Name: Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez la dynamique des granules de stress G3BP dans les cellules primaires en direct. Cette méthode utilise la microscopie confocale time-lapse pour visualiser la formation des granules de stress dans les fibroblastes et les neurones.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier la plate-forme Montpellier Rio Imaging (MRI) où les acquisitions ont été réalisées. Ils remercient Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, et Virginie Georget pour leur aide dans différentes parties du protocole. Ce travail a été soutenu par la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).

Toutes les procédures d&#39;animaux dans ce protocole sont en stricte conformité avec les lignes directrices de la directive du Conseil communautaire européen du 24 Novembre 1986 (86-609/EEC). Maison des souris du groupe, permettant la nourriture et de l&#39;eau ad libitum. Les maintenir dans un environnement contrôlé (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% d&#39;humidité) avec un 12 heures: 12 heures de lumière: cycle d&#39;obscurité (lumière sur à 7h00). 1 Culture de cellules murines primaires:. Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) <ol><li> Autoclave pinces fines, ainsi que des pinces et des ciseaux de dissection courbes. Conserver dans un contenant stérile. Utilisation stérile D-PBS (Phosphate-Buffered Saline de Dulbecco). Préparer un milieu complet MEF: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / F12 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FBS), 1 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 1% d&#39;acides aminés non essentiels, et mM de 2-mercaptoéthanol 0,5 et chaud à 37 ° C. </li><li> Euthanasier une souris enceinte (à 13,5 jours post-coïtum (DPC)) Par dislocation cervicale. Retirez les cornes utérines de la souris aseptisé avec 90% EtOH. Sous une hotte stérile et propre, placer les cornes avec les embryons dans 37 ° C préchauffé D-PBS. Ouvrez le cornes, le lieu les embryons dans une boîte de Petri en plastique stérile 100 mm, les nettoyer de la matière du cordon ombilical et les laver chaud D-PBS pour éliminer l&#39;excès de sang. En vertu d&#39;un binoculaire, enlever les branches de l&#39;embryon, les organes internes et la partie supérieure de la tête contenant le cerveau. </li><li> Dans une nouvelle boîte de Pétri, émincer l&#39; embryons en très petits morceaux avec un instrument chirurgical stérile lame ou des ciseaux (au moins pendant 1 min). Dans le cas d&#39;embryons de différents génotypes, veillez à mettre chaque embryon dans des plats individuels de Petri et de garder la queue ou la tête supérieure pour le génotypage. </li><li> Couvrir l&#39;embryon avec 1x trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 1 mM EDTA). Incuber pendant 30 min à 1 heure dans un incubateur à 37 °. Ajouter 10 ml de completMilieu MEF pour arrêter la réaction de la trypsine. Pipette de haut en bas pour éliminer tous les agrégats. Laisser reposer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml (rempli de milieu complet) pendant 10 min, le surnageant et centrifuger pendant 5 min à 300 x g à température ambiante. Reprendre le culot dans du milieu complet (6 ml d&#39;une embryon). Cellules nucléées viables peuvent être comptées en utilisant trypan bleu (Environ 5 x 10 6 cellules peuvent être attendus d&#39;un embryon). Plaque 3 ml par 60 mm boîte de Petri. </li><li> Changer le support le lendemain et permettre aux cellules de se développer jusqu&#39;à ce que les plats sont confluentes. Beaucoup types de cellules peuvent être vus, mais seules vont survivre sous-culture des fibroblastes. </li><li> Fractionner les cellules et leur permettre de se développer dans des boîtes de 35 mm avec fond en verre (important pour l&#39;expérience laps de temps), jusqu&#39;à 50-70% de confluence pour la transfection. Test de Mycoplasma et des agents pathogènes de la souris. </li></ol> 2. Culture Adaptations dans le cas des neurones <ol><li> La veille de la culture, le manteau 35 mm verre plats de Pétri de fond avec la poly-L-lysine (200 pi de 0,1 mg / ml) sous une hotte stérile et propre, et laisser toute la nuit. </li><li> Le lendemain matin, rincer à l&#39;eau pure stérile, deux fois pendant 5 min et une fois pendant 45 minutes à 1 heure. Remplacer par 2 ml de DMEM plus 10% de FBS et conserver dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Disséquer embryons à 18,5 dpc. Sous une hotte stérile et propre, placer les cornes avec les embryons dans le froid HBSS stérile (solution saline équilibrée de Hank) en 100 mm boîte de Petri. Chiots nouveau-nés peuvent également être utilisés à la place des embryons afin de préserver la vie de la mère et de lui permettre de produire plus de descendants, en particulier dans le cas des animaux transgéniques qui peuvent être difficiles à obtenir. Dans les plats individuels de Petri, prendre chaque embryon ou du nouveau-né et couper la tête avec des ciseaux. Maintenir la tête en insérant pince courbe dans les yeux, couper la peau et ouvrir avec précaution le crâne mou à l&#39;arrièrede la tête jusqu&#39;à ce que les yeux, de chaque côté de la tête. Couper les nerfs optiques et le tronc cérébral, retirez le cerveau, et le mettre dans une nouvelle boîte de Pétri contenant HBSS. En vertu d&#39;un stéréoscope, supprimer toutes les méninges à l&#39;aide de deux pinces fines. Séparer les hippocampes, le cortex ou une autre partie du cerveau en fonction de la structure à étudier. </li><li> Immerger la structure cérébrale disséquée dans 4,5 ml de HBSS froid préparé précédemment dans 15 ml de tubes et de garder sur de la glace jusqu&#39;à ce que la digestion avec la trypsine. Ajouter 0,5 ml de 2,5% de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 15 min à 20 min. Rincer le 3x de la trypsine avec du HBSS, étant extrêmement attention à ne pas jeter les parties du cerveau digérés. </li><li> Remettre en suspension dans 500 pi (hippocampes) à 1 ml (cortex) DMEM plus 10% de FBS et pipette de haut en bas plusieurs fois avec 1 ml micropipette munie d&#39;un embout 1 ml, alors équipé d&#39;1 ml, plus de 200 conseils de pi, jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est aucun agrégat visible. </li><li> Distribuer 100 à 200 pl de suspension cellulaire à chaque botto de verre de 35 mmm plat contenant du DMEM plus 10% de FBS et laisser les neurones adhèrent à 37 ° C pendant au moins 3 h. Remplacer par un milieu complet préchauffé neurone (milieu Neurobasal additionné de 250 uM de L-glutamine et NS21, préparé comme décrit dans Chen et al. 19) et laissé à 37 ° C pour permettre la croissance neuronale. Transfecter les neurones à 5 à 14 jours in vitro (div) (l&#39;efficacité de la transfection est plus élevé après un couple de connexions synaptiques div mais sont mieux établie 7-10 div). </li></ol> 3. Transfection de EGFP-G3BP1 Construct Transfecter des cellules avec un vecteur contenant l&#39;ADNc de votre protéine d&#39;intérêt (l&#39;un des composants de SG) fusionné à un marqueur fluorescent (GFP, YFP, etc), en utilisant 3 ug de plasmide purifié par boîte de 35 mm. <ol><li> Transfecter les FAE en utilisant une méthode commerciale, en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux / Réactifs). </li><li> Transfecter les neurones avec une calciumProcédé phosphate adapté de Xia et al 20 Brièvement.: <ol><li> Préparer les solutions: DMEM-lavage: DMEM contenant 25 mM de KCl; solution de transfection: DMEM-lavage contient 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl 2 10 mM, du rouge de phénol); et une solution de choc: HeBS 1x, 1x DMKY, et DMSO 2% (v / v); et gardez-les à 37 ° C. </li><li> Retirez le support de neurones, filtrat, et le maintenir à 37 ° C. Laver avec du DMEM-lavage puis remplacer par du milieu de transfection et maintenir à 37 ° C au cours de la préparation des précipités d&#39;ADN calcium-phosphate plasmide. </li><li> Dans un tube à centrifuger de 1,5 ml, ajouter (dans cet ordre) Braun eau (volume final de 50 ul), 5 pi de CaCl2 2,5 M et 3 pg d&#39;ADN de plasmide. Déposez ce mélange sur 50 pi de HeBS 2x déjà introduit dans un tube à fond rond en polypropylène. Mélanger le tube par rotation avec la chute. Laissez la forme de précipité à la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter le precipitate goutte à goutte sur les neurones et laisser à 37 ° C pendant 30 à 50 min. </li><li> Remplacer avec une solution de choc pendant 1 min, puis rincer avec du DMEM-lavage et enfin réintroduire le milieu préconditionné. Gardez les cellules à 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualisation de G3BP contenant Assemblée et dynamique SG <ol><li> Remplacez le support des cellules qui contient du phénol rouge par milieu dépourvu de rouge phénol. </li><li> Utiliser un microscope confocal équipé de fluorescence pour les acquisitions. Mettre en marche le système de microscope: une lampe au mercure, un ordinateur, et des lasers. Réchauffez la chambre à 37 ° C au moins 20 minutes avant le début des acquisitions. </li><li> L&#39;expression de plus de G3BP induit la formation spontanée d&#39;un type de SG. Les cellules peuvent donc être observées pour l&#39;ensemble des 24 SG droit h après la transfection sans induction du stress. Sinon, le stress peut être amené à induire en outre l&#39;ensemble de SG. Ajouter arsénite de sodium à 0,5 mM et étoilest l&#39;acquisition immédiatement après l&#39;addition du composé (granules seront bien formés à l&#39;intérieur de 1 heure). </li><li> Ajouter de l&#39;huile à l&#39;objectif à immersion (utiliser 40X 63X ou objectifs) et installer la boîte de Pétri sur l&#39;objectif dans le porte-microscope 35 mm adapté, stabilisée sur le support de la scène. Vérifiez que le plat est plat sinon les acquisitions seront modifiés. Allumez la lumière de fluorescence en fonction de la fluorophore pertinentes et visualiser les cellules transfectées. Désactiver fluorescence fois une cellule d&#39;intérêt est dans le domaine afin d&#39;éviter le blanchiment et la cytotoxicité. </li><li> Dans le &quot;acquérir onglet&quot;, sélectionnez les lasers en fonction de la longueur d&#39;onde d&#39;excitation du fluorophore tag (488 nm dans notre protocole qui utilise G3BP EGFP marqués) et sélectionner la longueur d&#39;émission adaptée pour le PMT (tube photomultiplicateur). Régler la puissance du laser (généralement pas plus de 10%) pour réduire au minimum le bruit et la sursaturation de même que la toxicité, et de régler le gain et le décalage de modifier le rapport signal sur bruit.Numérisation rapide (1000 Hz) afin de minimiser la durée d&#39;exposition au laser (moyenne de la ligne 2, la moyenne de l&#39;image 1). Si vous le souhaitez, définissez les paramètres de la pile de Z pour pouvoir reconstruire l&#39;image en 3D (une étape de Z de 1 um est généralement bien avec les cellules). Déterminer l&#39;intervalle de temps entre chaque acquisition: des intervalles plus petits permettent d&#39;obtenir un film plus cohérente, mais cela peut provoquer une toxicité et de photo-blanchiment (un intervalle de 20 secondes a été utilisé dans les expériences décrites). Durée d&#39;acquisition totale peut varier en fonction du type de stress. Beaucoup de SG contenant G3BP sont formés très rapidement sous traitement de l&#39;arsénite et sont bien visibles après 1 heure de traitement: dans ce cas, choisir rapidement les cellules de filmer et de commencer les acquisitions à droite après le stress, d&#39;une durée totale de l&#39;acquisition de 15 - 20 min largement suffisante pour observer l&#39;assemblage de plusieurs Commissions d&#39;études. </li><li> Enregistrer les images et reconstituer les piles et film en utilisant le logiciel ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+granules%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li>
<li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li>
<li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein%3A+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li>
<li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G3BPs%3A+tissue+specific+expression%2C+chromosomal+localisation+and+rasGAP%28120%29+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li>
<li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC%CE%B1+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp%3A+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li>
<li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+helicase+VIII%3A+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein%2C+an+element+of+the+ras+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li>
<li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha%2C+entry+to+cytoplasmic+stress+granules%2C+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li>
<li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+%28G3BP%29+is+a+modulator+of+USP10%2C+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li>
<li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+G3BP1%2C+the+stress+granules+assembly+factor%2C+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li>
<li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase%2FERK-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li>
<li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2%CE%B1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les étapes les plus critiques dans le protocole concernent la transfection et plus particulièrement les acquisitions de laps de temps, qui doivent être surveillés attentivement afin d&#39;abaisser en bas de la cytotoxicité. Culture de cellules primaires n&#39;est pas une partie difficile, tant que les conditions stériles sont maintenus et la prudence sont prises afin d&#39;éviter des dommages lors de la dissection et de dissociation cellulaire étapes. MEF peut être conservé congelé à début p...

granules de stress (SG) sont des foyers cytoplasmique non-membraneux formé comme une réponse protectrice cellulaire à un stress environnemental, tels que température élevée, le stress oxydatif, hypoxie, choc osmotique, irradiation UV, la privation de glucose, ou une infection virale. Ils peuvent être induits chimiquement par traitement avec des composés comme l&#39;arsénite de sodium, ce qui provoque un stress oxydatif. SG s&#39;accumulent au point mort traduction arrêté messager ribonucléoprotéique (mRNP) Complexes 2, la séquestration des ARNm de la machinerie traductionnelle, et leur assemblage peut être déclenchée par la phosphorylation de eIF2α (facteur d&#39;initiation eucaryote 2 α). SG sont des structures dynamiques qui échangent des composants avec les polysomes et autres granulés comme les P-organismes. Ils constituent un «centre de triage» où ARNm sont triés et traités soit pour la traduction, réamorçage, la dégradation ou l&#39;emballage dans stables mRNP non polysomique 3. L&#39;ensemble de la SGS est rapide but est un processus progressif avec de nombreux petits agrégats initiaux qui confluent en granules plus grands. L&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs chimiques qui perturbent ou stabilisent les microtubules montre que le réseau de microtubules est nécessaire pour la dynamique de la SG y compris les processus ensemble, coalescence et de démontage. L&#39;assemblage dynamique de SG est également favorisée par l&#39;agrégation des protéines liant l&#39;ARN spécifiques (ARN-BP) comme la norme TIA-1 (T-cellule interne antigène-1) et TIAR (protéine liée TIA-1), qui sont capables de dimériser et promouvoir polysome démontage et l&#39;acheminement des ARNm dans SG 4. G3BP (domaine RasGAP SH3 de la protéine de liaison) est telle un ARN-BP qui localise à SG lorsque les cellules sont stressés à l&#39;arsénite ou une température élevée, et la surexpression de G3BP dephosphoryle peuvent induire SG ensemble 5. G3BP est un ARN-BP évolutivement conservées qui a été initialement caractérisée par son interaction avec une protéine d&#39;activation de Ras-GTPase (p RasGAP120 6); mais cette interaction a été récemment revisitée 7. La famille G3BP comprend deux membres chez les mammifères, G3BP1 (dénommé G3BP) et G3BP2 8. Les deux protéines colocalisent SGS, lorsque les cellules sont exposées à un stress 9. G3BPs comprennent un domaine de NTF2 N-terminal a suggéré d&#39;influer sur leur localisation et oligomérisation, suivie riche en proline (PxxP) motifs, puis des motifs C-terminaux associés à la liaison de l&#39;ARN: la canonique ARN motif de reconnaissance (RRM) avec RNP1 et RNP2 motifs conservés , suivie d&#39;un riche (RGG) boîte arginine-glycine. Chose intéressante, l&#39;analyse des différentes parties de la protéine par la construction de différents domaines fusionné à la EGFP a montré que le domaine NTF2-like et le domaine de liaison à l&#39;ARN étaient les plus efficacement recruté pour SG, ce qui suggère l&#39;importance des propriétés de dimérisation et de liaison d&#39;ARN dans l&#39;ensemble de la SGS. Modèles divers ont mis en évidence différentes fonctions des protéines G3BP in vitro 10-13.Perturbation de G3BP chez la souris ont montré l&#39;importance de cette protéine dans la croissance et la survie de développement 14, ainsi que d&#39;un rôle important pour G3BP dans le système nerveux central (SNC), caractérisé par une ataxie et des défauts dans la mémoire de travail spatiale 15. Carence G3BP conduit à altération neuronale et la plasticité calcium homéostasie, établissant un lien direct entre la formation de SG et les maladies neurodégénératives 15. Il est donc important d&#39;être en mesure d&#39;étudier la dynamique de la SG dans des cellules primaires comme les neurones. Ce protocole fournit un moyen simple d&#39;observer l&#39;ensemble de SG contenant G3BP1 dans les cellules primaires sous traitement de l&#39;arsénite. Il peut être utilisé pour étudier l&#39;assemblage SG dans des conditions différentes, par exemple différentes sortes de contraintes. Il peut également être adapté à d&#39;autres granules ou d&#39;autres constituants de la SGS. En effet, ce protocole met l&#39;accent sur ​​G3BP1, mais il ya d&#39;autres marqueurs de granules de stress comme la norme TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragile X Mental Retardation protéine Syndrome) 16, (protéine de liaison à l&#39;ADN de réponse transactive 43) TDP-43 17 ou 18 Staufen. En particulier, les protéines comme la norme TIA-1 / R sont, comme G3BP, nucléation des protéines de liaison d&#39;ARN qui peuvent induire ensemble SG lorsqu&#39;il est surexprimé, même si les différentes SG formés peuvent différer en fonction, la régulation et les transcriptions associés. Transfection de la version fluorophore marqué de l&#39;un de ces composants clés de nucléation ou de SG peut être effectuée à l&#39;image notamment de montage et dynamique SG.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Préchauffage à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Fond de verre B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Traité ou non (traité : augmente l’attachement des cellules adhérentes)</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Préchauffage à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Neurobasal</td><td></td><td>21103</td><td>Préchaud à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Très fine, pointes 0,1 mm (utile pour enlever les méninges)</td></tr><tr><td>Pince courbe</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Très fine, pointes 0,1 mm</td></tr><tr><td>Petits ciseaux</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Peut être utile pour enlever l’hippocampe</td></tr><tr><td>Polyplus transfection Réactif JetPEI&nbsp ;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs transfection, suivre le protocole</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser inversé</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de g3bp stress granules dynamique dans les cellules primaires en direct

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SG peut être visualisé dans les cellules par immunocoloration de composants protéiques spécifiques ou polyA + ARNm. SG sont très dynamique et l&#39;étude de leur assemblage et le destin est important de comprendre la réponse cellulaire au stress. Le déficit en facteurs clés de SG comme G3BP (RasGAP domaine SH3 de Binding Protein) conduit à des anomalies du développement chez les souris et les altérations du système nerveux central. Pour étudier la dynamique de SG dans les cellules d&#39;un organisme, une des cellules primaires de culture de boîtes et de suivre la localisation d&#39;un composant marqué transfectées de SG. Nous décrivons expérience time-lapse pour observer SG contenant G3BP1 en fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Cette technique peut également être utilisée pour étudier GV contenant de G3BP dans les neurones vivants, ce qui est crucial car il a été montré récemment que ces SG sont formées à l&#39;apparition de maladies neurodégénératives comme la maladie d&#39;Alzheimer. Cette approche peut être adaptée à tout autre composant du corps cellulaire et des protéines de granules, et réaliséeavec des animaux transgéniques, ce qui permet l&#39;étude en temps réel de la dynamique des granules, par exemple en l&#39;absence d&#39;un facteur spécifique de ces granules.

Stress formation de granule est important dans la réponse des cellules à un stress, ce qui permet une adaptation de traduction cellulaire avec point mort, jusqu&#39;à ce que l&#39;effort a disparu, associée à la prévention de l&#39;apoptose. Ce dosage permet d&#39;étudier les SG dans les cellules primaires, en suivant la localisation de composants clés de protéines SGS (Figure 1). G3BP, un facteur clé de l&#39;ensemble SG, est présent plutôt diffuse dans le cytoplasme des MEF en culture ou des neurones ...

granules de stress (SG) sont des granules d&#39;ARN cytoplasmiques contenant des particules bloquées ribonucléoprotéiques (RNP), et important dans la réponse cellulaire à différents stress. Dynamique de SG peuvent être suivies dans les cellules vivantes en visualisant la localisation d&#39;un composant marqué de SG dans des cellules primaires transfectées après le stress.

Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier la dynamique des granules ribonucléoprotéiques dans des cellules primaires, en particulier la formation des granules de stress. Cela est réalisé en cultivant d'abord des cellules telles que des fibroblastes embryonnaires de souris ou des neurones hippocampiques provenant d'animaux d'intérêt. Dans un deuxième temps, un composant marqué des granules de stress est transfecté afin de permettre leur visualisation.Ensuite, les cellules sont soumises à un stress et surveillées par microscopie confocale en time-lapse. Les résultats obtenus montrent la dynamique des granules de stress contenant G three BP one dans des neurones mythiques ou miroir et hippocampiques, grâce à leur visualisation directe. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la réponse au stress dans des cellules telles que les neurones.Par exemple, chez la souris, l'extinction de l'ARN, ainsi que l'inhibition de protéines essentielles aux granules de stress, a entraîné des anomalies neuronales. Cette méthode peut donc aider à comprendre les mécanismes sous-jacents à ces observations. Après l'euthanasie d'une souris gravide à E 13,5, désinfecter la souris avec de l'éthanol à 90 % et retirer les cornes utérines sous hotte stérile.Transférez les cornes dans du DPBS à 37 degrés Celsius et retirez les embryons. Transférez les embryons dans une boîte de 100 millimètres. Éliminez les tissus excédentaires et rincez-les avec du DPBS tiède.Maintenant, au microscope, retirez les membres, les organes internes et la partie supérieure de la tête contenant le cerveau. Les sections de la queue ou de la tête peuvent être utilisées pour le génotypage. Hachez finement les tissus restants dans un plat séparé pendant au moins une minute.Ne pas combiner les génotypes s'ils doivent varier au sein de la portée. Recouvrir le tissu haché d'un volume égal de trypsine EDTA et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 10 millilitres de milieu mes complet.Pour arrêter la réaction, desserrer le tissu à l’aide d’une pipette et transférer la suspension obtenue dans un tube de 50 millilitres. Compléter le tube avec du milieu et laisser les éléments se déposer. Ensuite, décantation des cellules en suspension.Ensuite, centrifuger la suspension à 300 G pendant cinq minutes. À température ambiante, reprendre le culot dans six millilitres de milieu complet par embryon. Le nombre de cellules nucléées viables devrait être d'environ 5 millions par embryon.Ensuite, chargez des plaques de 60&nbsp;millimètres avec trois&nbsp;mL de suspension cellulaire et faites-les cultiver. Changez le milieu le lendemain et laissez les cellules croître jusqu'à la confluence. Lorsque les cellules sont repiquées, seuls les fibroblastes survivront.Séparer les plaques confluentes en des boîtes de 35 millimètres avec fond en verre. Faire croître ces boîtes à une confluence comprise entre 50 et 70 %, puis procéder à la transfection.Pour chaque boîte de 35 millimètres, prévoir trois microgrammes de plasmide purifié pour la transfection. L'utilisation d'un kit de transfection disponible dans le commerce sera suffisante. Dans cet exemple, un vecteur exprimant le RAs gap.La protéine de liaison à trois domaines SSH est transfectée. Elle constitue un composant important des granules de stress. La procédure est bien sûr applicable à l'étude de tout vecteur d'intérêt dans les fibroblastes, la veille du prélèvement du petit.Préparer les boîtes revêtues de lysine Pauline en commençant par collecter les embryons provenant de femelles gestantes de 18,5 DPC et en les transférant dans du HBSS dans une grande boîte. Si désiré, des nouveau-nés peuvent être utilisés à la place afin d'éviter l'euthanasie de la mère. Couper la tête et retirer le cerveau.Ensuite, récoltez les cerveaux des petits dans une boîte propre contenant du HBSS sous un microscope. Retirez toutes les méninges à l’aide de fines pinces. Puis séparez les parties souhaitées du cerveau, telles que les hippo campi.Transférez les tissus dans 4,5 millilitres de HPSS froid dans des tubes de 15 millilitres et maintenez-les sur de la glace. Digestez les tissus en ajoutant 0,5 millilitre de solution de trypsine à 2,5 %. Incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes.Ensuite, rincez la trypsine avec trois lavages de HBSS en prenant soin de ne perdre aucun tissu. Resuspendez maintenant les tissus dans un demi-millilitre à un millilitre de DMM contenant 10 % de FBS. Homogénéisez ensuite le tissu en le faisant passer à travers la pipette.Ensuite, passez à une pipette de 200 microlitres et pipetez la solution jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'agrégats visibles. Ajoutez ensuite 100 à 200 microlitres de la suspension cellulaire dans des boîtes de 35 millimètres à fond en verre préparées avec le milieu DMM FBS, puis incubez les boîtes. Après trois heures de culture, remplacez le milieu par le milieu neuronal complet préchauffé pour la durée restante de la culture.Après cinq à 14 jours en culture, transférez les neurones en utilisant la méthode au phosphate de calcium. Vingt-quatre heures après une transfection réussie, les granules de stress commenceront à s'assembler en raison de la surexpression de la G trois BP. Un stress supplémentaire induira davantage l'assemblage des granules de stress ; préchauffez les composants du microscope confocal pendant au moins 20 minutes, y compris le plateau à 37 degrés Celsius.Un porte-plaque de 35 millimètres est nécessaire juste avant la visualisation des cellules. Procédez comme suit. Tout d'abord, remplacez tout milieu cellulaire contenant du phénol rouge par un milieu sans phénol rouge.Commencez l’imagerie des cellules immédiatement. Les granules de stress se formeront en moins d’une heure, de sorte que le stress sera induit après la visualisation des cellules. Il est important de démarrer les acquisitions le plus rapidement possible après l’induction du stress et d’ajuster précisément deux paramètres en fonction du type de cellule et du type de protéine utilisé.L'intensité du laser et la durée des acquisitions sont réduites afin de minimiser la cytotoxicité. Ensuite, observer les cellules avec un objectif à immersion huile de 40 x et 63 x. S'assurer que la plaque est bien à plat dans le support et utiliser la lumière fluorescente de manière minimale.Une fois le champ d'intérêt localisé, utiliser le logiciel pour acquérir les images. Commencer avec une puissance laser de 10 % ou moins, et régler le gain et le décalage afin d'obtenir le meilleur rapport signal sur bruit possible. Balayer à 1000 hertz pour minimiser l'exposition des cellules au laser, régler la pile d'images selon les besoins, et espacer au maximum les intervalles de balayage pour préserver au mieux la santé de la culture.Acquérir les données aussi longtemps que nécessaire : dans les MEF, les granules se forment en 10 minutes et deviennent clairement visibles en une heure. Chez les neurones, le processus est un peu plus lent. L'étiquetage G trois BP devrait fournir un signal raisonnablement intense pendant au moins 45 minutes en utilisant les techniques décrites.La formation des granules de stress a été suivie dans des cellules en culture. La localisation de la protéine marquée G trois BP était diffuse dans le cytoplasme des mythes en culture, ainsi que diffuse dans le cytoplasme des neurones. Après traitement à l'arsénite, les protéines se localisent clairement dans des foyers bien définis et plus gros dans l'un ou l'autre type cellulaire.Il s'agit des granules de stress. Les images prises peuvent être reconstruites en un film accéléré. La première et la deuxième vidéo montrent des fibroblastes réagissant au stress.La troisième vidéo montre la même chose. Dans un neurone hippocampique, les reconstructions Zack offrent une localisation tridimensionnelle de la protéine G trois B bp marquée et fournissent ainsi une perspective différente sur le traçage. Suite à cette procédure, l'immunocytochimie peut être utilisée pour visualiser les composants des granules après différents types de stress et après une auto-fixation.Cela peut répondre à des questions quantitatives concernant la taille et le nombre des différents corps cellulaires dans diverses conditions.

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Processus cellulaires tels que la migration des cellules ont traditionnellement été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Ce rapport décrit une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et l'analyse de la dynamique des protéines dans les cellules de migrer dans un plus physiologiquement pertinents, en trois dimensions de la matrice.

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Cette vidéo présente un test de caractérisation et de quantification des granules de stress chez les mammifères, qui sont constitués d’ARNm, de protéines de liaison à l’ARN (RBP) et de diverses autres protéines.

Un test d’immunofluorescence pour caractériser et quantifier les granules de stress chez les mammifères

Pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes, nous présentons des protocoles utilisant deux lignées de souris transgéniques : les souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et les souris CAG-eGFP-anillin, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire.

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

Nous décrivons une méthode pour l'analyse qualitative et quantitative de la formation de granules de stress dans des cellules de mammifères après que les cellules sont confrontées à des bactéries et à un certain nombre de contraintes différentes. Ce protocole peut être appliqué pour étudier la réponse des granules de stress cellulaire dans une large gamme d'interactions hôtes-bactéries.

Analyse d&#39;immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

Les granules de stress (SG) sont des structures cytoplasmiques non moulues qui se forment dans des cellules exposées à une variété de contraintes. Les SG contiennent des ARNm, des protéines de liaison à l'ARN, des petites sous-unités ribosomales, des facteurs liés à la traduction et diverses protéines de signalisation cellulaire. Ce protocole décrit un flux de travail qui utilise plusieurs approches expérimentales pour détecter, caractériser et quantifier les SG de bonne foi .

Méthodes pour classer les foyers cytoplasmiques sous forme de granulés de stress mammalien

Imagerie de cellules vivantes fournit une foule de renseignements sur des cellules individuelles ou des populations entières qui est inaccessible par cellule fixe d’images seul. Ici, les protocoles d’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions de sort de cellule après un traitement par le paclitaxel drogue anti mitotique sont décrits.

À long terme vivre-cellule d’imagerie afin d’évaluer le sort de la cellule en réponse au Paclitaxel

Ce protocole décrit une méthode simple et pratique pour étiqueter et visualiser direct chromosomes dans les cellules mitotiques en utilisant l’étiquette Histone2B-GFP BacMam 2.0 et un système de microscopie confocale tourne disque.

Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l'imagerie en time-lapse permet à l'utilisateur d'identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d'identifier les défauts mitotiques, et d'analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l'exposition à des médicaments anti-mitotiques.

Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle

Les colorants fluorescents vitaux sont des outils essentiels pour les analyses d'imagerie des cellules vivantes dans la biologie des cellules fongiques modernes. Cet article détaille l'application de colorants fluorescents établis et moins connus pour suivre la dynamique de la membrane plasmatique, l'endo-/exocytose et la morphogénèse de la paroi cellulaire dans les champignons filamenteux.

Application de colorants fluorescents sélectifs de membrane et de mur cellulaire pour l'imagerie de cellules vivantes des champignons filamenteux

Nous présentons un flux de travail librement disponible construit pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans des compartiments cellulaires spécifiques dans des images de microscopie de fluorescence. Ce flux de travail convivial est conçu sur le logiciel open-source Icy et utilise également les fonctionnalités ImageJ. Le pipeline est abordable sans connaissance dans l’analyse d’image.

Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

Le protocole suivant présente la détection de foyers d’ADN simple brin dans la phase G1 du cycle cellulaire en utilisant la synchronisation du cycle cellulaire suivie d’une coloration immunofluorescente RPA2.

Visualisation des foyers d’ADN monocaténaire dans la phase G1 du cycle cellulaire

Découvrez la dynamique des granules de stress G3BP dans les cellules primaires en direct. Cette méthode utilise la microscopie confocale time-lapse pour visualiser la formation des granules de stress dans les fibroblastes et les neurones.

Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

Explorer plus de vidéos