Initiation de carcinome du sein métastatique en ciblant de l'épithélium canalaire avec adénovirus Cre: un modèle de souris transgénique roman du cancer du sein

L’objectif global de l’expérience suivante est de développer un modèle murin de cancer du sein qui finit par métastaser en présence d’un système immunitaire sain. On y parvient d’abord en administrant un adénovirus exprimant le cri dans le canal canalaire mammaire des animaux de laboratoire. La glande mammaire est ensuite palpée régulièrement pour suivre la progression de la tumeur.

En fin de compte, les métastases tumorales et l’infiltration de leucocytes dans le ganglion lymphatique axillaire peuvent être évaluées par analyse cytométrique en flux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux modèles de tumeurs du sein existants est qu’elle permet l’initiation précise de tumeurs qui peuvent se développer en présence d’un système immunitaire mature, et qui peuvent être suivies par l’expression de YFP. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’injection introductive sont difficiles à apprendre.

Le bon placement de l’aiguille demande de la précision et de la pratique. Le jour de l’expérience, conservez Eloqua de quatre fois 10 des huit unités formant plaque de l’adénovirus Cree sur de la glace sèche, décongelez le virus à température ambiante et mélangez-le avec suffisamment de 3 % de saccharose dans de l’eau stérile pour porter le volume final à 10 microlitres. Ensuite, mélangez doucement 34 microlitres de mem et quatre microlitres de chlorure de calcium fraîchement préparé dans le virus et incubez la solution à température ambiante.

Après 15 à 20 minutes, le milieu apparaîtra trouble, indiquant la formation des précipitations de l’adénovirus. Effleurez doucement le tube pour vous assurer que les particules virales sont uniformément réparties dans toute la suspension, puis pour injecter les particules virales, prélevez trois microlitres du virus dans une seringue de 10 microlitres. Ensuite, placez une souris anesthésiée sur son dos sur la platine éclairée d’un microscope à dissection propre.

Illuminez l’abdomen avec une source de lumière supplémentaire et localisez la quatrième ou la neuvième glande mammaire inguinale gauche par les petites taches blanches de fourrure entourant chaque mamelon. Maintenant, frottez doucement le mamelon avec un applicateur stérile à embout de coton imbibé d’éthanol. Fixez ensuite le mamelon à l’aide d’une pince chirurgicale fine et tirez vers le haut avec une force légère.

Pour retirer le bouchon de kératine, stabilisez le mamelon entre les pinces et insérez doucement l’aiguille entre les pointes. En canulant le canal canalaire à un angle de 90 degrés pour assurer la bonne profondeur d’injection, tirez doucement l’aiguille vers le haut après l’avoir insérée dans la lumière du conduit, en tirant le mamelon vers le haut le long des bords de l’aiguille au fur et à mesure qu’il est tiré vers le haut. Lorsque l’aiguille est correctement placée, plongez doucement tout le contenu de la seringue.

La tétine doit gonfler légèrement au fur et à mesure que le liquide est ajouté. Après l’injection, replacez la souris sur le coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle commence à se remettre de l’anesthésie. Remettez ensuite l’animal dans une cage propre et surveillez-le jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement.

Palper la glande à mémoire injectée au jour 30 pour l’évaluation de l’élargissement et de l’enflure de la glande. Surveillez la progression de la tumeur tous les cinq à sept jours. Une fois qu’une glande mammaire enflée et élargie est observée, mesurez les volumes tumoraux tous les trois à quatre jours pour la cinétique de croissance tumorale.

Une fois que les tumeurs palpables apparaissent, le ciblage réussi de l’arbre canalaire mammaire peut être visualisé en préparant des montures entières de la glande mammaire après l’injection de trip et bleu pour vérifier l’injection correcte ou après l’injection d’un adénovirus exprimant M cherry pour vérifier la préparation virale correcte et l’infection des cellules épithéliales ductiles. Lorsque des tumeurs sont induites chez des souris transgéniques F Fluxed P 53 LSLK RAs, les tumeurs initiales ne deviennent apparentes que vers le 40e jour, lorsque les glandes mammaires deviennent élargies et enflées. À partir du 56e jour environ, les tumeurs commenceront à croître de manière exponentielle.

À ce stade, il est essentiel de mesurer les volumes tumoraux tous les trois jours. Si des études cinétiques sont souhaitées, comme il y aura une variabilité normale d’une souris à l’autre dans la progression tumorale, de grandes masses abdominales seront apparentes au jour 80, après quoi les souris devraient être euthanasiées si les tumeurs dépassent plus de 10 % du poids corporel de l’animal. L’analyse de l’ADNC de trois lignées cellulaires dérivées de tumeurs du sein chez des souris transgéniques flux P 53 LSL KRAS a révélé que les tumeurs expriment la mésothéline cytokératine huit, HER deux nouveaux et le récepteur d’œstrogène alpha, similaire au microenvironnement cellulaire dans le cancer du sein humain L’infiltration des cellules T alpha, bêta et gamma delta, ainsi que des cellules suppressives dérivées de myéloïdes et des macrophages dans les tumeurs est observée.

Le système vasculaire qui se draine vers le ganglion lymphatique axillaire commencera à s’engorger avant que les tumeurs ne se soient développées et finira par englober tout le tissu mémoire où l’injection a été effectuée. Il y aura également un engorgement évident de la veine épigastrique superficielle entre les ganglions lymphatiques inguinaux et axillaires. Après sept à huit semaines, le ganglion lymphatique axillaire s’élargit en raison de l’invasion lymphovasculaire des cellules tumorales.

L’invasion lymphovasculaire et les métastases des cellules tumorales peuvent être suivies en croisant des souris transgéniques Flocked P 53 LSLK RAs avec des souris L-S-L-E-Y-F-P. Après l’excision pré-médiade, des cellules exprimant à la fois des niveaux élevés et faibles de YFP sont détectées dans la tumeur et leurs métastases peuvent être retracées jusqu’au ganglion lymphatique axillaire drainant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur une cohorte expérimentale de 20 souris en deux à trois heures si elle est correctement exécutée.

À la suite de cette procédure, d’autres modèles tumoraux peuvent être développés en croisant des souris avec des verrous supplémentaires, des transgènes p, pour répondre à des questions telles que : comment différents oncogènes affectent-ils la pathologie, le microenvironnement immunitaire et l’invasion métastatique du cancer du sein.