Name: Après en temps réel limpact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Découvrez le suivi en temps réel des infections à Streptococcus pneumoniae chez la souris par imagerie bioluminescente. Cette méthode permet d'évaluer la virulence bactérienne et la progression de la pneumonie.

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La recherche dans le laboratoire a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) et le ministère fédéral de l&#39;Éducation et de la Recherche (BMBF) génomique d&#39;infection médicale (FKZ 0315828A) à SH.

Les expériences d&#39;infection animale décrites ici doivent être effectuées en stricte conformité avec la (par exemple le droit européen de la santé de la Fédération des animaux de laboratoire Sciences associations (FELASA)) locale et internationale guidelines et règlements pour l&#39;utilisation d&#39;animaux vertébrés. Les expériences doivent être approuvés par le Comité de protection des animaux institutionnels comité d&#39;éthique local et. Toutes les expériences avec S. pneumoniae dans le laboratoire ou les infections animales sont réalisées dans un cabinet de biosécurité de classe II. Une. Préparation de la Banque infectieuses de bioluminescentes Pneumocococi <ol><li> Préparer cultures stock pneumocoque dans un bouillon Todd-Hewitt additionné de 1% (p / v) d&#39;extrait de levure et une concentration finale de 20% de glycérol pour la maintenance à 80 ° C. </li><li> Plaque une petite quantité de stock de culture pneumocoque surgelés sur une plaque de gélose au sang et incuber les bactéries pour 10 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2. Til plaque de gélose au sang contenant les antibiotiques appropriés, tels que la kanamycine (150 pg / ml) pour l&#39;insertion du transposon de la cassette de gène dans le génome luxABCDE. </li><li> Sous-cultiver une nouvelle colonie sur une nouvelle plaque de gélose au sang pour un maximum de 10 heures. </li><li> Inoculer un milieu THY complété avec 10% (v / v) inactivé par la chaleur (30 min à 56 ° C) de sérum fœtal bovin (FBS) par des pneumocoques et de commencer la culture à une DO 600 de 0,05-0,07. </li><li> Incuber les pneumocoques sans agitation à 37 ° C et 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que la culture atteint une DO600 de 0,35 à 0,40. Croissance prendra entre 3-4 heures. </li><li> Récolte des pneumocoques par centrifugation à 3750 xg pendant 10 min et remettre en suspension les pneumocoques bioluminescent dans du tampon phosphate salin à pH 7,4 (PBS) supplémenté avec 0,5% de FBS. </li><li> Ajuster l&#39;inoculum à la concentration désirée dans PBS/10% de FBS. La dose dépend de l&#39;infection par la souche pneumococcique utilisé et l&#39;arrière-plan génétique du microe. Pour infecter consanguine souris CD-1 par voie intranasale avec S. pneumoniae D39 lux la dose d&#39;infection doit être ajustée à 1 x 10 7 CFU dans une suspension de 20 ul supplémenté avec 90 parts de la hyaluronidase. Ne pas secouer ou vortex pneumocoques, car cela va déclencher autolyse. </li><li> Vérifier la concentration d&#39;inoculum par étalement des dilutions en série 10 de pliage sur une gélose au sang et le dénombrement des colonies après culture pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Vérifier la bioluminescence de l&#39;inoculum à pneumocoques en mesurant la bioluminescence en utilisant un système d&#39;imagerie optique. </li></ol> 2. Intranasale et l&#39;infection par voie intrapéritonéale des souris avec bioluminescentes pneumocoques <ol><li> Utilisez la souris consanguine de femmes dans l&#39;âge de 7-10 semaines pour la pneumonie aiguë et modèle de septicémie. Le poids de ces souris devrait se situer entre 20 à 30 g. </li><li> Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de kétamine et de xylazine. Préparer un mélange de 1,0 mgkétamine et de xylazine 0,1 mg dans 100 ul de 0,9% stérile (p / v) de chlorure de sodium pour les souris ayant un poids corporel de 20 g. Ceci est cohérent avec une dose de 50 mg / kg de poids corporel de la kétamine et 5 mg / kg de poids corporel pour la xylazine. Pour être précis, peser souris avant l&#39;injection de l&#39;anesthésique. </li><li> Injecter le mélange dans la cavité intrapéritonéale et placer les animaux dans la cage jusqu&#39;à ce que les anesthésiques agissent et les animaux sont narcose. La respiration de souris va devenir très lent et régulier. Les souris doivent être entièrement narcotisé, de sorte que l&#39;inoculation intranasale et l&#39;inhalation de la suspension bactérienne ne donneront pas lieu à des éternuements et, par conséquent, une perte d&#39;inoculum. Ceci peut être évalué par le pincement de la souris à la fin de leur queue, une souris entièrement narcotisé manquera de réactivité. </li><li> Prendre doucement une souris narcose et maintenez la souris entre les doigts et le pouce avec le nez en position verticale (figure 1). </li><li> Utiliser une pipette avec de longues pointes étroites (Gel LoaderConseils) et déposez-les pneumocoques bioluminescentes dans plusieurs petites gouttelettes sur les narines (10 pl / narine) de la souris 26-29. La souris involontairement inhaler les bactéries. Maintenez la souris 1-2 min verticale et observer si la souris éternue ou maintient l&#39;inoculum. </li><li> Infecter vieux 7-10 semaines souris CD-1 par voie intranasale avec une dose d&#39;infection de 1 x 10 7 et 7,5 x 10 7 pneumocoques de souche D39 et TIGR4, respectivement, afin de contrôler l&#39;infection en temps réel. La limite de détection pour le système sans aucune absorption par le tissu de l&#39;hôte est de 1 x 10 6 bactéries bioluminescentes. </li><li> Infecter des souris par voie intrapéritonéale (IP) afin d&#39;évaluer la virulence et BioImage de pneumocoques dans un modèle de sepsis infection de la souris. Utilisation de 5 x 10 3 CFU dans 100 ul de la souche D39 et 1 x 10 4 de la souche TIGR4. Souris ne sont pas anesthésiés en utilisant le routage IP. </li><li> Inoculer les souris de contrôle avec du PBS. <img alt="Figure 1" fo:content-width = &quot;5 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figure 1. Infection intranasale de souris CD-1 avec S. pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . </li></ol> 3. Visualisation pneumocoque diffusion dans le poumon et sang en utilisant le système d&#39;imagerie La diffusion de l&#39;image pneumocoques après infection par voie intranasale des souris CD1 femelles non consanguines en temps réel en utilisant un système d&#39;imagerie in vivo dans. <ol><li> Allumez le système d&#39;imagerie et lancer le logiciel d&#39;analyse d&#39;image situé sur l&#39;ordinateur preconfigurated. </li><li> Le système d&#39;imagerie et initialise automatiquement la caméra CCD est refroidi thermoélectriquement à 90 ° C avant d&#39;être actif. </li><li> Les réglages et binning dépendent du nombre de souris mesuréen même temps et sur la puissance du signal de bioluminescence. Le champ de vision (FOV) pour surveiller la bioluminescence des animaux est variable et le grossissement varie entre un champ de vision de 22,5 cm pour mesurer cinq souris, et un champ de vision de 3,9 cm pour mesurer un simple clic ou parties de l&#39;animal comme la poitrine ou la tête. </li><li> Utilisez systématiquement un temps d&#39;exposition de 1 min, un degré moyen de catégorisation, et un champ de vision de 22,5 cm (ensemble D). Tout d&#39;abord, sélectionnez le mode d&#39;imagerie de luminescence et puis définissez les paramètres d&#39;imagerie. </li><li> L&#39;émission du signal peut dépendre de la souche bactérienne et de la souche de souris utilisée, et le pigment de la souris. Raser le thorax de la souris lors de l&#39;utilisation, par exemple souris C57BL / 6, ce qui peut être avantageux lorsque l&#39;imagerie du développement de la pneumonie chez ces souris. </li><li> L&#39;image des souris infectées à des intervalles de temps préalablement choisie. Mesurer la bioluminescence de la souris dans le modèle de pneumonie aiguë à des intervalles de temps de 8-12 heures au maximum. Surveillez aussi le bien-être des souris infectées par observing leur apparence, le comportement et la détermination de la perte de poids. </li><li> Anesthésier les souris dans la chambre narcotique du système d&#39;anesthésie de l&#39;équipement de formation d&#39;image avant que les mesures effectuées dans la chambre. Lancer inhalation d&#39;un mélange d&#39;isoflurane et de l&#39;oxygène et attendre que les souris respirent lentement et régulièrement. </li><li> Placer les animaux anesthésiés dans la chambre de formation d&#39;image du système et conserver les souris dans la position couchée sur le dos. La caméra CCD sur le dessus de la chambre sera alors l&#39;image de la voies respiratoires murin. </li><li> Placez les animaux avec leur nez dans des tubes pour permettre l&#39;inhalation des anesthésiques. </li><li> L&#39;isoflurane entrée dans la chambre de formation d&#39;image par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube à gaz est autorisé à maintenir une anesthésie. </li><li> Pour activer la caméra CCD sur le dessus de la chambre et de commencer à l&#39;imagerie optique de bioluminescence, appuyez sur &quot;Acquire&quot; dans le logiciel d&#39;imagerie. Immédiatement une photographie de la souris dans la chambre fermée apparaît sur l&#39;écran. Après une minute d&#39;<html> mesure d&#39;une superposition des données de bioluminescence et la photo est affiché. </li><li> Arrêtez l&#39;anesthésie après la superposition d&#39;image apparaît dans la fenêtre du logiciel et de mettre les souris de nouveau dans leurs cages. </li><li> Les souris sont surveillés pour la récupération. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2. Anesthésie et la surveillance des souris infectées par des pneumocoques bioluminescente utilisant l&#39;anesthésie IVIS et système IVIS du spectre, respectivement. A) Le système IVIS Spectre de formation d&#39;image. B) Le système d&#39;anesthésie IVIS avec la chambre d&#39;incubation. C) de souris anesthésiées dans la chambre d&#39;incubation . D) Souris situé dans la chambre d&#39;imagerie IVIS spectre avec le nez inhalation de l&#39;anesthésique._blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. </li></ol> 4. Quantification et l&#39;évaluation de la bioluminescence des souris infectées avec des bioluminescentes S. pneumoniae <ol><li> Déterminer les intensités de bioluminescence des souris ou d&#39;une région sélectionnée de la souris par la quantification de l&#39;émission de photons totale (photons / seconde) en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li><li> Utilisez les valeurs de l&#39;émission de photons qui sont fournis dans une feuille de données Excel pour préparer un graphique. Depuis la variation des données est souvent élevé dans les souris groupés, générer un graphique boîte à moustaches pour voir les différences chez les souris infectées par les différentes souches de pneumocoques. </li><li> Fournir les photons par souris ou encore les résultats que la moyenne de rayonnement (photons / sec / cm 2 / sr) d&#39;une zone sélectionnée. </li><li> Les données de mesure de ROI (région d&#39;intérêt) en mode de photons peuvent être quantitativement comparés entre différents systèmes d&#39;imagerie in vivo avec différents sont venusparamètres de ra, puisque les mesures en unités de rayonnement prennent automatiquement en compte les paramètres de l&#39;appareil photo (par exemple le temps d&#39;intégration, binning, f / arrêt, et le champ de vision). </li></ol>

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<li>Hartel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+central+carbon+metabolism+of+Streptococcus+pneumoniae+by+isotopologue+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling.</a> J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).</li>
<li>Hammerschmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+immune+regulator+factor+H+interacts+via+two+contact+sites+with+the+PspC+protein+of+Streptococcus+pneumoniae+and+mediates+adhesion+to+host+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells.</a> J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).</li>
<li>Voss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choline-binding+protein+PspC+of+Streptococcus+pneumoniae+interacts+with+the+C-terminal+heparin-binding+domain+of+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li>
<li>Cartwright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+disease+in+western+Europe%3A+burden+of+disease%2C+antibiotic+resistance+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management.</a> Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).</li>
<li>vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pneumococcal+isolates+from+pets+and+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Brehm,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+the+adenine+methylase+gene+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+pAM+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1.</a> Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

<html> Toutes les expériences menées sur des animaux doivent être approuvés par les autorités locales et les commissions d&#39;éthique. Expériences in vivo d&#39;infection dans la charge bactérienne dans les différents créneaux d&#39;accueil des animaux infectés doit être déterminée à différents moments après l&#39;infection. Dans ces conditions expérimentales, les animaux doivent être sacrifiés avant l&#39;isolement des bactéries à partir du sang, du nasopharynx, lavage bronchoalvelar, ou d&#39;organes...

Infections des voies respiratoires causées par des virus ou des bactéries restent l&#39;un des problèmes les plus courants cliniques acquis communautaires ou à travers le monde causant environ un tiers de tous les décès dans le monde. Les espèces bactériennes clés sont Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae 2. Cependant, ces espèces bactériennes sont habituellement des constituants communs de la flore naturelles respiratoires des voies. Ainsi chariot de bactéries est également certain risque de maladie invasive et en fonction de l&#39;état immunitaire ou prédispositions des individus. La colonisation asymptomatique est déclenché pour les infections invasives. Streptococcus pneumoniae est le principal agent pathogène de la pneumonie communautaire (PAC) et l&#39;une des causes les plus courantes de bactériémie chez les humains. Chez les individus sains S. pneumoniae (pneumocoque) sont souvent asymptomatiques colonisateurs et inoffensifs des voies respiratoires supérieures, où ils sont confrontés à des bactéries non pathogènesde la flore résidente, mais aussi par des agents pathogènes tels que Haemophilus spp. ou Staphylococcus aureus et la première ligne du système immunitaire humain de la défense. Les taux de portage sont les plus élevés chez les jeunes enfants (37%) et encore plus élevé dans les centres de soins de jour bondés (58%) 3-5. La population la plus jeune et les personnes âgées recevant le pneumocoque par la transmission par aérosol des transporteurs et des sécrétions naso-pharyngées 6, appartiennent à des groupes à haut risque et la vaccination à l&#39;aide de l&#39;un des vaccins antipneumococciques conjugués (de PCV10 ou PCV13 chez les enfants et 23-valent polysaccharide PPSV23 chez les adultes) Il est recommandé aux États-Unis (US) et de nombreux pays européens 4. Le PPSV23 couvre sérotypes responsables de ~ 90% des maladies pneumococciques bactériémiques aux États-Unis et en Europe, la prévention des maladies pneumococciques invasives ainsi efficacement (IPD) chez les adultes, tandis que les PCVs couvrent les sérotypes les plus fréquents chez les enfants. Par conséquent, IPD en raison de types de vaccins (VT) sont redusérotypes non vaccinaux ced mais présentant un potentiel de virulence élevée et résistance aux antibiotiques ont émergé 4,7-12. Le nasopharynx que le réservoir est le point de départ pour les pneumocoques se propager aux sinus ou des oreilles moyennes initiateurs infections locales dangereuses. Plus important encore, les pneumocoques se propager directement par la voie aérienne pour les bronches et les poumons entraînant mortelle PAC 4,13. Les infections pulmonaires sont souvent accompagnés de tissus et destruction de la barrière, permettant ainsi à l&#39;agent pathogène de se propager dans le sang et provoquer IPD. Les incidences de la PAC et IPD sont les plus élevés chez les personnes immunodéprimées ou aux extrêmes de 4,13 ans. Les circonstances responsables de la conversion d&#39;un commensal à un agent pathogène à haute virulence sont encore en discussion. Toutefois, outre l&#39;évolution de la sensibilité de l&#39;hôte et adaptation évolutive accompagnée de virulence plus élevée et l&#39;augmentation des résistances aux antibiotiques ont été suggéré d&#39;avoir un impact crucial sur pneinfections umococcal 14-16. L&#39;agent pathogène est doté d&#39;une multiplicité d&#39;adhésines médiatrices contact intime de cellules épithéliales des muqueuses. Après avoir surmonté le mucus des voies respiratoires, l&#39;adhésion des pneumocoques à des cellules hôtes est facilitée par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions directes des adhésines de surface exposée avec des récepteurs cellulaires et en exploitant des composants de la matrice extracellulaire ou des protéines sériques comme des molécules de pontage 4,17,18. Pathogènes polyvalents pneumocoques sont également équipées de facteurs impliqués dans l&#39;évasion des mécanismes de défense immunitaire de l&#39;hôte. En outre, ils ont la capacité de s&#39;adapter à différents milieux d&#39;accueil tels que les poumons, le sang et le liquide céphalo-rachidien (LCR), respectivement 5,17,19,20. L&#39;impact des facteurs bactériens sur les réponses de la pathogenèse et d&#39;accueil inflammatoire est étudiée dans des modèles animaux expérimentaux de la pneumonie, la bactériémie, la méningite ou 21-25. En dépit d&#39;être un agent pathogène humain, ces modèles sont nousll établi à déchiffrer tropisme pneumocoque de tissu, les mécanismes de virulence, ou protectivity de candidats vaccins contre le pneumocoque. Le fond génétique des souches de souris consanguines détermine la susceptibilité à pneumocoques. Des souris BALB / c infectées par voie intranasale les pneumocoques se sont révélés être résistants, alors que les souris CBA / Ca et SJL étaient plus sensibles contre les infections à pneumocoque 22. Cela implique que, comme pour les humains, la génétique et les mécanismes de défense de l&#39;hôte de déterminer le résultat de l&#39;infection. Par conséquent, des efforts supplémentaires sont nécessaires pour démêler locus de résistance dans le génome de la souris moins sensibles aux infections pneumococciques. Les résultats ont conduit à des changements in vivo dans des protocoles de virulence. Au lieu des souris BALB / c consanguines souvent utilisés dans le passé, les souches de souris consanguines très sensibles de CD-1/MF1 sont aujourd&#39;hui souvent utilisées pour étudier l&#39;effet de la virulence ou d&#39;adaptation à pneumocoques perte de fonction de facteurs 26-28. En outre, la disponibilitédes pneumocoques bioluminescentes et techniques d&#39;imagerie optique permet en temps réel bioluminescence bio-imagerie des infections. En pneumocoques la cassette du gène luxABCDE optimisé (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) a été inséré dans un site unique d&#39;insertion du chromosome par mutagénèse par transposon. Pneumocoques Bioluminescent ont été employés pour évaluer l&#39;atténuation de mutants pneumococciques virulence ou déficients en facteurs de remise en forme et de leur translocation d&#39;un site anatomique dans un autre 26,28-31. Ici, nous fournissons un protocole pour la bio-imagerie des infections à pneumocoque dans une pneumonie murine ou modèle de septicémie. L&#39;amplification et la diffusion des pneumocoques chez des souris par voie intranasale bioluminescent ou infectées par voie intrapéritonéale peuvent facilement être contrôlées au cours du temps en utilisant un système d&#39;imagerie optique et le même animal, à différents points dans le temps.

<table><tbody><tr><td>Bouillon Todd Hewitt</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>X936.1</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>2363.2</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaques de gélose au sang</td><td>Oxoid, Wesel, Allemagne</td><td>PB5039A</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>T832.2</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Érythromycine</td><td>Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Allemagne</td><td>E6376</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Laboratoires PAA, Coelbe, Allemagne</td><td>A11-151</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Souris CD-1, femelle</td><td>Charles River, Sulzfeld, Allemagne</td><td>CD1SIFE06W08W</td><td>souris CD-1 femelles, âgées de six à huit semaines</td></tr><tr><td>Ketamin 500 mg, Curamed solution injectable</td><td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Allemagne</td><td></td><td>.</td></tr><tr><td>Rompun 2 %, solution d’injection</td><td>Bayer Animal Health, Monheim, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1 ml seringues</td><td>Becton Dickinson, Heidelberg, Allemagne</td><td>300015</td><td>seringues stériles Luer-Lok avec aiguille</td></tr><tr><td>Gel Loader Tips</td><td>PeqLab</td><td>81-13790</td><td>M&micro ; ltiFlex Tips</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884-100mg</td><td>Hyaluronidase Type IV-S de Bovin</td></tr><tr><td>test Oxygen</td><td>Air Liquide, D&uuml ; sseldorf, Allemagne</td><td>M1001L50R2A001</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig ; heim, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy</td><td>Promega, Mannheim, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Oligonucléotides&nbsp ;</td><td>Eurofins MWG, Ebersberg, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Qiaprep Spin Midiprep Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>27104</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de purification d’ADN PCR</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>28106</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Logiciel Living Image 4.1</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>XGI-8 Système d’anesthésie gazeuse</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Système d’imagerie spectrale IVIS·nbsp ;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Biophotomètre</td><td>Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

après en temps réel l&#39;impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

La pneumonie est l&#39;un des principaux problèmes de santé dans les pays en développement et les pays industrialisés et est associée à une morbidité et une mortalité considérables. Malgré les progrès dans la connaissance de cette maladie, la disponibilité des unités de soins intensifs (USI), et l&#39;utilisation d&#39;agents antimicrobiens puissants et des vaccins efficaces, les taux de mortalité restent élevés 1. Streptococcus pneumoniae est le principal agent pathogène de la pneumonie communautaire (PAC) et l&#39;une des causes les plus courantes de bactériémie chez l&#39;homme. Cet agent pathogène est équipé d&#39;un arsenal de adhésines de surface exposée et facteurs de virulence qui contribuent à la pneumonie et les maladies invasives à pneumocoques (IIP). L&#39;évaluation du rôle in vivo de facteurs de forme physique ou virulence bactérienne est de la plus haute importance à démêler S. mécanismes de pathogénicité pneumoniae. Les modèles murins de la pneumonie, la bactériémie et la méningite sont utilisés pour déterminer l&#39;impact des facteurs de pneumocoques à différents stades de l&#39;infection. Ici, nous décrivons un protocole pour surveiller en temps réel la diffusion pneumocoque chez la souris après des infections par des bactéries bioluminescentes intrapéritonéale ou intranasale. Les résultats montrent la multiplication et la diffusion des pneumocoques dans les voies respiratoires inférieures et du sang, qui peut être visualisée et évaluée en utilisant un système d&#39;imagerie et le logiciel d&#39;analyse d&#39;accompagnement.

L&#39;acquisition et l&#39;utilisation de la méthionine est d&#39;une importance centrale pour les pneumocoques pour se maintenir en forme dans leur créneau d&#39;accueil 32,33. La méthionine transporteur ABC lipoprotéine est codé dans D39 par le SPD _ 0151 gènes (TIGR4: sp_0149) et nommé MetQ 32. Pneumocoques produire plus d&#39;enzymes de biosynthèse de la méthionine (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, Mete et METF). L&#39;absence de méthionine dans un m...

Streptococcus pneumoniae est l&#39;agent pathogène menant pneumopathies sévères acquis communautaire et responsable de plus de 2 millions de décès dans le monde. L&#39;impact des facteurs bactériens impliqués dans la virulence de remise en forme ou peut être contrôlé en temps réel dans une pneumonie ou une bactériémie modèle de souris en utilisant des bactéries bioluminescentes aiguë.

Après en temps réel l&#39;impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

L'objectif général de cette procédure est de suivre en temps réel une infection à streptococcus pneumonia dans un modèle de pneumonie ou de sepsie aurin. Cela est réalisé en préparant une dose d'infection de streptococcus pneumonia après culture dans le milieu complexe THY. La deuxième étape consiste à infecter des souris par voie intranasale ou intrapéritonéale avec streptococcus pneumonia.La dernière étape consiste à quantifier la bioluminescence, les intensités des souris ou d'une région sélectionnée des souris afin d'obtenir les émissions totales de photons. En fin de compte, les intensités de bioluminescence d'un groupe de souris montrent l'évolution de l'infection au fil du temps. En outre, une analyse des images individuelles de souris bioluminescentes est réalisée.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la détermination de la charge bactérienne dans le poumon ou dans différents tissus, est qu'elle permet de suivre l'infection systémique en utilisant un seul animal. Les implications de cette technique s'étendent à la recherche fondamentale, car elle peut également être appliquée pour évaluer le rendement de facteurs bactériens et d'agents anti-infectieux. Cette méthode peut fournir des informations sur ce lot de promo Cox chez la souris.Il peut également être appliqué à d'autres systèmes, comme la détermination de la charge bactérienne dans les organes. En général, les chercheurs trouveront facilement à apprendre cette méthode, car l'utilisation du système de bioimagerie est simple et un logiciel est disponible pour préparer les images. J'ai immédiatement eu l'idée d'appliquer cette méthode dans des expériences d'infection avec du bios et de l'oxyde primo lorsque j'ai été initié au système de bioimagerie.La réalisation de cette méthode est cruciale en raison de la manipulation particulière requise pour les animaux, et parce que certaines étapes essentielles, telles que l'inoculation, sont difficiles à expliquer. Commencez par préparer un stock de pneumocoques bioluminescents infectieux, comme indiqué dans le protocole écrit. Ensuite, inoculez un tube contenant 40 millilitres de milieu THY enrichi en FBS avec les pneumocoques, et démarrez une culture à une DO 600 de 0,08. Incubez les pneumocoques sans agitation à 37 degrés Celsius et sous 5 % de dioxyde de carbone pendant trois à quatre heures, jusqu'à ce que la culture atteigne une DO 600 comprise entre 0,35 et 0,40.Ensuite, récolter les pneumocoques par centrifugation à 3 750 ×g pendant six minutes. Puis éliminer le surnageant et resuspendre le culot bactérien dans environ un millilitre de PBS à pH 7,4, supplémenté avec 0,5 % de FBS. Ajuster l'inoculum à la concentration souhaitée dans une suspension de 20 microlitres de PBS contenant 10 % de FBS et 90 unités d'hyaluronidase.Ne pas agiter ni vortexer les pneumocoques, car cela déclencherait une autolyse. Ensuite, utiliser un système d'imagerie optique pour vérifier la bioluminescence du pneumocoque oulu. Anesthésier une souris femelle non consanguine âgée de sept à dix semaines par injection intrapéritonéale de kétamine et de xylazine. Vérifier la profondeur adéquate de l'anesthésie en pinçant la queue.Une fois l'anesthésie complète obtenue, maintenez la souris entre les doigts et le pouce avec le museau orienté vers le haut. À l’aide d’une pipette munie d’une longue pointe étroite, déposez alors 10 microlitres des pneumocoques bioluminescents sur chaque narine. La souris inhale involontairement les bactéries.Retenez la souris verticalement pendant une à deux minutes pour observer si elle éternue ou conserve l'inoculum. L'inhalation de la dose infectieuse doit être assurée afin que la souris inspire la dose d'infection choisie. Par conséquent, la souris doit respirer lentement et régulièrement.Veuillez éviter que la souris éternue et que des parties de la dose d'infection soient perdues. Après une inoculation réussie, marquer la queue pour une identification ultérieure et placer la souris dans une nouvelle cage.Ensuite, pour évaluer la virulence dans un modèle d'infection de septicémie, injecter 100 microlitres d'une souche de pneumocoque par voie intrapéritonéale chez une souris anesthésiée. Après avoir marqué la queue, remettre la souris dans une cage image en tant que témoins. Injecter un autre groupe de souris avec du PBS en imagerie.La dissémination des pneumocoques est réalisée à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image. Tout d'abord, réglez le mode d'imagerie sur luminescent, puis configurez les paramètres d'imagerie comme suit : réglez le temps d'exposition sur une minute.Un degré moyen de binning et un champ de vision (FOV) de 22,5 centimètres. Anesthésier les souris dans la chambre d'anesthésie de l'appareil d'imagerie à l'aide d'un mélange d'iso, de fluorure et d'oxygène. Lorsque les souris respirent lentement, les placer dans la chambre d'imagerie en position dorsale, avec le museau inséré dans des tubes reliés au système d'anesthésie.Pour activer la caméra CCD située au-dessus de la chambre et démarrer l'imagerie optique bioluminescente, appuyez immédiatement sur acquérir dans le logiciel d'imagerie. Une photographie des souris dans la chambre fermée apparaît à l'écran. Après une minute de mesure, une superposition des données de bioluminescence et de la photographie est affichée.Arrêtez maintenant l'anesthésie environ 20 secondes avant la fin de l'exposition. Replacez les souris dans leur cage et laissez-les reprendre complètement conscience avant de remettre la cage sur le support. Continuez à imager les souris infectées toutes les huit à dix heures, en plus de surveiller leur apparence, leur comportement et leur poids.Enfin, utilisez le logiciel d'analyse d'images pour déterminer les intensités de bioluminescence par point temporel et par groupe de souris, en quantifiant l'émission totale de photons. L'imagerie optique bioluminescente de souris infectées par voie intranasale par D 39 lux ou par le mutant isogénique D 39 luxe delta MET Q est présentée ici. L'imagerie a commencé 24 heures après l'infection et s'est poursuivie toutes les huit heures jusqu'au décès ou jusqu'à 120 heures après l'infection pour chaque groupe. Sept souris sur dix ont développé des signes sévères de maladie et sont décédées, tandis que les trois autres souris n'ont montré aucune bioluminescence et ont survécu.Remarquez que la bioluminescence observée chez deux des souris est en réalité un débordement provenant de la bioluminescence intense des souris voisines. Les souris correctement infectées par la souche sauvage bioluminescente D 39 lux ont développé une infection pulmonaire sévère 32 heures après l'infection, qui a évolué en septicémie en huit à 16 heures. Toutes les souris ayant développé une pneumonie et une septicémie après l'infection par D 39 lux étaient décédées 96 heures après l'infection.La perte de fonction de la lipoprotéine de liaison à la méthionine a fortement altéré la virulence des pneumocoques. Après 32 heures, un seul souris infecté avec le mutant mEq présentait une infection pulmonaire faible, comparée aux infections observées chez toutes les souris D 39 lux sensibles. Toutefois, après 48 heures, des infections pulmonaires sévères sont devenues manifestes chez les souris infectées avec le mutant.Par conséquent, ces souris ont développé une septicémie 72 heures après l'infection et sont devenues plus abondantes plus tard, à plus de 72 heures post-infection, démontrant que, dans le modèle d'infection par pneumonie aiguë, le déficit en met Q atténue les pneumocoques. Les valeurs des intensités de bioluminescence des souris regroupées sont indiquées pour les temps précisés. La quantification du flux bioluminescent a révélé des différences significatives entre les souris infectées de type sauvage et celles infectées par met Q, 32 et 40 heures après l'infection.Ainsi, la perte de fonction de met q affaiblit les pneumocoques et entraîne un retard significatif de l'infection invasive, mais ne conduit pas à l'obtention de bactéries virulentes une fois maîtrisée. Cette technique permet de surveiller 10 groupes de quatre souris en une heure, si elle est correctement réalisée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de s'assurer que l'inoculum est complètement inhalé par les souris. Après cette étape, d'autres méthodes, telles que l'infection mixte chez la souris, peuvent également être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'atténuation légère et les mutants bactériens, une fois la technique développée.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des infections pour explorer et visualiser la pneumonie ou la septicémie à pneumocoque chez la souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment infecter des souris et suivre en temps réel une infection pneumococcique à l’aide d’un système de bioluminescence. N’oubliez pas que le travail avec des bactéries pathogènes pour l’homme, telles que *Streptococcus pneumoniae*, peut présenter des risques, et que des précautions, comme travailler sous une hotte de sécurité de classe II, doivent être prises lors de cette procédure.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une infection concomitante par le virus grippal A est l'un des facteurs impliqués dans l'induction de la maladie invasive à pneumocoques pendant...

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

Méthodes pour l'imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d'imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Source : Valentine, M. E., et al. Génération de mutants de délétion de gène dans le cadre chez Pseudomonas aeruginosa et test d’atténuation de la virulence dans un modèle murin simple d’infection. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo démontre l’utilisation de la bioluminescence pour visualiser et comparer le comportement in vivo de souches bactériennes virulentes et atténuées chez la souris. Il décrit la préparation de suspensions bactériennes bioluminescentes et leur injection intrapéritonéale chez...

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Source : de Vries, C. R., et al., Un modèle d’inoculation retardée de l’infection chronique de la plaie par Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo présente une technique d’imagerie bioluminescente pour surveiller la progression de l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. Des bactéries pathogènes conçues avec le système rapporteur luxABCDE émettent de la lumière au site d’infection, permettant la visualisation des bactéries métaboliquement actives. En imageant la...

Imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez la souris

Source : Valentine, M. E., et al., Génération de mutants de délétion génique dans le cadre chez Pseudomonas aeruginosa et test de l’atténuation de la virulence dans un modèle simple d’infection chez la souris. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo démontre l’utilisation d’une approche d’imagerie basée sur la bioluminescence pour surveiller l’infection bactérienne dans un modèle murin vivant. L’imagerie séquentielle bioluminescente et par rayons X permet la visualisation en temps réel et la...

Imagerie en temps réel de l’infection bactérienne dans un modèle murin utilisant la bioluminescence

Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour la modélisation de la pneumonie bactérienne chez les souris. Nous décrivons ici un peu coûteux, un procédé rapide et non invasif destiné à induire une pneumonie par aspiration ( par exemple, inhalation) , d'un inoculum bactérien pipeté dans l'oropharynx. méthodes en aval pour l'évaluation de la réponse immunitaire innée pulmonaire sont également détaillées.

Une méthode non-invasive et technique non-intensif pour Induction et phénotypage of Experimental pneumonie bactérienne chez les souris

Une méthode d’établissement des infections pulmonaires chez les rongeurs immunocompétents est décrite. Avec de l’habileté, cette méthode peut être mise en œuvre rapidement et facilement pour induire une infection stable avec de nombreux isolats de S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae et A. baumannii.

Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

La méthode décrite ici permet la visualisation de l'activation de l'inflammation dépendante du promoteur de l'IL-8 dans les poumons de la souris par une imagerie bioluminescente non invasive (BLI). Le même animal peut être soumis à BLI à plusieurs reprises pendant jusqu'à deux mois à partir du moment de la livraison de la construction de journaliste de luciférase.

Un modèle de souris transmissible transitoirement IL-8 pour le<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi à long terme des réponses inflammatoires

Ici, nous décrivons un protocole simple et reproductible du modèle d'infection de souris pour évaluer l'atténuation des souches génétiquement modifiées de Pseudomonas aeruginosa par rapport à la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis approuvée par Escherichia coli pour des applications commerciales.

Génération de mutants de suppression de gène dans le cadre dans Pseudomonas aeruginosa et essai pour l'atténuation de virulence dans un modèle simple de souris de l'infection

L’infection des souris néonatales avec E. coli bioluminescent O1:K1:H7 a comme conséquence une infection septique avec l’inflammation pulmonaire significative et la pathologie pulmonaire. Ici, nous décrivons des procédures pour modéliser et étudier davantage la septicémie néonatale utilisant la formation image intravitale longitudinale en parallèle avec l’énumération des charges bactériennes systémiques, du profilage inflammatoire, et de l’histopathologie de poumon.

Un modèle néonatal d’imagerie de la septicémie bactérienne gramnégative

Cet article décrit un nouveau modèle murin pour la transition du pneumocoque d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène pathogène au cours d’une infection virale. Ce modèle peut être facilement adapté pour étudier les interactions polymicrobiennes et hôte-pathogène au cours des différentes phases de la progression de la maladie et entre divers hôtes.

Un modèle murin pour la transition de Streptococcus pneumoniae de colonisateur à pathogène lors d’une co-infection virale récapitule la maladie exacerbée par l’âge

Découvrez le suivi en temps réel des infections à Streptococcus pneumoniae chez la souris par imagerie bioluminescente. Cette méthode permet d'évaluer la virulence bactérienne et la progression de la pneumonie.

Après en temps réel limpact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes (Vidéo) | JoVE Journal

Après en temps réel l'impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes

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