Name: Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez un test de sensibilisation à l'AMPc cellulaire en une journée pour le criblage à haut débit de petites molécules et siRNA. Cette méthode utilise des cellules cryoconservées et la technologie HTRF pour identifier les voies moléculaires essentielles.

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Les auteurs tiennent à remercier M. Richard Zink et Todd Wiernicki pour la formation méthodologique et des conseils de dosage. Nous remercions également Jean-Paul Spence pour lecture attentive et suggestions d&#39;ordre rédactionnel. Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de la santé 060 397 MH, Fondation Brain and Behavior Research, et Eli Lilly and Company à travers le Programme de bourses de recherche Lilly (LRAP).

Une. Expansion et la cryoconservation de cellules test Prêt <ol><li> Culture des cellules CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) les cellules d&#39;une cellule plat 15 cm 2 de culture dans le milieu F12 de Ham additionné de 1,0 uM de L-glutamine, 800 pg / pl G418, 300 pg / hygromycine ul, 100 u / pl pénicilline, 100 pg / pl de la streptomycine, et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que les cellules sont confluentes à 90-95%. Laver les cellules avec 10 pi de tampon phosphate salin (PBS), et récolter les cellules par addition de 3 ul de tampon de dissociation de cellules pendant 5 min à 37 ° C. Remettre les cellules en utilisant 12 pi de milieu de culture et compter les cellules en utilisant l&#39;exclusion au bleu trypan. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 500 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ul de milieu de congélation (10% de diméthyl sulfoxyde, de 90% FBS). Diluer la suspension de cellules pour obtenir la concentration cellulaire désirée (par exemple de 1 à 20 x 10 6 cellules / ul). </li><li> Aliquote de 1,0 ul de solution de cellules de chaque tube cryogénique. Incuber les tubes cryogéniques dans un récipient de congélation de cellules à -80 ° C pendant une nuit. Transférer les tubes cryogéniques à un N 2 liquide réservoir pour le stockage à long terme. </li></ol> 2. Placage cellules Prêt dosage (et Option n º transfection) <ol><li> Décongeler rapidement un tube cryogénique congelé de cellules dans un bain-marie à 37 °. Une fois que les cellules sont décongelées, transférer les cellules dans un tube conique de 15 ul contenant 9 ul d&#39;Opti-MEM, et mélanger en inversant le tube 3 à 5 fois. </li><li> Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ul d&#39;Opti-MEM. </li><li> Compter les cellules en utilisant l&#39;exclusion au bleu trypan pour déterminer la viabilité cellulaire et de diluer les cellules viables comme nécessaire (par ex. 3 x 10 5 cellules / ul de concentration) dansOpti-MEM. Planche 10 pl / puits de cellules dans une culture de tissu traitée plaque à 384 puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> Faire des dilutions en série de l&#39;AMPc dans Opti-MEM pour générer une courbe standard pour estimer la production d&#39;AMPc par les cellules (selon recommandations du fabricant - voir la section 7). Ajouter 10 ul / puits de standards d&#39;AMPc à la plaque. Remarque: une courbe standard unique peut être préparé sur une plaque séparée ou puits vides sur l&#39;une des plaques de dosage. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 1 heure. </li></ol> 3. Inverser siRNA Option de transfection * Cette section est facultative et pertinente à la figure 3. <ol><li> Préparer une solution de siRNA dans RNase ddH 2 O (par exemple 0,4 pmol / ul). Ajouter 5 ul à des puits individuels de plaque de 384 puits, et centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante. </li><li> Diluer Lipofectamine 2000 à Opti-MEM par un facteur de 0,006 (par exemple, ajouter 6 pi de Lipofectamine 2000 à 1000 pi d&#39;Opti-MEM), et mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Incuber la solution Lipofectamine 2000/Opti-MEM pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 5 ul de la solution diluée Lipofectamine 2000/Opti-MEM à des puits individuels de plaques à 384 puits contenant déjà des siRNA. Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante. </li><li> Incuber la plaque pendant 30 min à température ambiante. </li><li> cellules prêtes d&#39;essai de plaque comme décrit ci-dessus (Section 2). Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante. </li><li> Retour plaque d&#39;essai à incubateur humidifié à 37 ° C (5% de CO 2) pour 48-96 h déterminée pour le gène ciblé abattre (voir la discussion). </li></ol> 4. Petit criblage de molécules <ol><li> Diluer le médicament d&#39;intérêt (inhibiteurs par exemple. Petites molécules) dans OptiMEM-6x les concentrations finales désirées. Des dilutions en série peuvent être effectuées à l&#39;aide de pipettes à main ou une station de traitement des liquides. </li><li> Ajouter 2,5 pl / puits de composé d&#39;essai ou du tampon contenant un véhicule (par exemple DMSO) à côté des puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à température ambiante (incubation est facultative). </li></ol> 5. Traitement agoniste persistante <ol><li> Préparer un 600 nM (c.. 6 fois la concentration finale souhaitée de 100 nM) solution de quinpirole dans Opti-MEM. </li><li> Ajouter 2,5 pl / puits de la solution de quinpirole 600 nM sur le côté du puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 sec à la température ambiante, et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 2 heures. </li></ol> 6. La stimulation de l&#39;accumulation d&#39;AMPc <ol><li> Au cours de l&#39;incubation de 2 h, préparer les stimulatisur la solution dans Opti-MEM. La solution de stimulation se compose de 40 uM de forskoline, 2 uM de 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), et 4 uM spiperone (toutes les concentrations de l&#39;étape 6 sont 4x la concentration finale souhaitée). </li><li> Ajouter 5 ul / puits de la solution de stimulation sur le côté du puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 secondes à la température ambiante, et incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li></ol> 7. Trempe et estimation de l&#39;accumulation d&#39;AMPc <ol><li> La production d&#39;AMPc par les cellules est mesurée en utilisant la trousse cAMP dynamique 2 selon les instructions du fabricant. Brièvement, reconstituer anti-AMPc-cryptate et AMPc-d2 dans de l&#39;eau distillée. Congeler aliquotes à -20 ° C pour le stockage à court terme. </li><li> Diluer une partie aliquote d&#39;anticorps anti-AMPc-cryptate et une partie aliquote de l&#39;AMPc-D2 séparément dans le tampon de lyse, selon les instructions du fabricant pour rendre les solutions de travail. </li><li> Ajj 10 pl / puits de la solution de travail anti-AMPc-cryptate et 10 pl / puits de la solution de travail cAMP-d2 à la plaque à 384 puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> Centrifuger la plaque à 100 g pendant 15 secondes à la température ambiante, et incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Lire la plaque dans un lecteur de plaque à fluorescence (réglage de l&#39;échelle automatique de la sensibilité) en utilisant une excitation de 337 nm, et de mesurer les émissions à 620 nm et 665 nm par instructions du fabricant. </li><li> Appliquer l&#39;analyse de quotient pour évaluer l&#39;AMPc courbe standard par les instructions du fabricant. En utilisant les valeurs obtenues, extrapoler l&#39;accumulation d&#39;AMPc estimé dans les puits de test en utilisant un logiciel d&#39;analyse de données. </li></ol>

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<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans un effort pour faciliter les études de sensibilisation hétérologue, nous avons largement modifié notre méthode précédente réalisation d&#39;un rationalisé &quot;mélange et de lire&quot; format qui est modifiable à criblage à haut débit et le mécanisme de l&#39;examen de l&#39;action. Les principales modifications apportées à notre protocole peuvent être résumées comme suit: 1) l&#39;utilisation de cellules congelées comme réactifs &quot;de dosage prêt&quot;; 2) la miniaturisation de l&#39;analyse au format 384 puit...

Un adénylylcyclase adaptatif (AC) de signalisation de réponse connu comme hétérologue-ou super-sensibilisation a été découvert dans le laboratoire du Prix Nobel, le Dr Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg a proposé que la réactivité accrue de CA observé suite à l&#39;activation chronique des récepteurs opioïdes δ était un mécanisme impliqué dans la tolérance aux opiacés et la dépendance 1. En plus de l&#39;activation chronique des récepteurs opioïdes δ, cette réponse neuroadaptatif de signalisation AC se produit également après l&#39;activation persistante de plusieurs autres Gai / o-récepteurs couplés 2. Notamment, beaucoup de ces récepteurs sont associés à la douleur, les troubles neuropsychiatriques et neurologiques, et comprennent μ / κ des opioïdes, D 2/4 de la dopamine, 5HT 1A, et M 2/4 2 récepteurs muscariniques. En plus des découvertes du Dr Nirenberg, un grand nombre de preuves existe reliant sensibilisation de signalisation AC à l&#39;activation du récepteur opioïde chronique à la fois <em&gt; in vitro et in vivo 3-7. Sensibilisation des AC a également été associée à une variété de maladies impliquant les récepteurs dopaminergiques D 2 et telles que la schizophrénie y compris la maladie de Parkinson (pour une revue voir référence 2). Malgré l&#39;importance potentielle de la sensibilisation, le mécanisme (s) précis associé avec / activation persistante Gai o-récepteur couplé qui conduit à une réactivité accrue AC reste en grande partie inconnue. Ces études fournissent la justification de l&#39;examen des mécanismes de sensibilisation de l&#39;adénylyl cyclase comme une cible neurobiologique importante. De même, la pertinence physiologique de signalisation AC 8 et l&#39;importance que les isoformes de CA individuels détiennent dans cette réponse adaptative devraient aussi être reconnus 2,9,10. Dans le cadre de notre recherche, les caractéristiques générales associées à la sensibilisation hétérologue des isoformes recombinantes de AC parallèle les caractéristiques described pour étudier les isoformes endogènes de l&#39;AC. Plus précisément, des recherches antérieures ont montré que l&#39;activation de Gai / o protéines et les sous-unités de la suite de presse / réarrangement sont des conditions importantes pour récepteur induite par la sensibilisation de toutes les isoformes AC. En outre, plusieurs études suggèrent que la signalisation de protéines kinases et des sous-unités Gßy sont impliqués dans la sensibilisation 2,11-13. CA individuels présentent également des motifs uniques et distincts de sensibilisation 12. Par exemple, l&#39;exposition persistante des récepteurs D 2 agonistes est associée à une sensibilisation de AC1 et AC8 de Ca2 + stimulation / calmoduline 14,15, tandis que l&#39;AC3 étroitement liée n&#39;est pas sensibilisé 2. AC2, AC4, et AC7 sont étroitement liés, cependant, que l&#39;activité de la PKC-AC2 stimulée est robuste sensibilisés après une exposition prolongée de D 2 récepteurs agonistes 7,14,16,17. En outre, AC5 et AC6 montrent un degré marqué de hetersensibilisation ologous à gaz et stimulée par la forskoline accumulation d&#39;AMPc suite à l&#39;activation de récepteurs D 2 14,18-20, mais semblent différer dans leur exigence de la sous-unité Gßy AC interactions 21. Bien que la plupart des études de sensibilisation AC ont utilisé des lignées de cellules modèles (par exemple des cellules HEK293 exprimant les isoformes individuelles AC), il apparaît que ces résultats traduisent par des modèles de cellules neuronales natives 4,22. Plus récemment, les effets des inhibiteurs sélectifs des isoformes de petites molécules identifiées AC dans les cellules HEK293 exprimant isoformes AC peuvent également être convertis en études comportementales in vivo 23. L&#39;absence d&#39;un mécanisme moléculaire identifié pour la sensibilisation hétérologue reflète probablement la complexité de la réponse adaptative aussi bien que les propriétés uniques de la régulation individuelle des isoformes AC 12. Démêler une telle complexité est encore compliquée par l&#39;utilisation de la méthodologie lourde tchapeau a limité chercheurs universitaires d&#39;employer des approches impartiales. Par exemple, nos études mécanistiques précédentes impliquaient l&#39;utilisation de modèles cellulaires cultivées en continu en utilisant 24 - et 48-bien le format de culture tissulaire 15. Les cellules cultivées ont été généralement cultivées pendant 48 h et ensuite soumis à un traitement médicamenteux agoniste (2-18 h), suivie par une série de lavages et d&#39;incubations de cellules (figure 1). Protocoles d&#39;accumulation d&#39;AMPc spécifique AC-isoformes ont ensuite été utilisée suivie par la mesure de l&#39;accumulation d&#39;AMPc en utilisant une laborieuse et longue [3 H] AMPc méthodologie 15,24 liaison. La durée de bout en bout pour chaque dosage généralement nécessaire d&#39;un total de quatre à cinq jours à partir de la cellule de placage à l&#39;analyse de données (figure 1). L&#39;application de nouvelles technologies et l&#39;automatisation a conduit à des améliorations marquées pour les études de sensibilisation dans le milieu industriel et centre de HTS. Par exemple, un groupe de travail avec le Centre national pour Chemical génomique a rapporté deux jours une HTS procédure de dosage pour identifier des inhibiteurs de petites molécules de récepteur opioïde μ sensibilisation induite en format 1536 puits 25. Le présent article décrit nos efforts pour développer un test HTS pour les études de sensibilisation hétérologue utilisant des technologies qui sont disponibles à la plupart des institutions de recherche universitaires. Cette stratégie a été accompli en incorporant l&#39;utilisation de cellules congelées à partir des modèles de cellules exprimant de manière hétérologue au récepteur de la dopamine D 2, en combinaison avec les isoformes de l&#39;adénylyl cyclase ou de recombinaison endogènes individuels (CHO-D 2L ou HEK-AC6 / D 2 L). Pour améliorer notre rendement, nous avons repensé notre test de sensibilisation de 48 puits (environ&gt; 20 étapes sur 4-5 jours) pour un cinq-étape, le dosage de jour en format 384 puits qui était essentiellement &quot;mélanger et lire&quot;. Le nouveau format utilise un temps homogène fluorescence disponible dans le commerce résolu (HTRF) d&#39;essai pour mesurer l&#39;AMPc accumulation dans des cellules intactes avec un lecteur multi-plaque de mode. Le dosage est robuste et se prêtent à criblage de petites molécules, et peut être efficacement appliqué pour cribler des inhibiteurs de la sensibilisation hétérologue. En outre, nous fournissons des données qui permet l&#39;utilisation de ce test avec la transfection inverse de siRNA pour une large criblage d&#39;une banque de siRNA ciblés ou de génomes avec seulement une modification mineure à l&#39;approche générale.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1-DRD2L cellules</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12 media</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine</td><td>Fisher</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de 15 cm</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de dissociation cellulaire</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate Saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Fisher</td><td>976171</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TC Plaques à 384 puits</td><td>traitées Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEB</td><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td></tr><tr><td>Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn ;)Quinpirole</td><td>Sigma</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>Spiperone</td><td>Sigma</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>Clozapine</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Haloperidol</td><td>Sigma</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-)Sulpiride</td><td>Sigma</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 réactif de transfection</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Eau, DNase et RNase MP</td><td>Biomedicals</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Gas siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>siRNA personnalisé SiRNA</td><td></td></tr><tr><td>non ciblé</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siarn préalable applications

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensibilisation de l&#39;adénylcyclase de signalisation (AC) a été impliqué dans une variété de troubles neuropsychiatriques et neurologiques y compris la toxicomanie et la maladie de Parkinson. Activation aiguë de Gai / o-récepteurs liés inhibe l&#39;activité AC, alors que l&#39;activation persistante de ces récepteurs résulte en une sensibilisation hétérologue de l&#39;AC et l&#39;augmentation des niveaux d&#39;AMPc intracellulaire. Des études antérieures ont démontré que cette amélioration de la réactivité AC est observée à la fois in vitro et in vivo suite à l&#39;activation chronique de plusieurs types de récepteurs Gai / o-lié, y compris la dopamine D 2 et les récepteurs opioïdes μ. Bien que la sensibilisation hétérologue de l&#39;AC a été signalée il ya quatre décennies, le mécanisme (s) qui sous-tendent ce phénomène restent encore largement méconnus. Le manque de données mécanistiques reflète sans doute la complexité de cette réponse adaptative, ce qui suggère que les approches non biaisée pourraient aider à identifierment les voies moléculaires impliquées dans la sensibilisation de l&#39;AC hétérologue. Des études antérieures ont mis en cause kinase et la signalisation Gbγ comme chevauchant composants qui régulent la sensibilisation hétérologue de l&#39;AC. Pour identifier les cibles se chevauchent uniques et supplémentaires liées à la sensibilisation de l&#39;AC, le développement et la validation d&#39;un dosage de l&#39;AMPc de sensibilisation évolutive est nécessaire pour augmenter le débit. Les approches précédentes pour étudier la sensibilisation sont généralement lourdes impliquant continu entretien de culture cellulaire ainsi que d&#39;une méthodologie complexe pour mesurer l&#39;accumulation d&#39;AMPc qui implique plusieurs étapes de lavage. Ainsi, le développement d&#39;un dosage à base de cellules robuste qui peut être utilisé pour le criblage à haut débit (HTS) dans un format de 384 puits facilitera les études futures. L&#39;utilisation de deux modèles cellulaires D 2 de récepteurs de la dopamine (par exemple. CHO-D 2L et HEK-AC6 / D 2L) nous avons converti notre test de sensibilisation de 48 puits (&gt; 20 étapes 4-5 jours) pour un cinq-step, dosage de jour en format de 384 puits. Ce nouveau format se prête à criblage de petites molécules, et nous démontrer que cette conception de l&#39;essai peut également être facilement utilisé pour la transfection inverse de siRNA en prévision de criblage d&#39;une banque de siRNA ciblés.

Partie I. Le développement d&#39;un test de sensibilisation bien hétérologue 384 pour identifier des inhibiteurs de petites molécules en utilisant un modèle de cellule disponible dans le commerce. Pour étudier la sensibilisation hétérologue dans un modèle cellulaire, nous avons fait un certain nombre d&#39;améliorations qui nous ont permis de rationaliser le test dans un format «mélanger et lire&quot;. Plusieurs modifications principales sont exposées ci-dessous, et sont déc...

Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l&#39;adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d&#39;un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.

Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

L'objectif général de cette procédure est de développer un test de sensibilisation cellulaire unique basé sur l'AMP cyclique, réalisable en une seule journée, pour des applications de criblage à haut débit, notamment le criblage de bibliothèques chimiques. Cette approche est réalisée en commençant par décongeler et ensemencer des cellules cryopréservées déjà préparées et prêtes à être utilisées dans le test. La deuxième étape consiste à ajouter aux cellules des composés test ou des antagonistes, suivie de l'ajout du médicament sensibilisant l'adényl cyclase.Ensuite, un activateur de l'adénylyl cyclase est ajouté en présence d'un inhibiteur de la phosphodiestérase afin de stimuler l'accumulation de l'AMP cyclique. La dernière étape consiste à arrêter la réaction à l'aide d'un système de détection homogène de fluorescence résolue dans le temps, ou HTRF, pour l'AMP cyclique, des réactifs dans un tampon de lyse, puis à mesurer la fluorescence. En définitive, l'utilisation de cellules cryopréservées et de la technologie HTRF pour l'AMP cyclique permet la réalisation d'un test de sensibilisation en une seule journée pour le criblage de petites molécules.L'idée de cette approche nous est d'abord venue lorsque nous avons souhaité utiliser le criblage à haut débit pour étudier la sensibilisation hétérologue médiée par récepteur d'une adénylcyclase dentaire. Deux techniques clés sont utilisées ici : les cellules cryopréservées comme réactifs prêts à l'emploi et le test homogène en temps résolu. Pour les kits de dosage destinés à la mesure du cycle KMP, les méthodologies de base décrites ici peuvent aider à répondre à des questions essentielles en signalisation cellulaire et en découverte de médicaments à l'aide de tests cellulaires. Pour commencer, cultivez les cellules CHO-D2L dans une boîte de culture cellulaire de 15 centimètres comme décrit dans le protocole écrit, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans une enceinte humide contenant 5 % de CO2 jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 90 à 95 %, puis lavez les cellules avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), récoltez-les avec 3 millilitres de tampon de dissociation cellulaire après une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius.Après avoir resuspendu les cellules en utilisant 12 millilitres de milieu de culture, dénombrer les cellules par exclusion au bleu de trypan. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Puis, aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu de congélation. Après avoir dilué la suspension cellulaire afin d’obtenir la concentration cellulaire souhaitée, aliquoter un millilitre de solution cellulaire dans chaque fiole de cryoconservation. Incuber les fioles de cryoconservation dans un conteneur de congélation cellulaire à −80 °C pendant la nuit.Le jour suivant, transférez les cryotubes dans un réservoir d'azote liquide pour une conservation à long terme. Pour préparer des cellules prêtes à être utilisées dans un test, décongelez rapidement un cryotube de cellules congelé dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius. Une fois les cellules décongelées, transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres contenant neuf millilitres d'OptiMEM, puis mélangez en retournant le tube trois à cinq fois. Après centrifugation des cellules à 500 ×g pendant cinq minutes, aspirez le surnageant à température ambiante et resuspendez les cellules dans un millilitre d'OptiMEM.Compter les cellules en utilisant l'exclusion au bleu de trypan pour déterminer la viabilité cellulaire avant de diluer les cellules viables selon les besoins. Et placer optimalement 10 microlitres de cellules par puits dans une plaque de culture de tissus traitée de 384 puits, à l’aide d’une pipette multicanal.Effectuez des dilutions sérielles de l'AMP cyclique et de l'optimum afin de générer une courbe standard pour estimer la production d'AMP cyclique par les cellules. Ajoutez 10 microlitres par puits des étalons d'AMP cyclique dans la plaque. Centrifugez la plaque à 100 ×g pendant 15 secondes à température ambiante, puis incubez-la à 37 degrés Celsius dans une enceinte humide avec 5 % de CO2 pendant une heure.Pour un criblage de petites molécules, diluez d'abord le médicament d'intérêt dans un milieu jusqu'à six fois la concentration finale souhaitée. La dilution en série peut être réalisée à l'aide de pipettes manuelles ou d'une station de manipulation des liquides. Ajoutez 2,5 microlitres par puits du composé testé ou du véhicule contenant le tampon.Appliquer la solution sur le côté des puits à l’aide d’une pipette multipuits, puis centrifuger la plaque à 100 ×g pendant 15 secondes. Pour un traitement agoniste prolongé à température ambiante, préparer une solution de 600 nanomolaire de Quin parol et d’optimum, puis ajouter 2,5 microlitres par puits de la solution de Quin parol 600 nanomolaire sur le côté des puits. À l’aide d’une pipette multipuits, centrifuger à nouveau la plaque avant de l’incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2 pendant deux heures.Pendant l'incubation de deux heures, préparez la solution de stimulation dans l'optimum comme décrit dans le protocole écrit. Ajoutez cinq microlitres par puits de la solution de stimulation sur le côté des puits à l’aide d’une pipette multicanal après avoir centrifugé la plaque comme précédemment, puis incubé à température ambiante pendant une heure. La production d’AMP cyclique par les cellules est mesurée à l’aide du kit dynamique AMPc deux selon les instructions du fabricant : reconstituez brièvement l’anti-AMPc crypt et l’AMPcD deux dans de l’eau distillée, diluez un aliquot d’anti-AMPc crypt et un aliquot d’AMPcD deux séparément dans le tampon de lyse, selon les instructions du fabricant, afin d’obtenir des solutions de travail. Pour arrêter l’accumulation d’AMPc dans la plaque de 384 puits, ajoutez 10 microlitres par puits de la solution de travail d’anti-AMPc crypt huit et 10 microlitres par puits de la solution de travail d’AMPcD deux.À l’aide d’une pipette multicanal, centrifuger à nouveau la plaque à 100 ×g pendant 15 secondes à température ambiante, puis incuber à température ambiante pendant une heure. Lire les plaques sur un lecteur de plaques à fluorescence en utilisant une excitation de 337 nanomètres et mesurer les émissions à 620 nanomètres et 665 nanomètres conformément aux instructions du fabricant. Appliquer une analyse ratiométrique pour évaluer la courbe standard de l’AMP cyclique conformément aux instructions du fabricant. À partir des valeurs obtenues, extrapoler l’accumulation estimée d’AMP cyclique dans les puits d’essai à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.Des cellules CHO D deux L cryoconservées ont été ensemencées directement dans des plaques d'essai à 384 puits afin de démontrer que des essais de sensibilisation peuvent être réalisés selon un format à 384 puits, réduisant ainsi le nombre d'étapes de plus de 20 à 5. Les études ont révélé qu'un prétraitement de deux heures avec la Quin Perol renforçait de manière dépendante de la dose l'accumulation subséquente de quatre cycles d'AMP stimulés, en accord avec une sensibilisation hétérologue. La deuxième série d'expériences a exploré si ce nouvel essai simplifié pouvait être utilisé pour évaluer des inhibiteurs de la sensibilisation.Les résultats initiaux ont révélé que le traitement préalable par l'haldopéridol ou la péroné, des antagonistes prototypiques du récepteur D2, empêchait complètement la sensibilisation induite par la quinpirole de l'accumulation cyclique de l'AMP stimulée par le récepteur. Cette méthode a ensuite été utilisée pour évaluer l'activité d'une série d'antagonistes du récepteur D2 afin de déterminer si ces composés inhibent la sensibilisation de manière similaire aux résultats précédents. Ces études ont démontré que les antagonistes du récepteur D2 inhibaient la sensibilisation induite par l'agoniste de façon dépendante de la dose.L'objectif suivant était de développer un test de sensibilisation en plaque de 384 puits pouvant être utilisé pour réaliser un criblage à grande échelle de bibliothèques d'ARNi par transfection inverse, comme décrit dans le protocole textuel. Les résultats ont révélé que l'exposition des cellules à l'agoniste Quin parole pendant deux heures entraînait une amélioration marquée de l'accumulation de l'AMPc induite par la quatre-épines. L'accumulation accrue d'AMPc, à la fois à 100 nanomolaire et à 300 nanomolaire de quatre-épines, était supérieure à 15 fois celle observée dans les cellules traitées au véhicule. La transfection inverse de l'ARNi GSS dans des cellules exprimant le récepteur D deux bloque la sensibilisation induite par l'agoniste de l'adényl cyclase.Lorsque l'agoniste du récepteur D2, la quinpérol, a été ajoutée de manière cyclique, une accumulation de MP a été stimulée et mesurée à l'aide de H-T-R-F-A ; la réponse de sensibilisation a été réduite de 94 %. Une fois maîtrisé, tout ce dosage peut être réalisé en moins de huit heures s'il est effectué correctement en suivant cette procédure. D'autres molécules de signalisation, comme l'IP1 et le Phospho ERK, peuvent également être mesurées afin d'examiner des voies de signalisation réceptrice supplémentaires.

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