Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Cette technologie microfluidique vise à mesurer directement la fonctionnalité des neutrophiles humains à partir d'une seule goutte de sang sur une plateforme pouvant être multiplexée. La chambre de chargement centrale sert à la fois de source de sang total et d'accumulateur pour les gradients de chimioparticipants formés à partir des 16 chambres chimiotactiques focales. La filtration mécanique unique des globules rouges permet d'étudier la fonction des neutrophiles dans le contexte naturel du sang, avec ses composants cellulaires et biochimiques.

La bifurcation entre un canal menant à la chambre chimiotactique focale et un canal de sortie du dispositif permet la quantification et la modulation de la directionnalité des neutrophiles en migration. Ainsi, les résultats peuvent montrer comment les neutrophiles en migration active traversent facilement les globules rouges piégés et s'accumulent en nombre au fil du temps. Une caractéristique unique de nos dispositifs microfluidiques est qu'ils sont très faciles à fabriquer et à mettre en place.

Ils sont constitués d'une couche de PDMS moulée sur une tranche microfabriquée que nous fixons sur une plaque à fond en verre, simple ou multi-puits. Le principal avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite qu'une goutte de sang total. Les dispositifs peuvent être utilisés avec des pipettes standard, ne comportent aucune pièce mobile et ne requièrent ni tubulure ni pompe à seringue externe.

Les implications de cette technique s'étendent aux applications cliniques par rapport aux nôtres nécessaires avec les techniques traditionnelles. Notre approche prend quelques minutes seulement, du prélèvement sanguin jusqu'aux tests de migration des neutrophiles. Les peignes novateurs de filtration des globules rouges empêchent les hématies de bloquer la migration active des neutrophiles et distinguent clairement cette méthode des autres méthodes microfluidiques.

Cela nécessite d'éliminer le sang avant la réalisation des tests chimiques. Le blocage mécanique des globules rouges et des canaux distingue notre technologie et permet le test des neutrophiles dans leur environnement physiologique de sang total, incluant le sérum et les plaquettes. Cette technologie est donc précise et facile à utiliser, et elle peut faire progresser de manière significative notre compréhension du rôle des neutrophiles et du système immunitaire inné dans la santé et la maladie.

Concevez la plaquette du moule maître pour définir les canaux de migration conformément aux instructions du fabricant First Pattern. Appliquez d'abord une couche de résine photosensible négative époxy de trois microns, puis structurez la deuxième couche de 50 microns afin de définir les chambres de chargement des cellules et de chimioattractants. Pour fabriquer les dispositifs en polydiméthylsiloxane (PDMS), mélangez vigoureusement 20 grammes de PDMS avec deux grammes d'initiateur pendant cinq minutes.

Verser délicatement le PDMS sur la plaquette structurée et dégazer dans un dessiccateur sous vide pendant une heure. Ensuite, faire cuire et durcir les dispositifs microfluidiques en PDMS dans un four à 65 degrés Celsius pendant au moins trois heures. Pour s'assurer que le PDMS est cuit à la température correcte, surveiller la température interne du four à l'aide d'un thermomètre.

Prélèver les chambres centrales de chargement de sang total de 1,5 millimètre de diamètre. Prélever également des dispositifs entiers en forme de beignet de 5,0 millimètres de diamètre. Retirer les particules des dispositifs en forme de beignet à l’aide de ruban adhésif.

Ensuite, rincez une plaque multi-puits avec de l'eau déionisée et séchez-la à l'azote après avoir placé la plaque dans un four à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes. Traitez à l'aide d'un plasma d'oxygène pendant 35 secondes. Puis ajoutez les dispositifs en forme de beigne et appliquez le plasma d'oxygène.

Traiter à nouveau pendant 35 secondes supplémentaires. Transférer soigneusement les dispositifs dans les puits de la plaque et faire cuire avec les dispositifs assemblés sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après le traitement au plasma d'oxygène, le dispositif devient hydrophile et les effets capillaires peuvent favoriser l'amorçage des petits canaux du dispositif.

Pour la solution chimiotactique, mélangez cinq microlitres de FMLP à 10 micromolaire avec cinq microlitres de fibronectine à un milligramme par millilitre, et 490 microlitres de HBSS. Pipetez lentement la solution chimiotactique dans la pipette de la chambre de chargement de sang total, ainsi que 20 microlitres supplémentaires de la solution chimiotactique autour de l'extérieur du dispositif. Placez la plaque dans un dessiccateur pendant 15 minutes.

Appliquer un vide sur le dispositif afin de l'amorcer avec la solution de chimioprotéine. Retirer la plaque du dessiccateur et vérifier le mouillage du canal du dispositif par la diminution progressive de la taille de la bulle d'air. Ensuite, rincer soigneusement la chambre de chargement de sang total et l'extérieur du dispositif pour éliminer l'excès de solution de chimioprotéine.

Ensuite, pour générer un gradient de chémotactique à partir de chacune des chambres chimiotaqtiques focales vers le centre du dispositif. Injectez délicatement 100 microlitres de PBS dans le trou afin qu'une goutte de PBS se forme au-dessus du dispositif. Inclinez la plaque et pipetez un millilitre de PBS autour du dispositif pour recueillir le liquide au fond du puits, aspirez le liquide et répétez le lavage au PBS trois fois.

Ensuite, remplir chaque puits avec du milieu afin d'immerger les dispositifs et laisser 15 minutes pour que le gradient se stabilise. Puis, pipeter lentement deux microlitres de sang total dans chaque chambre de chargement de sang total. Pour la collecte de sang par piqûre du doigt, se laver les mains avec du savon et de l'eau.

Séchez la peau comme solution de coloration anticoagulante. Ajoutez un millilitre de HSA à 0,2 % et 10 microlitres d'anses à 32,4 micromolaire. Appliquez la coloration à un tube de prélèvement sanguin à l'héparine, piquez le doigt du donneur sain et essuyez la première goutte de sang.

Prélevez 50 microlitres de sang dans la solution colorante anticoagulante et mélangez délicatement. Réglez la chambre biologique à 37 degrés Celsius, 80 % d'humidité et 5 % de CO2. Démarrer immédiatement l'acquisition d'images en laps de temps avec un grossissement de 10 x ou supérieur afin d'effectuer une analyse statistique significative ; suivez manuellement au moins 50 neutrophiles dans chaque échantillon.

Compter les cellules entrant dans les chambres de chimiotaxie focale au fil du temps. Ensuite, à l’aide d’ImageJ, calculer les vitesses des neutrophiles dans le canal entre la WBLC et la FCC. Puis, pour quantifier la directionnalité des neutrophiles, dénombrer le nombre de cellules traversant la bifurcation et calculer le rapport entre le nombre de cellules qui tournent vers les chambres de chimiotaxie focale et celui des cellules qui quittent le dispositif.

Les cellules non directionnelles ne suivent pas le gradient chimiotactique et migrent donc en nombres égaux vers le canal FCC et le canal de sortie. Dans cette expérience, le test de chimiotaxie des neutrophiles dans le sang total a été validé en mesurant l'accumulation des neutrophiles en direction d'un gradient de FMLP. Les résultats confirment que les globules rouges sont retenus par le peigne de filtration tandis que les neutrophiles sont capables de migrer activement hors du sang total.

Le gradient linéaire stable de chimioprotéines formé par le dispositif microfluidique au sang total a été confirmé à l'aide de dextran marqué par FSE, et les niveaux de fluorescence ont été mesurés au fil du temps. Les résultats obtenus à l'aide de la nouvelle plateforme de chimiotaxie au sang total révèlent que les neutrophiles provenant de toutes les sources de sang migrent à une vitesse constante et avec un nombre similaire de cellules migratrices totales. Importamment, ce système permet la quantification des neutrophiles, permettant ainsi de distinguer la chimiotaxie de la chimokinèse. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 10 minutes si elle est effectuée correctement.

L'intégration de notre dispositif dans une plaque de 12 ou 24 puits à l'aide de techniques et d'équipements standard de salle blanche permet l'analyse simultanée de plusieurs conditions. Grâce à cette technique, nous sommes en mesure de mesurer la vitesse et la directionnalité des neutrophiles au niveau de la cellule unique. Contrairement aux méthodes traditionnelles qui mesurent la migration cellulaire globale en point final, pensez à amorcer soigneusement le dispositif microfluidique et à charger lentement les deux échantillons afin que les globules rouges ne soient pas repoussés au-delà du com du dispositif.

Le protocole décrit est particulièrement utile pour mesurer les déficiences chimiotactiques transitoires des neutrophiles, permettant des prélèvements répétés à plusieurs points temporels, mais pourrait également être adapté à la mesure de la migration d'autres types cellulaires provenant de différents organismes modèles. Cette méthode peut fournir des informations sur les modifications temporaires de la fonctionnalité des neutrophiles chez des patients présentant diverses affections associées à une incidence accrue d'infections, notamment les patients traumatisés, les patients après une chirurgie majeure et les patients atteints de cancer sous chimiothérapie.