Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Cette technologie microfluidique vise à mesurer la fonctionnalité des neutrophiles humains directement à partir d’une gouttelette de sang sur une plateforme pouvant être multiplexée. La chambre de charge centrale sert de source de sang total et agit également comme un puits pour les gradients d’attractifs de chimiothérapie qui se forment à partir des 16 chambres chimiotactiques focales. La filtration mécanique unique des globules rouges permet de sonder la fonction des neutrophiles dans le contexte naturel des composants sanguins, cellulaires et biochimiques.

La bifurcation entre un canal menant à la chambre chimiotactique focale et un canal sortant du dispositif permet de quantifier et de moduler la directionnalité des neutrophiles en migration. Ainsi, les résultats peuvent démontrer comment les neutrophiles en migration active migrent facilement au-delà des globules rouges piégés et s’accumulent en nombre au fil du temps. L’une des caractéristiques uniques de nos dispositifs microfluidiques est qu’ils sont très faciles à fabriquer et à configurer.

Ils sont constitués d’une couche de PDMS coulée sur une plaquette micro-fabriquée que nous collons sur un fond de verre, une plaque à un ou plusieurs puits. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite qu’une gouttelette de sang total. Les appareils peuvent être utilisés avec des pipettes standard, n’ont pas de pièces mobiles, ne nécessitent pas de tubes ou de pousse-seringues externes.

Les implications de cette technique s’étendent à des applications cliniques par rapport aux nôtres requises avec les techniques traditionnelles. Notre approche prend quelques minutes entre le moment de la collecte de sang et les tests de migration des neutrophiles. Le nouveau peigne filtrant les globules rouges empêche les globules rouges de bloquer la migration active des neutrophiles et distingue cette méthode des autres méthodes microfluidiques.

Cela nécessite de retirer le sang avant que les tests de chimiothérapie n’effectuent. Le brouillage mécanique des globules rouges et des canaux se distingue par notre technologie et permet de tester les neutrophiles dans notre environnement physiologique du sang total, y compris le sérum et les plaquettes. La technologie est donc précise et facile à utiliser, et elle peut faire progresser considérablement notre compréhension du rôle des neutrophiles et du système immunitaire C inné dans la santé et la maladie.

Fabriquez la plaquette de moule maîtresse pour définir les canaux de migration selon les instructions du fabricant Premier modèle. La première couche de résine photosensible négative à base d’époxy de trois microns modèle ensuite la deuxième couche de 50 microns pour définir la charge cellulaire et les chambres de chimiokine. Maintenant, aux dispositifs de polyméthyle soane coulés, mélangez vigoureusement 20 grammes de PDMS avec deux grammes d’initiateur pendant cinq minutes.

Versez délicatement le PDMS sur la plaquette à motifs et dégazez dans un dessiccation sous vide pendant une heure. Ensuite, faites cuire et durcissez les dispositifs microfluidiques PDMS dans un four à 65 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Pour vous assurer que le PDMS est cuit à la bonne température, assurez-vous de surveiller la température interne du four avec un thermomètre.

Perforez les chambres centrales de charge du sang entier de 1,5 millimètre de diamètre. Perforez également des appareils entiers en forme de beignet de 5,0 millimètres de diamètre. Retirez les particules des appareils à beignets à l’aide de ruban adhésif.

Ensuite, rincez une plaque multipuits avec de l’eau désionisée et séchez-la à l’azote après avoir placé la plaque dans un four à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes. Traitement au plasma d’oxygène pendant 35 secondes. Ajoutez ensuite les appareils à beignets et le plasma d’oxygène.

Traitez à nouveau pendant 35 secondes supplémentaires. Transférez soigneusement les appareils dans les puits de la plaque et faites cuire avec des appareils collés sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après le traitement au plasma d’oxygène, l’appareil est hydrophile et les effets capillaires peuvent favoriser l’amorçage des petits canaux de l’appareil.

Pour la solution d’attractif de chimiothérapie, mélangez cinq microlitres de FMLP de 10 micromolaires avec cinq microlitres de fibronectine d’un milligramme par millilitre et 490 microlitres de HBSS. Pipetez lentement la solution d’attractif de chimiothérapie dans la pipette de la chambre de charge sanguine totale et 20 microlitres supplémentaires d’attractif de chimiothérapie autour de l’extérieur de l’appareil. Placez l’assiette dans un dessiccation pendant 15 minutes.

Appliquez un aspirateur sur l’appareil pour amorcer l’appareil avec une solution d’attractif de chimiothérapie. Retirez la plaque de la dessiccation et confirmez le mouillage du canal de l’appareil par diminution progressive de la taille de la bulle d’air. Ensuite, lavez soigneusement l’ensemble de la chambre de charge sanguine et l’extérieur de l’appareil pour éliminer l’excès de solution d’attractif de chimiothérapie.

Ensuite, pour générer un gradient d’attractif de chimiothérapie de chacune des chambres chimiotactiques focales vers le centre de l’appareil. Injectez doucement 100 microlitres de PBS dans le trou afin qu’une gouttelette de PBS se forme sur le dessus de l’appareil. Inclinez la plaque et pipetez un millilitre de PBS autour de l’appareil pour recueillir au fond du puits, aspirez le liquide et répétez le lavage PBS trois fois.

Ensuite, remplissez chaque puits de média pour immerger les appareils et attendez 15 minutes pour que le gradient se stabilise. Ensuite, pipetez lentement deux microlitres de sang total dans chaque chambre de charge de sang total. Pour le prélèvement de sang par piqûre au doigt, lavez-vous les mains à l’eau et au savon.

Séchez la peau à l’aide d’une solution anticoagulante. Ajoutez un millilitre de HSA à 0,2 % et 10 microlitres de crochets à 32,4 micromolaires. Fixez une tache sur un tube de prélèvement sanguin à l’héparine, piquez le doigt du donneur sain et essuyez la première goutte de sang.

Prélevez 50 microlitres de sang dans la solution de coloration anticoagulante et mélangez délicatement. Réglez la chambre biologique à 37 degrés Celsius, 80 % d’humidité et 5 % de CO2. Démarrez immédiatement l’imagerie en accéléré à un grossissement de 10 x ou plus pour une analyse statistique significative et suivez manuellement au moins 50 neutrophiles dans chaque échantillon.

Comptez les cellules entrant dans les chambres de chimiotaxie focale au fil du temps. Ensuite, à l’aide de l’image J, calculez les vitesses des neutrophiles dans le canal entre le WBLC et le FCC. Ensuite, pour quantifier la directionnalité des neutrophiles, comptez le nombre de cellules qui passent la bifurcation et calculez le rapport entre le nombre de cellules qui se tournent vers les chambres de chimiotaxie focales et les cellules qui sortent du dispositif.

Les cellules qui ne sont pas directionnelles ne suivent pas le gradient chimiotactique et migrent donc en nombre égal vers le FCC et le canal de sortie. Dans cette expérience, le test de chimiotaxie des neutrophiles du sang entier a été validé en mesurant l’accumulation de neutrophiles vers un gradient FMLP. Les résultats confirment que les globules rouges sont piégés par le peigne de filtration tandis que les neutrophiles sont capables de migrer activement hors du sang total.

Le gradient d’attractif de chimiothérapie linéaire stable formé par le dispositif microfluidique de sang entier a été confirmé à l’aide de dextran marqué à la FSE et les niveaux de fluorescence ont été mesurés au fil du temps. Les résultats obtenus à l’aide de la nouvelle plateforme de chimiotaxie WB révèlent que les neutrophiles de toutes les sources sanguines migrent à une vitesse constante et avec des cellules migratrices totales similaires. Il est important de noter que ce système permet de quantifier les neutrophiles, ce qui différencie la chimiotaxie de la chimiothérapie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 10 minutes si elle est correctement réalisée.

L’incorporation de notre appareil dans une plaque de 12 ou 24 puits en utilisant des techniques de salle blanche standard, des installations, le criblage de plusieurs conditions simultanément. Grâce à cette technique, nous sommes en mesure de mesurer la vitesse et la directionnalité des neutrophiles au niveau de la cellule unique. Contrairement aux méthodes traditionnelles qui mesurent la migration des cellules terminales en vrac, n’oubliez pas d’amorcer soigneusement le dispositif microfluidique et de charger lentement les deux échantillons afin que les globules rouges ne soient pas poussés au-delà de la com de l’appareil.

Le protocole décrit est particulièrement utile pour mesurer les déficiences chimiotactiques transitoires des neutrophiles, permettant des échantillonnages répétés sur plusieurs points temporels, mais pourrait également être adapté à la mesure de la migration d’autres types de cellules à partir de différents organismes modèles. Cette méthode peut donner un aperçu des altérations temporaires de la fonctionnalité des neutrophiles chez les patients atteints de diverses affections associées à une incidence plus élevée d’infections, y compris les patients traumatisés, les patients après une intervention chirurgicale majeure et les patients cancéreux recevant une chimiothérapie.