Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

L’objectif global de cette procédure est la génération simultanée de cultures de cellules précurseurs neurales sous forme de monocouches adhérentes ou de neurosphères à partir de la zone sous-ventriculaire et du gyrus denté de souris adultes individuelles. Ceci est accompli en retirant d’abord le cerveau de souris adultes individuelles. La deuxième étape consiste à microdisquer la zone sous-ventriculaire et les régions du gyrus denté.

Ensuite, le tissu est dissocié en une suspension unicellulaire. La dernière étape consiste à cultiver les cellules précurseurs sous forme de monocouches adhérentes ou de neurosphères. En fin de compte, le test de la sphère neurologique et le système de culture monocouche adhérent sont des outils précieux pour déterminer le potentiel de prolifération ou de différenciation dans les cellules souches neurales adultes.

In vitro, cette méthode nous permet d’aborder quelques questions très intéressantes dans le domaine de la neurogenèse adulte. Grâce à lui, nous pouvons examiner des cellules d’animaux individuels et les comparer, ce qui est intéressant dans le contexte de l’examen des différences individuelles, ou, par exemple, des différences entre les masques transgéniques ou knock-out individuels par rapport à leurs témoins. Tara Walker, une scientifique senior de mon groupe, présenterait cette méthode avant la dissection cérébrale.

Préparez les pipettes polies au feu avec des verrats moyens et petits en tournant les pipettes de pâturage en verre dans une flamme jusqu’à ce que les bords s’arrondissent. Ensuite, stérilisez-les dans un autoclave. Tout d’abord, transférez le cerveau dans une boîte de Pétri en plastique de 10 centimètres contenant du PBS.

Placez une boîte de Pétri avec le cerveau sous un microscope à dissection à faible grossissement avec le cerveau positionné sur sa surface ventrale. Par la suite, à l’aide de la pince fine incurvée, vous pouvez retirer les bulbes olfactifs tout en tenant le cervelet. Ensuite, faites pivoter le cerveau sur la face dorsale.

Faites une coupe coronale à travers le cerveau au niveau du chiasma optique avec un scalpel pour microdisecter la SVZ. Placez la partie rostrale du cerveau contre la boîte de sorte que la surface coronale coupée soit tournée vers le haut. Sous un grossissement plus élevé, retirez et jetez le septum.

Ensuite, disséquez la SVZ, qui est une fine couche de tissu entourant le ventricule en plaçant l’extrémité d’une lame de la fine pince incurvée dans le coin latéral du ventricule latéral. Immédiatement sous le corps calleux et l’autre lame, environ un millimètre dans le tissu immédiatement adjacent au ventricule. Appuyez sur la pince vers la base du plat et vers la face ventrale du ventricule pour retirer un petit morceau de tissu triangulaire.

Après cela, placez la SVZ disséquée dans une boîte de Pétri sur de la glace pour microdisséquer le DEG place, la partie dorlotée du cerveau dans la boîte de Pétri et coupez le long de la fissure longitudinale à l’aide d’un scalpel sous un microscope de dissection. Retirez le cervelet et le colorant céphalon. Refocalisez le microscope de manière à ce que les bords autour de la DG soient maintenant visibles.

Pour retirer le dg, insérez la pointe d’une aiguille de calibre 27 et faites-la glisser le long de la bordure entre le DG et la corne d’amen. Libérez ensuite le DG du tissu environnant à l’aide de la pince fine Pour la dissociation du tissu SVZ. Émincez le tissu à l’aide d’une lame de scalpel pendant une minute jusqu’à ce qu’il n’en reste plus de gros morceaux.

Puis réanimation. Suspendez le tissu haché avec un millilitre de Prewarm 0,05 % de trips dans de l’EDTA. Ensuite, transférez-le dans un tube de 15 millilitres et incubez pendant sept minutes dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius.

Pour arrêter la réaction enzymatique, ajoutez un millilitre d’inhibiteur de trypsine contenant de l’ADN de cygne et mélangez le contenu en agitant le tube. Ensuite, granulez la suspension par centrifugation à 300 Gs pendant cinq minutes et une cicatrice. Le sennett après cela remet en suspension les granulés dans un millilitre de milieu de croissance et associé par gly.

Pipetage de haut en bas environ sept à dix fois à l’aide d’une pipette P 1000. Ajoutez ensuite le milieu de croissance à un volume total de cinq millilitres et passez la suspension cellulaire à travers un tamis de 40 micromètres pour éliminer les débris et les amas de tissus non associés. Ensuite, centrifugez-le à 300 G pendant cinq minutes.

Jetez le supinate et le reus. Suspendre la pastille obtenue dans 200 microlitres de milieu de croissance pour la dissociation tissulaire DG. Émincez le tissu à l’aide d’une lame de scalpel pendant environ une minute jusqu’à ce qu’il n’en reste plus de gros morceaux.

Ensuite, transférez le tissu haché dans le mélange d’enzymes PDD préchauffé. Incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et mélanger en inversant le tube toutes les trois à cinq minutes. Ensuite, dissociez mécaniquement le tissu en le pipetant doucement de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette de pâturage polie au feu de calibre moyen, puis incubez pendant 10 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius et mélangez-le en agitant le tube toutes les trois à cinq minutes. Plus loin.

Dissociez mécaniquement le tissu en le pipetant doucement de haut en bas 10 fois à l’aide d’une petite pipette de pâturage polie au feu de sanglier. Ensuite, centrifugez-le à 130 g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le supinate et remettez le granulé en suspension dans un millilitre de solution tampon.

Préparer jusqu’à 10 millilitres avec une solution tampon. Après centrifugation à 130 GS pendant cinq minutes. Retirez le surnageant S et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de 20 % par appel.

Ensuite, centrifugez-le à 450 GS pendant 15 minutes. Retirez le snat et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de tampon. Enfin, centrifugez à 130 GS pendant cinq minutes et remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de milieu de croissance pour les cultures adhérentes plaque de 200 microlitres de cellules dans chaque puits unique d’une plaque PDL Lamin ENC 96 puits pour les cultures de sphe diluez-la avec la croissance, moyenne à 20 millilitres et plaque 200 microlitres par puits sur une plaque non revêtue de 96 puits, puis incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 après six à 12 jours compter et mesurer le diamètre des neurosphères à l’aide d’un grade IP monté sur un microscope à lumière droite.

Cette figure montre que les cellules précurseurs de souris adultes peuvent être cultivées sous forme de cultures monocouches adhérentes ou de neurosphères dans la SVZ et la dg. On observe qu’un nombre significativement plus élevé de neurosphères sont générées à partir de la SVZ par rapport à la DG de souris individuelles, et la SVZ et les cellules précurseurs de la DG répondent également différemment à la dépolarisation in vitro pour confirmer la potentialisation à long terme. Il est démontré que les neurosphères se sont étendues sur 10 passages.

Les neurosphères peuvent être différenciées en bêta trois neurones positifs à la tubuline comme indiqué en rouge, les astrocytes GFAP positifs en vert, O quatre oligodendrocytes positifs en rouge et la cartographie de deux neurones AB positifs en rouge Suite à cette procédure. D’autres méthodes telles que l’empaquetage des cellules ou des neurosphères sur plusieurs générations ou la différenciation des neurosphères suivie d’une analyse histologique peuvent être réalisées. Cela aidera à répondre à d’autres questions telles que la multipotentialité et le potentiel à long terme.