescence. Ensuite, supprimez la sélection métabolique afin d’exciser le cassette marqueur et isolez les cellules contenant les virus recombinants par sélection au marqueur fluorescent. L’analyse des plaques virales sur des monocouches cellulaires permet de visualiser les particules virales individuelles caractéristiques du gène marqué par fluorescence.Nous avons mis au point cette méthode afin de générer des virus recombinants portant plusieurs modifications génétiques, en utilisant une méthode de sélection pouvant être appliquée de façon répétée et universelle, indépendamment du marqueur utilisé. Bien que le principe de la sélection dominante transitoire ait déjà été décrit précédemment, nous souhaitions l'appliquer à une échelle plus grande et de manière modulaire, afin d'obtenir une plus grande flexibilité dans l'introduction de modifications génomiques. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le criblage et l'isolement des plaques virales recombinantes peuvent s'avérer délicats. En effet, leur fréquence peut être faible, ce qui nécessite des méthodes spécifiques pour une récupération efficace du virus.Ainsi, marquez le gène viral d'intérêt à l'extrémité N ou C du protéine. Identifiez en conséquence des régions flanquantes d'homologie de 150 paires de bases. Concevez ensuite une séquence d'oligonucléotides comprenant les bras gauche et droit de 150 paires de bases, séparés par une paire de sites de restriction au choix. Flanquez également cette région d'une deuxième paire de sites de restriction, différente de la première, afin de permettre l'incorporation dans le vecteur TDS une fois la synthèse effectuée. Vérifiez maintenant que l'oligonucléotide avec les sites de restriction est conçu pour être en phase avec le site d'insertion souhaité. Pour la synthèse de l'oligonucléotide, assurez-vous que les sites de restriction intégrés entre les bras gauche et droit correspondent à ceux qui flanquent le cadre de lecture ouvert de la marque fluorescente choisie. Intégrez ces mêmes sites de restriction de part et d'autre de la marque fluorescente par PCR. Clonez le fragment synthétisé dans le vecteur TDS. Clonez également la marque fluorescente dans le vecteur de recombinaison obtenu en utilisant les sites de restriction situés entre les régions d'homologie des bras gauche et droit. Infectez une monocouche de cellules BS-C-1 avec le virus vaccinia dans un milieu sans sérum.Une heure après l'infection, récupérez les cellules avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco. Transfectez avec un mélange de plasmide du vecteur de recombinaison et de réactifs de transfection dans un rapport de trois à un, en milieu sans sérum. Après 24 heures, grattez et récupérez les cellules dans du DMEM ne contenant pas de sérum bovin fœtal. Soumettez les cellules à trois cycles de congélation-décongélation afin de lyser les cellules et libérer les particules virales. Ensuite, pour obtenir une séparation adéquate des plaques individuelles, infectez des monocouches de cellules BS-C-1 à confluence de 100 % avec des dilutions sériées de la préparation de particules virales. Recouvrez avec un milieu liquide contenant 10 % de FBS et du DMEM additionné des réactifs de sélection GPT, puis incubez pendant 24 heures.Aspirez la couche liquide et utilisez un microscope à fluorescence pour rechercher des plaques présentant une fluorescence rouge diffuse correspondant à l'incorporation de M-cherry provenant du vecteur TDS dans le virus. Selon le gène cible et la balise fluorescente choisie, une fluorescence localisée du gène marqueur peut également être observée dans la même plaque rouge.Maintenant, pour chaque virus recombinant, sélectionnez plusieurs plaques, grattez-les avec la pointe de la pipette et transférez les cellules dans un tube Eppendorf à l’aide de 100 microlitres de DMEM contenant 5 % de FBS. Effectuez trois cycles de congélation-décongélation des cellules prélevées afin de libérer les virus recombinants.Ajouter le DMEM contenant le virus congelé-dégelé à une monocouche de cellules dans une plaque de 12 puits afin d'amplifier les virus recombinants avec les réactifs de sélection GPT dans le milieu de croissance. Ensuite, racler les amplifications réussies 24 heures après l'infection. Pour un test de plaque des plaques correctement amplifiées, présentant une fluorescence rouge, ensemencer une plaque de 6 puits avec une monocouche de cellules BS-C-1.Réalisez une dilution sérielle des virus recombinants et infectez les puits avec une dilution croissante de virus dans du DMEM sans FBS. Une heure après l'infection, retirez le milieu liquide et recouvrez chaque puits d'agarose à 0,5 % dans un milieu essentiel minimum complété. Trois jours après l'infection, sélectionnez les plaques présentant une fluorescence rouge ainsi que la couleur du marqueur fluorescent choisi.Amplifiez-les à nouveau sans sélection par la GPT. Choisissez des plaques ayant perdu leur fluorescence rouge diffuse, mais conservant la fluorescence localisée correspondant à la marque au choix. Poursuivez la purification des plaques sans sélection afin d'obtenir un stock pur de virus recombinants ayant perdu les gènes de sélection M-cherry et GPT, mais conservant la fluorescence localisée correspondant à la marque choisie.Évaluer la pureté des stocks à l'aide d'un dosage par plaque, en visant toutes les plaques présentant un phénotype de plaque similaire. Amplifier les stocks viraux testés dans une monocouche de cellules BS-C-1. Après 24 heures post-infection, racler les cellules infectées dans 250 microlitres de DMEM. Centrifuger les cellules infectées, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 500 microlitres de SDS 0,1 % dans un tampon TE. Vortexer pour lyser les cellules. Puis ajouter 500 microlitres de phénol, chloroforme, alcool isoamylique, et inverser pour mélanger. Centrifuger. Récupérer la phase supérieure et répéter l'extraction.Ensuite, pour précipiter l'ADN de la couche aqueuse, ajoutez un millilitre d'éthanol glacé à 100 % et 50 microlitres d'acétate de sodium. Mélangez par retournement et placez l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir centrifugé pour former un culot d'ADN, éliminez tout le liquide, séchez le culot d'ADN à l'air et remettez-le en suspension dans 50 microlitres de tampon TE. Utilisez ce modèle d'ADN génomique pour cribler par PCR l'insertion virale. Générez des virus recombinants portant plusieurs marqueurs comme décrit dans le protocole écrit.Ces virus vaccinia recombinants exprimentent des protéines marquées par des marqueurs fluorescents dirigés contre les protéines structurales virales A3 et F13, qui font partie respectivement du noyau interne du virus et de l'enveloppe externe. Les gènes correspondant aux protéines localisées dans le virion ont été choisis afin de visualiser les particules virales. A3 est une protéine du noyau du virion vaccinia, et F13 est une protéine de l'enveloppe virale.Un virus doublement marqué, portant à la fois A3 et F13 marqués par fluorescence, est également présenté. Une microscopie à fluorescence en temps réel peut être réalisée avec un virus doublement marqué. Dans ce cas, la protéine du cœur interne du virus de la vaccine, A3, est marquée en rouge et la protéine de l’enveloppe externe F13 est marquée en vert.Les particules virales non enveloppées provenant de l'usine à virus sont visualisées en rouge, tandis que les virions enveloppés sont représentés par la colocalisation des canaux rouge et vert. Une analyse quantitative a été utilisée pour déterminer les rendements de recombinaison entre les vecteurs recombinants et le génome du virus vaccinia. L'efficacité de la recombinaison homologue entre les vecteurs et le génome du virus vaccinia peut être détectée avec des régions d'homologie aussi courtes que 70 paires de bases.Cette méthode a permis de créer des virus portant plusieurs marqueurs fluorescents et/ou plusieurs délétions géniques. Ces virus ont été utilisés pour étudier le cycle infectieux du virus, le rôle des protéines virales dans la subversion des systèmes de défense de l'hôte, ainsi que les interactions avec les voies de signalisation de l'hôte. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des virus de vaccine recombinants en utilisant une méthode modulaire quant aux marqueurs utilisés, rigoureuse dans l'identification des recombinants souhaités et applicable dans divers contextes de recherche.

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virus de la vaccine (VV) a été largement utilisé dans la recherche biomédicale et l'amélioration de la santé humaine. Cet article décrit une méthode simple, très efficace pour modifier le génome de VV en utilisant un système CRISPR-cas9.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

HERPESVIRUS de dindons et dindes (HVT) est largement utilisé comme une plateforme de vecteur pour la génération de vaccins recombinants contre un certain nombre de maladies aviaires. Cet article décrit une méthode simple et rapide pour la génération de vaccins recombinants HVT-guidé à l’aide d’un NHEJ-CRISPR/Cas9 intégré et système de Cre-Lox.

Génération des vecteurs recombinants Avian Herpesvirus avec CRISPR/Cas9 gène édition

Il s’agit d’une méthode pour générer des virus vaccinias recombinants « sans cicatrices » à l’aide de la sélection de la gamme d’hôtes et de l’identification visuelle des virus recombinants.

Génération rapide et transparente de poxvirus recombinés à l’aide de la gamme d’hôtes et de la sélection visuelle

Découvrez une méthode modulaire et rapide pour générer des virus vaccinia recombinants marqués par fluorescence en utilisant la sélection dominante transitoire. Ce protocole simplifie les modifications génétiques multiples et améliore le criblage des plages virales fluorescentes.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

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